Modelo experimental de imunossupressão com ciclofosfamida em Rattus norvegicus da linhagem wistar e primatas não humanos da especie Cebus apella: análise genotoxicológica

Foi estabelecido um modelo de imunossupressão em roedores por inoculação do agente alquilante Ciclofosfamida (CY). A administração de 50 mg/kg de CY em ratos Wistar provocou uma significante diminuição dos parâmetros de celularidade e peso relativo dos órgãos linfóides. Pela análise da titulação de anticorpos, do ensaio sobre as células formadoras de placa e do teste de hemólise foi comprovada que a imunidade humoral dos roedores sofreu supressão. Foram realizadas quatro inoculações desse imunossupressor e a periodicidade entre as inoculações foi determinada pela recuperação dos níveis de normalidade dos parâmetros supracitados. A alteração na contagem diferencial de células sanguíneas brancas representou o maior efeito adverso da CY, observado nos parâmetros de laboratório analisados nos Cebus apella. Nas duas vezes que foi administrada a droga houve redução no número de linfócitos e posteriormente diminuição de neutrófilos, porém somente na segunda foi observada a imunossupressão. Visto a proximidade filogenética dos primatas não humanos, este desenho experimental será de suma importância para o estudo de tumores em diversas fases do desenvolvimento e principalmente para testes de novos fármacos e esquemas terapêuticos. Com relação às análises de genotoxicidade da CY podemos concluir que em ratos Wistar, as administrações de CY aumentaram significativamente a freqüência de micronúcleos em eritrócitos policromáticos (MN PCEs) e provocaram efeito citotóxico (P<0.05). Em C. apella, os linfócitos do sangue periférico, após o tratamento com CY apresentaram um aumento significativo da media de MN/1000 células em relação aos linfócitos controle (P<0.05). A concentração de CY de 50mg/kg, em C. apella, corresponde à concentração DL50 da droga, visto que 50% desses animais morreram durante o experimento de imunossupressão. Até o desenvolvimento deste trabalho, não se conhecia a concentração correspondente ao DL50 nessa espécie. Ao comparamos as duas espécies de animais utilizadas neste trabalho, os primatas não humanos têm uma recuperação imune mais rápida em relação aos ratos Wistar. Provavelmente a capacidade de metabolização da droga seja mais eficaz em C. apella. Nossos resultados apóiam, portanto, que os primatas não humanos constituem os melhores modelos experimentais devido a sua grande proximidade evolutiva e filogenética com o ser humano.

Tratamento com minociclina e transplante intraestriatal de células mononucleares da medula óssea após acidente vascular experimental encefálico

Diversos estudos sugerem que a tetraciciclina semi-sintética minociciclina e o transplante de células mononucleares da medula óssea (CMMOs) induzem neuroproteção em modelos experimentais de acidente vascular encefálico (AVENC). No entanto, poucos investigaram, comparativamente, os efeitos destas duas abordagens terapêuticas após AVENC induzido por microinjeções de endotelina – 1 (ET -1). Nesta dissertação, objetivou-se comparar os efeitos do bloqueio microglial com minociclina com os obtidos pelo transplante intraestriatal de CMMOs na fase aguda após acidente vascular encefálico experimental, sobre a área de lesão, neuroproteção, apoptose de recuperação funcional. Ratos machos adultos, da raça Wistar, pesando entre 250 e 350g, foram distribuídos em quatro grupos experimentais: controle (chamado de Salina) - isquêmico tratado com salina (N=4), isquêmico tratado com minociclina (N=4), isquêmico tratado com CMMOs (N=3) e doador de CMMOs (N=2). Testes comportamentais foram realizados em 1, 3 e 7 dias pós-isquemia para avaliar a recuperação funcional entre os grupos. Animais tratados com minociclina receberam 2 doses diárias de 50mg/kg nos 2 primeiros dias, e 5 aplicações únicas de 25mg/kg (i.p) nos dias subsequentes até o sexto dia após a indução isquêmica. 1x106 de CMMOs foram obtidas de ratos da mesma linhagem e transplantadas diretamente no estriato, 24h após a lesão isquêmica. Todos os animais foram perfundidos 7 dias após a indução isquêmica. Secções coronais foram coradas por violeta de cresila para análise histopatológica geral, e por imunohistoquímica para a identificação de corpos neuronais (neuN), microglia/macrófagos ativados (ED1) e células apoptóticas (Caspase-3). A análise histopatológica geral mostrou grande palor, perda tecidual e intensa ativação microglial/ macrofágica no estriato de animais tratados com solução salina estéril. O tratamento com CMMO foi mais eficaz do que a minociclina (P<0,05, ANOVA-Tukey) na redução do número de microglia/macrófagos ativados (salina 276,3 ± 9,3); CMMOs 133,8 ± 6,8) e minociclina 244,6 ± 7,1). CMMOs e minociclina reduziram a área de lesão, em 67,75% e 69,1%, respectivamente. Os dois tratamentos promoveram o mesmo nível de preservação neuronal (p< 0,05) em relação ao controle, 61,3 ± 1,5); 86,8 ± 3,4) e 81 ± 3,4). As CMMOs reduziram de forma mais eficaz (p<0,01) o número de células apoptóticas em relação à minociclina e grupo controle (26,5 ± 1,6); 13,1 ± 0,7) e 19,7 ± 1,1). Ambas as abordagens terapêuticas promoveram recuperação funcional dos animais isquêmicos. Os resultados sugerem que o tratamento com CMMOs é mais eficaz na modulação da resposta microglial e na diminuição da apoptose do que o tratamento com minociclina, apesar de ambos serem igualmente eficazes para indução da neuroproteção. Estudos futuros devem investigar se o tratamento com minociclina associado ao transplante de CMMOs produzem efeitos sinérgicos, o que poderia amplificar os níveis de neuroproteção observados.

Avaliação do perfil de metilação e expressão do gene CDH1 em Cebus apella como modelo experimental para câncer gástrico

O câncer gástrico continua sendo uma importante causa de morte dentre os tipos de câncer no Brasil e no mundo. A origem do câncer de estomago provém, assim como nos demais, de acúmulo de alterações genéticas. Portanto, se faz necessário saber quais alterações genéticas são importantes para desencadear a patogênese do câncer gástrico. O MNU, conhecido carcinógeno, quando ingerido de forma oral em doses determinadas desencadeia o desenvolvimento de adenocarcinoma gástrico do tipo intestinal, com aparecimento de estágios pré definidos característico deste tipo tumoral. Com base nestes conhecimentos, realizamos um experimento com 6 macacos da espécie Cebus apella induzidos à desenvolver câncer gástrico do tipo intestinal. Os animais ingeriam 16mg/kg de peso diariamente da droga, com desenvolvimento de lesões pré-neoplásicas em todos. Infelizmente, devido à toxicidade da droga, somente um animal sobreviveu ao tratamento e desenvolveu desenvolveu uma massa tumoral propriamente dita. Foram feitas avaliações periódicas dos animais, em dias pré-determinados (ao início, no 120º, 150º, 300º, 940º) com coletas de fragmentos da mucosa gástrica. Foram coletadas 20 amostras de tecido, distribuídas entre mucosa normal, gastrite, displasia, metaplasia e tumoral. Destas amostras extraímos DNA para as análises do gene CDH1. Não há na literatura sequencia deste gene para a espécie utilizada no estudo. Com este objetivo, utilizamos iniciadores construídos a partir de sequencias de CDH1 de Callithrix jacchus (espécie filogeneticamente) e seqüenciamos cerca de 342pb da região promotora de CDH1 de C. apella. As análises mostraram uma similaridade de 98% desta região com a dos humanos, com presença de vários sítios de ligação de fatores de transcrição (sp1, Ap2, NF-x, AREB6, Puf e CTF) além da presença do CAAT Box. Esta região ainda possui 30 sitios CpGs, o que indica que ela pode estar sofrendo regulação epigenética. Para se verificar como se encontrava o padrão de metilação desta região realizamos uma análise de MSP com iniciadores específicos e constatamos que houve predominância de alelos não metilados de CDH1 para todas as amostras pré neoplásicas e a amostra de adenocarcinoma encontra-se metilada. O que pode ser constatado com um ensaio de Imunohistoquímica, onde somente a amostra tumoral não expressava a proteína caderina. Desta maneira nossas análises sugerem que a metilação do gene CDH1 desempenha papel importante na tumorigênese gástrica em C. apella, e é um evento tardio, uma vez que não é observado nos outro tipos teciduais não tumorais E, partindo-se da similaridade entre as seqüências, podemos sugerir que o mesmo evento pode está ocorrendo em humanos. Esta metilação do promotor do CDH1 leva a um silenciamento deste gene o que desencadeia o estabelecimento de adenocarcinomas gástricos, fato apoiado pela literatura onde vários trabalhos apontaram que a hipermetilação do promotor da caderina está associada ao desenvolvimento do câncer gástrico.

Intoxicação crônica experimental com alumínio: padrões degenerativos, comportamentais e terapia experimental com magnésio após lesão hipocampal

Evidências experimentais sugerem que o alumínio é um agente neurotóxico com ações deletérias sobre os processos cognitivos. Neste estudo, investigou-se os efeitos comportamentais, histopatológicos e bioquímicos da intoxicação crônica com citrato de alumínio sobre o hipocampo de ratos adultos, e ao mesmo tempo aplicou-se uma terapia experimental de tratamento com magnésio para a reversão das alterações neuropatológicas encontradas. Utilizou-se 70 ratos Wistar machos de 200-250 g, divididos em grupos da seguinte maneira: controle, citrato de sódio (CNa), citrato de alumínio (CAl), citrato de alumínio + sulfato de magnésio (CAl+Mg), citrato de sódio + sulfato de magnésio (CNa+Mg). A dose usada de citrato de alumínio foi de 100 mg/kg e sulfato de magnésio 250 mg/kg durante 30 dias. Os animais foram submetidos aos testes comportamentais do campo aberto, Rota rod, Reconhecimento social e Labirinto em T elevado (LTE), análise bioquímica, histopatológica e imunoistoquímica para GFAP. Além disso, foram verificados os níveis de alumínio no plasma e no hipocampo dos animais em espectrômetro de absorção atômica em forno de grafite (GF AAS). Os resultados obtidos mostraram que o grupo CAl apresentou um aumento da atividade locomotora no teste do campo aberto em comparação ao grupo controle e já o grupo CAl+Mg apresentou uma diminuição (P<0.001). Nos testes de memória do LTE e de Reconhecimento social, os animais do grupo CAl apresentaram déficits no cognitivos em relação aos demais grupos enquanto os animais do grupo CAl+Mg apresentaram um bom desempenho nos teste (P<0.001). Os níveis de alumínio encontrados no hipocampo do grupo CAl foram consideravelmente elevados e nos demais grupos os níveis ficaram abaixo do limite de detecção. Na análise histopatológica e imunoistoquímica, os animais do grupo CAl apresentaram diminuição da densidade celular e reatividade astrocitária nas camadas CA1, CA3 e hilo do hipocampo. Estes resultados sugerem que a intoxicação experimental com citrato de alumínio induz déficits de aprendizado e memória e que a administração de sulfato de magnésio pode ter a capacidade de minimizar os danos causados pelo metal no hipocampo de animais intoxicados.

O conceito de incontrolabilidade na pesquisa experimental e na terapia comportamental da depressão

A Análise do Comportamento oferece diversas explicações para o fenômeno denominado depressão, uma das quais envolve a referência ao modelo do desamparo aprendido. O desamparo aprendido é definido como a dificuldade de aprendizagem resultante da exposição a estímulos aversivos incontroláveis. Como produtos desta exposição, surgiriam padrões comportamentais comuns àqueles observados em indivíduos depressivos, a exemplo de inatividade. Em razão do paralelo entre os efeitos da experiência com incontrolabilidade sobre o repertório comportamental em humanos e não-humanos, o desamparo aprendido tem sido apontado como um modelo animal de depressão. Frequentemente, menções à experiência com incontrolabilidade são encontradas na literatura em associação com o desamparo aprendido, cuja ocorrência é estritamente vinculada àquela condição. A incontrolabilidade também parece relevante para a instalação de respostas identificadas com a depressão. No presente trabalho, descrevem-se as definições de incontrolabilidade referidas por publicações da área comportamental experimental e clínica, discutindo-se a pertinência deste conceito em explicações funcionais da depressão na Análise do Comportamento, bem como suas possíveis contribuições para um modelo de intervenção clínica da depressão à luz desta abordagem. A relação entre incontrolabilidade e depressão é tratada a partir de cinco categorias de análise: 1) Variabilidade de fenômenos investigados, de resultados produzidos e de definições oferecidas; 2) Efeitos diferenciais da incontrolabilidade frente a estímulos aversivos e apetitivos; 3) Enfoques transversais das variáveis relevantes: instaladoras x mantenedoras, históricas x atuais, exclusivas x sobrepostas a outros fenômenos; 4) Incontrolabilidade em Humanos: suposições numerosas, evidências empíricas escassas e Contingências Verbais; 5) Tratamento da depressão: pontos de contato e de distanciamento frente à investigação empírica. Diferentes usos do conceito de incontrolabilidade são assinalados, indicando-se como a mesma topografia verbal é emitida por diversos autores sob controle de eventos distintos. Variáveis relevantes para a generalidade do desamparo aprendido – enquanto modelo experimental e equivalente animal da depressão – são discutidas, justificando-se a necessidade de maior investigação de aspectos como: correspondência entre o conceito de incontrolabilidade e a condição experimentalmente estabelecida no laboratório; efeitos de diferentes tipos de estimulação incontrolável; produção de desamparo aprendido em humanos e participação de processos verbais; diferentes efeitos da sinalização pré-aversiva de estímulos incontroláveis. Assinala-se que, em geral, o tratamento analítico-comportamental da depressão é constituído por procedimentos com foco sobre a aprendizagem de que responder controla o ambiente e pode disponibilizar reforçadores. É examinado o papel da incontrolabilidade na instalação da depressão, constatando-se, por fim, que se apresenta como condição suficiente, porém não necessária para a ocorrência e/ou manutenção do fenômeno.

Atividade antiinflamatória e neuroprotetora da Edaravona no córtex sensóriomotor primário de ratos adultos submetidos à isquemia focal experimental

O acidente vascular encefálico (AVENC) é uma desordem neural iniciada a partir da redução ou interrupção do fluxo sanguíneo, tornando inadequada a demanda energética para a região, promovendo assim um dano tecidual. O AVENC é classificado em hemorrágico ou isquêmico. O AVENC isquêmico tem maior prevalência e pode ocorrer por trombose ou embolismo. A patologia isquêmica tem múltiplos eventos interrelacionados como excitotoxicidade, despolarização periinfarto, estresse oxidativo e nitrosativo, inflamação e apoptose. Um elemento de fundamental importância na patologia isquêmica é a célula microglial, cuja atividade está intimamente ligada à progressão do ambiente lesivo. Uma alternativa terapêutica no tratamento do AVENC é um pirazolona denominada Edaravona. O presente trabalho avaliou a o efeito neuroprotetor da Edaravona na dose de 3mg/kg no córtex sensóriomotor primário após lesão isquêmica focal. A indução isquêmica foi induzida através da administração de 40pM do peptídeo vasoconstritor endotelina 1 diretamente sobre o córtex sensóriomotor primário. Foram avaliados animais tratados com Edaravona (N=10) e animais tratados com Água Destilada (N=10) nos tempos de sobrevida 1 e 7 dias após o evento isquêmico. O tratamento com edaravona evidenciou através da análise histopatológica com violeta de cresila uma redução de 49% e 66% na área de infarto nos animais nos tempo de sobrevida 1 e 7 dias respectivamente. Os estudos imunohistoquímicos para micróglia/macrófagos ativos (ED1⁺) demostraram uma redução na presença de células ED1⁺ em 35% e 41% para os tempos de sobrevida 1 e 7 dias respectivamente. A redução na presença de neutrófilos (MBS-1⁺) foi significativa apenas nos animais com tempo de sobrevida de 24h onde se observou a redução em 56% na presença dessas células. A análise estatística foi feita por análise de variância com correção a posteriori de Tukey com p <0,05.

Sobrevivência e dispersão de células da fração mononuclear da medula óssea transplantadas heterologamente no estriado após isquemia experimental

Estudos experimentais evidenciam o potencial promissor das células da fração mononuclear da medula óssea (CMN-MO) no tratamento de modelos de isquemia cerebral. Sabe-se que as CMN-MOs são sensíveis à modificações microambientais, tal qual aquelas induzidas por uma isquemia, como eventos associados à inflamação. Contudo, pouco se conhece a respeito da biodistribuição e sobrevida dessas células no tecido nervoso pós-lesão. Objetiva-se investigar se a sobrevivência e a disseminação das CMN-MOs são influenciadas pela resposta inflamatória após isquemia estriatal. Parecer CEPAE, protocolo nº 073/12. Transplante heterólogo (5x105 de CMN-MOs) no estriado de ratos Wistar, agrupados entre controles não-tratados (IST) e falso-operado (FO) e tratados (ITCM), perfundidos em 1, 3, 7 e 28 dias. CMN-MO foram impregnadas com Nanocristais Qdot para posterior identificação por microscopia de fluorescência no tecido do receptor. Coloração, por violeta de cresila, e imunoistoquímica básica (IBA1 e ED1) foram aplicadas para análise histopatológica do tecido em microscopia de luz. Testes neurocomportamentais (teste de remoção do adesivo e teste do cilindro) foram realizados para aferir a resposta dos grupos às intervenções. Os achados histopatológicos evidenciam a eficiência do modelo experimental de indução isquêmica em reproduzir a lesão no estriado dorsolateral. O infiltrado celular no grupo IST marca a resposta inflamatória, posteriormente confirmada por imunoistoquímica para ED1 e IBA1; o infiltrado celular no grupo ITCM, evidencia a permanência das CMN-MO em todas as sobrevidas estudadas. O perfil de perda por morte das CMN-MO transplantadas no sítio de lesão é semelhante entre os grupos ITCM e FO, contudo, evidencia que resposta inflamatória do receptor causa maior decaimento do montante celular no grupo ITCM. Procedimentos de infusão celular mais refinados ou automatizados podem melhorar a sensibilidade dos testes comportamentais para discriminar a evolução entre os grupos estudados. Conclui-se que a alteração do microambiente pós-isquemia cria condições que determina a dispersão e a sobrevivência das CMN-MO. Outras análises de imunoistoquímicas podem apontar resultados quanto ao perfil microglial presentes nas sobrevidas estudadas e o grau de imunomodulação pelo estudo da dinâmica das citocinas inflamatórias produzidas.