Modelo in vitro de parkinsonismo experimental induzido por rotenona: investigação de mecanismos de ação, neuroproteção e morte celular

Evidências crescentes na literatura têm sugerido papel importante para os fatores ambientais, como a exposição a pesticidas, na patogênese da doença de Parkinson. Em animais experimentais, a exposição à rotenona, um pesticida e piscicida de uso comum, induz características de parkinsonismo através da inibição do complexo I mitocondrial. O objetivo deste estudo foi investigar a morte de neurônios induzida por rotenona utilizando culturas primárias mistas neurônio/glia derivadas de hipocampo e de mesencéfalo ventral de ratos, bem como o papel do Ca2+ na neste modelo experimental e a utilização de extrato aquoso de folhas de mogno com substâncias com alto poder antioxidante. A perda neuronal foi analisada com ensaios colorimétricos (MTT e LDH). Nossos resultados mostraram significativa redução na viabilidade celular após exposição à rotenona de maneira dependente de concentração, mas não dependente de tempo. Foi observada igual e elevada suscetibilidade em culturas mistas neurônio/glia derivadas de hipocampo e de mesencéfalo ventral ao agente neurotóxico. Em termos mecanicísticos, nossos resultados mostraram um papel discreto desempenhado pelo Ca2+ mitocondrial na neurodegeneração induzida por rotenona. Além disso, neste paradigma utilizado, verificamos que o extrato aquoso de folhas de mogno não promoveu proteção contra a toxicidade da rotenona, na concentração testada; ainda, promoveu efeito sinérgico em associação com rotenona. Verificou-se ainda que a rotenona, bem como o extrato de mogno promoveu indução de morte celular tanto por necrose quanto por apoptose, nas concentrações utilizadas. Os resultados deste estudo devem avançar nosso conhecimento sobre o mecanismo de ação de fatores ambientais na patogênese da doença de Parkinson.

Avaliação do perfil de metilação e expressão do gene CDH1 em Cebus apella como modelo experimental para câncer gástrico

O câncer gástrico continua sendo uma importante causa de morte dentre os tipos de câncer no Brasil e no mundo. A origem do câncer de estomago provém, assim como nos demais, de acúmulo de alterações genéticas. Portanto, se faz necessário saber quais alterações genéticas são importantes para desencadear a patogênese do câncer gástrico. O MNU, conhecido carcinógeno, quando ingerido de forma oral em doses determinadas desencadeia o desenvolvimento de adenocarcinoma gástrico do tipo intestinal, com aparecimento de estágios pré definidos característico deste tipo tumoral. Com base nestes conhecimentos, realizamos um experimento com 6 macacos da espécie Cebus apella induzidos à desenvolver câncer gástrico do tipo intestinal. Os animais ingeriam 16mg/kg de peso diariamente da droga, com desenvolvimento de lesões pré-neoplásicas em todos. Infelizmente, devido à toxicidade da droga, somente um animal sobreviveu ao tratamento e desenvolveu desenvolveu uma massa tumoral propriamente dita. Foram feitas avaliações periódicas dos animais, em dias pré-determinados (ao início, no 120º, 150º, 300º, 940º) com coletas de fragmentos da mucosa gástrica. Foram coletadas 20 amostras de tecido, distribuídas entre mucosa normal, gastrite, displasia, metaplasia e tumoral. Destas amostras extraímos DNA para as análises do gene CDH1. Não há na literatura sequencia deste gene para a espécie utilizada no estudo. Com este objetivo, utilizamos iniciadores construídos a partir de sequencias de CDH1 de Callithrix jacchus (espécie filogeneticamente) e seqüenciamos cerca de 342pb da região promotora de CDH1 de C. apella. As análises mostraram uma similaridade de 98% desta região com a dos humanos, com presença de vários sítios de ligação de fatores de transcrição (sp1, Ap2, NF-x, AREB6, Puf e CTF) além da presença do CAAT Box. Esta região ainda possui 30 sitios CpGs, o que indica que ela pode estar sofrendo regulação epigenética. Para se verificar como se encontrava o padrão de metilação desta região realizamos uma análise de MSP com iniciadores específicos e constatamos que houve predominância de alelos não metilados de CDH1 para todas as amostras pré neoplásicas e a amostra de adenocarcinoma encontra-se metilada. O que pode ser constatado com um ensaio de Imunohistoquímica, onde somente a amostra tumoral não expressava a proteína caderina. Desta maneira nossas análises sugerem que a metilação do gene CDH1 desempenha papel importante na tumorigênese gástrica em C. apella, e é um evento tardio, uma vez que não é observado nos outro tipos teciduais não tumorais E, partindo-se da similaridade entre as seqüências, podemos sugerir que o mesmo evento pode está ocorrendo em humanos. Esta metilação do promotor do CDH1 leva a um silenciamento deste gene o que desencadeia o estabelecimento de adenocarcinomas gástricos, fato apoiado pela literatura onde vários trabalhos apontaram que a hipermetilação do promotor da caderina está associada ao desenvolvimento do câncer gástrico.