Caracterização da resposta imune citocínica na infecção humana pelo vírus oropouche e sua relação com o padrão de soroconversão e a presença de sintomas

A tese aqui apresentada trata-se do primeiro estudo em nível mundial que pesquisa e caracteriza a resposta imune citocínica em infecções humanas pelo Orthobunyavirus Oropuche. Como metodologia para o alcance dos objetivos aqui apresentados foi utilizado um total de 320 amostras de soros humanos, onde 60 destas foram provenientes de Banco de Sangue (Controle negativo) e 260 foram obtidas mediante dois surtos do Vírus Oropouche nos Estados do Pará e Amapá (Brasil), sendo estas últimas divididas em oito subgrupos para obtenção dos dados com exatidão. Nas amostras coletadas foram realizadas análises dos dados clínicos/sintomatologia através dos prontuários, dados sorológicos através da titulação de anticorpos por Inibição da Hemaglutinação (IgM/IgG) e detecção do nível de citocinas plasmáticas por citometria de fluxo a qual permitiu a descrição técnica da dosagem de citocinas possibilitando ainda a análise de frequência de baixos e altos produtores de citocina. Os dados obtidos permitiram observar as variáveis e o comportamento das assinaturas de citocinas expressas pelos pacientes mediante a confirmação sorológica do vírus, bem como o comportamento destes analitos séricos quando da presença de sintomas específicos como febre, calafrios, cefaléia e tontura, permitindo assim que se chegasse à conclusão que a) existe um padrão na síntese de citocinas pró-inflamatórias e reguladoras; b) observa-se um balanço no perfil da resposta imune entre citocinas pró-inflamatórias (Th1) e moduladoras (Th17); c) a infecção pelo Vírus Oropouche altera a produção das citocinas nos indivíduos; d) os resultados mostram também que ao comparar os indivíduos Não respondedores com os Respondedores precoces, houve aumento da IL-1β e diminuição da IL-12; Não respondedores com Respondedores tardios, houve diminuição da IL-8, e aumento da IFN-α, IL-23 e IL-17; Não respondedores comparados com Respondedores precoces ocorreram o aumento de IL-4 e IFN-; Já quando comparado Respondedores precoces e respondedores tardios houve diminuição de IFN-α e IL-6; Respondedores precoces de forma geral apresentaram diminuição da IL-10 e Respondedores tardios apresentaram aumento da IL-5; e) Os resultados mostram ainda a expressão de IL-5 em pacientes que manifestaram os sintomas específicos para a infecção pelo Oropouche (febre, calafrios, cefaléia e tontura), sugerindo este sinal estar associado diretamente à patogênese do vírus; f) há a necessidade da complementação desta pesquisa com mais estudos como àqueles relacionados com a expressão de quimiocinas.

Atividade leishmanicida do extrato da raiz de Physalis angulata e sua ação na célula hospedeira

A Leishmaniose é uma doença infecciosa causada por várias espécies de parasitas do gênero Leishmania. A quimioterapia é o único tratamento efetivo para a doença, mas essas drogas são, em geral, tóxicas e requer um longo período de tratamento. Produtos naturais provenientes de plantas oferecem novas perspectivas e representam uma importante fonte de novos agentes leishmanicidas. Assim, é de grande importância avaliar os efeitos do extrato aquoso da raiz de Physalis angulata, planta amplamente utilizada pela medicina popular, em formas promastigotas e amastigotas de Leishmania (Leishmania) amazonensis e sua ação sobre a célula hospedeira. As fisalinas D, E, F e G foram demonstradas pela primeira vez na raiz de P. angulata pela análise cromatográfica. Uma atividade antiproliferativa e uma inibição dose dependente de promastigotas 74,1% e 99,8 % (IC50 35,5 μg/mL) e amastigotas 70,6% e 70,9% (IC50 32.0 μg/mL) foram observadas quando os parasitas foram tratados com 50 e 100 μg/mL do extrato, respectivamente. A análise da atividade microbicida da célula hospedeira infectada com L. amazonensis mostrou que extrato foi capaz de reverter o efeito causado pelo parasito de inibir a produção de espécies reativas de oxigênio. O tratamento com o extrato também induziu alterações morfológicas importantes em formas promastigotas avaliadas por microscopia óptica, microscopia eletrônica de transmissão e varredura. Foram observadas alterações na morfologia, na divisão celular, principalmente na fase de citocinese, na membrana flagelar, na bolsa flagelar e alterações em organelas importantes, como o cinetoplasto, onde ocorreu duplicação irregular e alteração do seu tamanho. Já por citometria de fluxo foi possível confirmar que o tratamento induziu uma exposição de fosfatidilserina e diminuição no volume celular de promastigotas tratadas. Com relação à célula hospedeira, o extrato promoveu alterações no citoesqueleto, o aumento número de projeções citoplasmáticas, do volume celular e de vacúolos e da habilidade de espraiamento sem causar efeito citotóxico ou alteração ultraestrutural em macrófagos tratados com o extrato. Assim, estes resultados demonstram que o extrato aquoso da raiz de P. angulata foi eficaz na ativação da célula hospedeira e na inibição do crescimento do protozoário, o que representa uma fonte alternativa e promissora de agente leishmanicida.

Establishing the reference range for t lymphocytes subpopulations in adults and children from Brazil

Os valores de referências de linfócitos T existentes no Brasil são baseados em dados originados de outros países. Não existem dados locais da variação normal para estes parâmetros em adultos e crianças brasileiras. Avaliamos a variação normal encontrada em doadores de sangue de cinco grandes cidades brasileiras em diferentes regiões e em crianças residentes em Salvador e Rio de Janeiro. Todas as amostras foram processadas por citometria de fluxo. Os resultados foram analisados de acordo com região, gênero e estilo de vida dos doadores. Um total de 641 adultos (63% homens) e 280 crianças (58% meninos) participaram do estudo. Valores absolutos de CD3+ e CD4+ foram significantemente maiores no gênero feminino (adultos e crianças). Maiores valores de CD4+ em adultos foram associados com tabagismo, enquanto que maiores valores de CD8+ foram encontrados entre crianças do sexo feminino. Adultos das regiões sul e sudeste apresentaram maiores valores absolutos para todas as células T enquanto que adultos da região norte, apresentaram menores valores. Indivíduos residentes no nordeste e centro-oeste obtiveram contagens intermediárias para todas as populações de células T. Entretanto, estas diferenças entre as regiões, não demonstraram diferença estatística. No Brasil, gênero e tabagismo foram os principais determinantes para diferenças em valores de referências de linfócitos T.

Reference range for T lymphocytes populations in blood donors from two different regions in Brazil

ABSTRACT: This study defined the normal variation range for different subsets of T-lymphocyte cells count in two different Brazilian regions. We analysed the T-lymphocytes subpopulations (CD3+, CD4+, CD8+) in blood donors of two Brazilian cities, located in North (Belem, capital state of Para, indian background) and Northeast (Salvador, capital state od Bahia, African background) regions of Brazil. Results were compared according to gender, stress level (sleep time lower than 8 hours/day), smoking, and alcohol intake. Lymphocytes subpopulations were measured by flow cytometry. Five hundred twenty-six blood donors from two Brazilians cities participated in the study: 450 samples from Bahia and 76 samples from Pará. Most (60%) were men, 59% reported alcohol intake, 12% were smokers, and 80% slept at least 8 h/day. Donors from Bahia presented with significantly higher counts for all parameters, compared with Para. Women had higher lymphocytes levels, in both states, but only CD4+ cells count was significantly higher than men's values. Smokers had higher CD4+ counts, but sleep time had effect on lymphocytes levels only for Para's donors (higher CD3+ and CD4+ counts). That state had also, a higher proportion of donors reporting sleep time <8 h/day. The values for CD3, CD4 and CD8+ cells count were significantly higher in blood donors from Bahia than among those from Pará. Female gender, alcohol intake, stress level, and smoking were associated with higher lymphocyte counts. The use of a single reference range for normal lymphocytes count is not appropriate for a country with such diversity, like Brazil is.

Caracterização lipídica de duas cepas de Leishmania (Viannia) braziliensis causadoras da leishmaniose tegumentar americana

A leishmaniose tegumentar americana (LTA) constitui uma doença infecciosa causada por protozoários do gênero Leishmania com elevada incidência na região Amazônica. Uma variedade de espécies de leishmania é responsável por esta patologia. Desta forma, dependendo da espécie e da resposta imunológica do hospedeiro vertebrado, a doença pode apresentar diferentes formas clínicas, como a leishmaniose cutânea localizada (LCL) e a leishmaniose mucocutânea (LMC). A principal espécie responsável pela LTA é a Leishmania (Viannia) braziliensis. Contudo, devido à existência de uma multiplicidade de cepas desta espécie e ao reduzido número de estudos relacionados, torna-se importante o conhecimento dos aspectos metabólicos básicos do protozoário, como o metabolismo lipídico, na tentativa de caracterizar vias ou componentes fundamentais para seu desenvolvimento e infectividade. Desta forma, este trabalho teve como objetivo analisar distribuição de corpos lipídicos (CLs) e o perfil lipídico de duas cepas de L. (V.) braziliensis, isolada de diferentes casos clínicos, em diferentes períodos da fase estacionária do crescimento celular. As formas promastigotas das cepas M17593 (LCL) e M17323 (LMC) de L. (V.) braziliensis foram utilizadas na fase estacionária inicial (EST-I) e estacionária tardia (EST-T) de crescimento. Inicialmente, foi realizada análise ultraestrutural das formas promastigotas por microscopia eletrônica de transmissão (MET) e foram observadas estruturas sugestivas de CLs distribuídos no citoplasma do parasito, confirmados pela técnica citoquímica ósmio-imidazol, organelas necessárias para o metabolismo energético do parasito. Para quantificar a distribuição de CLs entre os dias de cultivo e entre as cepas, foi realizada análise por citometria de fluxo com Bodipy® 493/503. Os resultados indicaram que a cepa responsável pela LMC apresentou maior quantidade de CLs durante a fase estacionária tardia. Na cepa LCL não foi observado diferença significativa entre as fases estudadas. Assim, pode ser sugerido que a exacerbada resposta inflamatória que ocorre em pacientes com LMC, esteja relacionada com o acúmulo de CLs no parasito, fonte de energia e eicosanoides, como prostaglandinas. Outra hipótese é a possível correlação de CLs com a baixa exposição do fosfolipídio fosfatidilserina para a superfície externa da membrana, importante para a infectividade do parasito. Para análise dos lipídios totais, os parasitos foram submetidos à extração lipídica, seguido da técnica de HPTLC, onde foram encontrados predominantemente fosfolipídios, esterol esterificado, esteróis, triglicerídeos e ácidos graxos compondo o parasito, com variações entre as cepas e entre as fases estudadas. A cepa LCL na fase estacionária tardia possui maior quantidade de lipídios totais, que pode ser justificado por já ser conhecida como a cepa mais infectiva e possivelmente apresentar maior quantidade de glicoconjugados associados com subdomínios lipídicos importantes para o reconhecimento de fagócitos. É importante ressaltar que a maior infectividade da cepa LCL quando comparada à cepa LMC, resulta em um menor processo inflamatório. Estes resultados indicam que há uma variação no perfil lipídico e na distribuição de CLs entre as diferentes cepas de L. (V.) braziliensis, que pode estar relacionado com a infectividade do parasito e com a manifestação clinica da doença.

Frequency of paroxysmal nocturnal hemoglobinuria in patients attended in Belém, Pará, Brazil

ABSTRACT: Paroxysmal nocturnal hemoglobinuria is a hematological disease with complex physiopathology. It is genetically characterized by a somatic mutation in the PIG-A gene (phosphatidylinositol glycan anchor biosynthesis, class A), in which the best known antigens are DAF (decay accelerating factor or CD55) and MIRL (membrane inhibitor of reactive lysis or CD59). OBJECTIVE: To determine the frequency of paroxysmal nocturnal hemoglobinuria in patients attended at the HEMOPA foundation from November 2008 to July 2009. METHOD: Thirty patients, with ages ranging from two to 79 years old and suspected of having paroxysmal nocturnal hemoglobinuria were examined. All patients were immunophenotyped by flow cytometry for the CD5, CD59, CD16 and CD45 antigens. RESULTS: Paroxysmal nocturnal hemoglobinuria was identified in nine of the thirty patients investigated. Another 3 cases had inconclusive results with CD59-negative labeling only for neutrophils. The highest frequency of paroxysmal nocturnal hemoglobinuria patients (7/9) and inconclusive cases (2/3) were between 19 years old and 48 years old, with a median of 28 years. CONCLUSION: These results show the importance of flow cytometry to identify cases in which patients are deficient in only one antigen (CD59).

Diagnóstico de imunofenótipos de síndromes linfoproliferativas crônicas por citometria de fluxo na Fundação HEMOPA

INTRODUÇÃO: As síndromes linfoproliferativas formam um grupo heterogêneo de neoplasias malignas com diferentes comportamentos clínicos, fatores patológicos e características epidemiológicas e podem ter seu diagnóstico geral com base na morfologia das células linfoides observadas no sangue periférico. OBJETIVO: Testar a factibilidade diagnóstica do método de imunofenotipagem por citometria de fluxo para síndromes linfoproliferativas a partir da definição de um painel mínimo de anticorpos. MATERIAL E MÉTODOS: Participaram 47 pacientes para diagnóstico diferencial dos subtipos de síndromes infoproliferativas por citometria de fluxo, no período de julho de 2008 a julho de 2010, atendidos na Fundação HEMOPA. RESULTADOS: A mediana de idade dos pacientes foi de 68 anos, não houve diferença estatística entre os sexos e o subtipo de síndromes linfoproliferativas mais frequente foi a leucemia linfoide crônica/linfoma linfocítico de pequenas células B. CONCLUSÃO: O método de imunofenotipagem por citometria de fluxo, ao lado da morfologia, de amostras de sangue periférico mostrou-se uma metodologia auxiliar, segura, rápida, factível e não invasiva para o diagnóstico de síndromes linfoproliferativas crônicas a partir do painel de anticorpos sugerido.

Frequency of acute myeloid leukemia in children attended in Belém, Pará from August 2005 to May 2009

Introdução: A leucemia mieloide aguda (LMA) tem incidência variável nas diferentes regiões do Brasil. Objetivos: Determinar a frequência dos subtipos de LMA em crianças entre 0-17 anos, atendidas em Belém, Pará, no período de agosto de 2005 a maio de 2009. Casuística e métodos: Estudo retrospectivo com 278 pacientes com diagnóstico de leucemias agudas ou crônicas com base nos critérios clínicos, morfológicos (classificação franco-americana-britânica [FAB]/Organização Mundial da Saúde [OMS]) e de perfil imunofenotípico por citometria de fluxo para determinação da frequência de subtipos de LMA. Resultados: Foram encontrados 70 (25,18%) casos de LMA; destes, 37 (52,9%) eram crianças entre 0-17 anos (idade mediana de 7 anos e 8 meses). Não houve diferença estatística em relação ao gênero. Observou-se maior frequência de LMA dos subtipos M2 (18/37 - 48,6%) e M0/M1 (10/37 - 27%), principalmente na primeira década de vida (16/28 [57,1%] LMA M2 e 9/28 [32,1%] LMA M0/M1). Conclusão: Na população pediátrica, os tipos de LMA M2, M0/M1 e M3 foram, respectivamente, as mais frequentes.