A influência do sistema nitrérgico no cultivo in vitro de embriões bovinos

O Óxido Nítrico (NO-) é uma molécula de sinalização celular que regula o desenvolvimento embrionário pré-implantacional. Nós investigamos o papel do NO- no cultivo de embriões bovinos produzidos in vitro, através do uso de N-Nitro-L-Arginina Metil Ester (L-NAME), um inibidor da produção de NO-, e L-arginina (ARG), um precursor de NO-, em diferentes períodos de cultivo (ativação do genoma embrionário e compactação). Foram avaliados seus efeitos sobre as taxas de desenvolvimento, cinética do desenvolvimento, qualidade embrionária, e expressão gênica. Os embriões foram produzidos por maturação e fertilização in vitro de oócitos aspirados de ovários provenientes de abatedouro frigorífico. No experimento 1, as taxas de desenvolvimento foram avaliadas em SOFaa na presença de L-NAME em diferentes períodos: do 1º ao 4º dia de cultivo (LN1-4), do 4º ao 8º (LN4-8) e do 1º ao 8º dia de cultivo (LN1-8). A inibição foi prejudicial a partir do 4º dia de cultivo (grupos LN4-8 e LN1-8), ao reduzir as taxas de eclosão (17,3%±13,44 e 13,7%± 14,51, respectivamente, p<0,05). Entretanto, o efeito mais negativo ocorreu do 1º ao 8º dia (LN1-8) em que a taxa de blastocisto foi significativamente menor comparada ao controle (29,4%±3,72 vs 47,8%±11,34, respectivamente, p<0,05). Por isso no experimento 2, a ARG (1, 10 e 50mM) foi adicionada desde o 1º dia de cultivo. As taxas de blastocisto usando 1 e 10mM de ARG foram similares ao controle (48%±13,03 e 34,2%±3,92 vs 49,4%±4,82, respectivamente, p>0,05), mas 50mM prejudicou a taxa de desenvolvimento embrionário (10,7%±7,24, p<0,001). No experimento 3, ARG a 1mM foi adicionada do 5º ao 8º dia de cultivo. Foram observadas taxas de desenvolvimento similares ao grupo GLN (somente com glutamina). Mas comparada ao controle (sem ambos os aminoácidos), rendeu melhores taxa de eclosão (54,8%±6,9 vs 41,4%±11,47, respectivamente, p<0,05) e qualidade embrionária (84,8%±2,63 vs 52%±8,62, respectivamente, p<0,05), mas não de taxa de blastocisto (49,4%±6,5 vs 49,4%±4,8, respectivamente, p>0,05). Neste período a produção de NO- foi positivamente correlacionada com a taxa de eclosão (R²=96,4%, p<0,001) e a qualidade embrionária (R²=75,5%, p<0,05). Adicionalmente, embriões foram cultivados na presença de L-NAME e ARG simultaneamente (grupo ARG/LN), do 5º ao 8º dia de cultivo, e os transcritos de OCT-4 e INT-t foram quantificados por PCR tempo real. Foi encontrada expressão similar de OCT-4 (p>0,05), mas redução de 1,8x e 1,5x de INT-t em relação aos grupos controles ARG e GLUT (p<0,05), respectivamente. Esses dados fornecem evidências da contribuição do NO-, principalmente no período entre os estágios de mórula e blastocisto, para a melhoria da eclosão e qualidade embrionária. A produção de NO- é requerida para o desenvolvimento pré-implantacional de embriões bovinos produzidos in vitro, e pode ser mediada pela suplementação do meio de cultivo com ARG.

Avaliação de substratos orgânicos no cultivo de orquídeas nativas da APA ilha do Combu, Belém, Pará, Brasil

As fibras naturais vem se destacando no cultivo de orquídeas, entre elas a fibra do coco é a mais promissora. Entretanto, existem outros resíduos orgânicos naturais que podem usados no cultivo. Foi realizado um estudo na Área de Proteção Ambiental Ilha do Combu, localizada no município de Belém, com o objetivo de avaliar os efeitos de substratos orgânicos no cultivo de orquídeas. As orquídeas selecionadas foram Brassia chloroleuca Barb.Rodr. e Sobralia macrophylla Rchb f. ambas nativas da APA. Entre os substratos testados, incluiu-se produto do aproveitamento do açaí, a palmeira mais freqüente na ilha. As orquídeas foram submetidas a quatro substratos considerados como tratamentos (T1 - fibra do caule do açaizeiro; T2 - fibra do coco; T3 - sementes do açaizeiro e T4 - serragem). O delineamento experimental foi inteiramente casualizado com 4 tratamentos e 4 repetições (10 indivíduos/repetição). Os parâmetros avaliados foram: o diâmetro, o comprimento, o número de brotações, número de folhas e Taxa de Sobrevivência para pseudobulbos de Brassia chloroleuca e para rebrotações de Sobralia macrophylla. Os dados foram inseridos em planilhas do Programa Bioestat 5.0. e submetidos à análise de variância e as médias comparadas pelo teste Tuckey a 5% para avaliar o grau de significância dos efeitos dos tratamentos. Os resultados mostraram que a fibra do caule do açaí promoveu o melhor desenvolvimento das estruturas vegetativas seguida da serragem em pseudobulbos de B. chloroleuca e para S. macrophylla a fibra do caule e a semente do açaí promoveram o maior desenvolvimento vegetativo. Conclui-se que a fibra do caule do açaizeiro pode ser utilizada no cultivo das espécies com aproveitamento sustentável e ecológico após o corte do palmito do açaizeiro.

Efeito do estradiol e da progesterona no desenvolvimento e na qualidade de embriões bovinos produzidos in vitro

Avaliaram-se o desenvolvimento e a qualidade de embriões bovinos, cocultivados com células epiteliais do oviduto bovino (CEOBs) expostas ou não ao estradiol e à progesterona. Os ovócitos foram maturados in vitro por 24h e, então, fertilizados utilizando-se sêmen congelado, em estufa de CO2 a 5% e 38,5oC. As CEOBs foram cultivadas em TCM-199 com ou sem estradiol (E2) (24 horas), nas mesmas condições da maturação e fertilização in vitro (MIV e FIV), e, em seguida, adicionadas aos diferentes grupos em CR2 com ou sem progesterona (P4) (G1=P4+E2); (G2=E2); (G3=P4) e (G4=controle). Após 18h da FIV, as células foram cultivadas nos diferentes sistemas. Nenhuma diferença (P>0,05) foi observada nas taxas de clivagem entre G1, G2 e G4 (53,5%; 56,3%; 51,7%) e nos padrões de blastocistos (BLs) (29,3%; 31,2%, 28,7%). Índices menores (P<0,05) foram obtidos no G3 para ambas as variáveis (34,5%; 16,4%). G1 e G2 apresentaram taxas de eclosão maiores (P<0,05) que os outros grupos (23,3%; 23,2%), sendo G4 (19,3%) diferente de G3 (16,1%). Em G1, G2 e G3, o número de células nos BLs aumentou 125,9; 128,4 e 123,6, respectivamente (P<0,05), em relação ao G4 (112,5). Conclui-se que o tratamento das CEOBs com o E2, nas primeiras 24 horas de cultivo, pode ser usado isoladamente ou em combinação com a progesterona, a fim de melhorar a qualidade de embriões bovinos produzidos in vitro.

Avaliação do efeito protetor da prolactina em linfócitos expostos a ação do metilmercúrio

O mercúrio pode ser encontrado em diversas formas, sendo a orgânica como metilmercúrio (MeHg), considerada a mais tóxica. Facilmente absorvido por via oral, se acumula na cadeia trófica e se amplifica em carnívoros aquáticos, principalmente em peixes, daí o risco maior para as populações que deles se alimentam preferencialmente, como os ribeirinhos Amazônidas. O efeito neurotóxico dessa forma de mercúrio tem sido amplamente demonstrado através de estudos epidemiológicos e experimentais. Alguns desses estudos também mostraram que hormônios e substâncias antioxidantes podem agir protegendo o organismo contra a ação deletéria do mercúrio. A prolactina é um destes hormônios que apresenta ação protetora, mas age também como citocina pró-inflamatória. Desde que o MeHg pode também agir como uma substância imunotóxica, procuramos neste trabalho estudar a ação citoprotetora da PRL em cultivos contínuos de linhagem B95-A de linfócitos de primata afim de avaliar sua fragilidade ao MeHg e sua reatividade a ação da PRL. Com o objetivo de avaliar a integridade funcional dos linfócitos expostos ao MeHg utilizou-se teste de reação colorimétrica para 3-(4,5-dimetiltiazol-2-yl)-2,5-difenil tetrazólio bromide (MTT), o qual detecta atividade metabólica mitocondrial. Para avaliar a resposta imune do linfócito, medidas da concentração do fator de necrose tumoral alfa (TNF α) no sobrenadante do cultivo, foram realizadas por ELISA. É uma citocina pró-inflamatória liberada em resposta a agressão celular de diferentes causas, incluindo estresse oxidativo, um dos efeitos agudos mais evidentes do MeHg, além disso, esta citocina também poder responder a regulação prolactinérgica em linfócitos humanos. Após 18 horas de exposição do cultivo a crescentes concentrações do metal (0,1; 1, 5, 10 e 50 μM) verificou-se significativa diminuição do tipo dose-dependente da viabilidade celular a partir de 1 μM (35%) e progressivamente até 50 μM (80%), quando poucas células íntegras foram encontradas nos cultivos. Um efeito bifásico em forma de “sino” ocorreu na liberação de TNF α, onde concentrações mais baixas de MeHg inibiram (0,1 e 1 μM), a intermediária estimulou (5 μM) e as duas maiores (10 e 50 μM) voltaram a inibir. A prolactina também diminuiu a viabilidade celular, em cerca de 30%, somente na dose mais elevada (10 nM). Por outro lado, na dose de 1 nM a PRL preveniu a diminuição de 40% da viabilidade celular resultante a exposição ao MeHg a 5 μM. Esta dose de 1 nM de PRL foi a única a estimular a liberação de TNF α, mas curiosamente, reverteu a liberação desta citocina quando associada a 5 μM de MeHg, concentração que igualmente estimulou a secreção de TNF α. Os resultados confirmaram a toxidade do MeHg para linfócitos de primatas (linhagem B95-A) e sua reversão por uma possível ação protetora da PRL. Um efeito bifásico na secreção de TNF α resultou da exposição ao MeHg, sugerindo a presença de diferentes mecanismos citotóxicos resultantes a ação mercurial. Por outro lado, a PRL foi pouco efetiva em estimular a secreção daquela citocina, invertendo esta resposta quando associada ao MeHg. No entanto, estes resultados são preliminares e carecem de um estudo mais acurado para sua completa elucidação.

Efeito de meios de cultura, concentrações de GA3 e pH sobre a germinação in vitro de mangabeira (Hancornia speciosa Gomes)

A mangabeira (Hancornia speciosa Gomes) destaca-se por possuir um grande potencial como planta frutífera e produtora de borracha. As dificuldades encontradas no seu processo de propagação por meio de sementes, devido, principalmente, à baixa taxa de germinação e à recalcitrância, valorizam a busca por soluções alternativas para a produção de mudas dessa espécie, de maneira rápida e eficiente. Objetivou-se, neste trabalho, realizar o estudo da germinação de sementes de mangabeira em condições in vitro, tendo como precedente a obtenção de explantes, para posterior utilização no cultivo in vitro. Neste estudo foram avaliados os efeitos de diferentes meios de cultura, concentrações de sacarose e GA₃ e de três níveis de pH na germinação da mangabeira. Frutos maduros foram coletados, passaram por processo de beneficiamento e tiveram suas sementes retiradas e utilizadas como explantes. Maior porcentagem de germinação de sementes de mangabeira in vitro foi obtida com a utilização dos meios de cultura WPM e MS/2, suplementados com 15,0 g L^-1 de sacarose, 0,2 mg L^-1 de GA₃ e com pH corrigido para 5,8.

Efeito da escarificação e luminosidade na germinação in vitro de sementes de cagaiteira (Eugenia dysenterica DC.)

A cagaiteira é uma espécie nativa do Cerrado com elevado potencial frutífero. Como suas sementes apresentam elevada variabilidade, sendo ainda recalcitrantes e dormentes, a germinação in vitro apresenta-se como uma alternativa para a propagação da espécie, além de permitir a obtenção de explantes juvenis para a micropropagação. Com presente trabalho, objetivou-se avaliar o efeito da escarificação e da luminosidade na germinação in vitro de sementes de cagaiteira. Sementes desprovidas do tegumento e sementes intactas foram inoculadas em meio MS e mantidas na ausência e presença de luz. Sementes desprovidas de tegumento germinadas tanto na presença quanto na ausência de luz apresentaram 86,25% e 88,25% de germinação aos 31 e 71 dias da inoculação, respectivamente. Após 150 dias de inoculação, plântulas provenientes de sementes desprovidas de tegumento, germinadas na presença e ausência de luminosidade, apresentaram 10% e 12% de anomalias, respectivamente.

Efeito da monocultura de dendezeiro (Elaeis guineensis JACQ.) na integridade física e nas assembleias de peixes de igarapés da Amazônia Oriental

O objetivo da presente dissertação é avaliar o efeito do cultivo de dendezeiro Elaeis guineenses JACQ. na integridade física e nas assembleias de peixes de igarapés de terra firme da Amazônia Oriental. Os sítios de amostragem foram estabelecidos em trechos (150 m) de 23 igarapés da bacia do rio Acará-Mirim, Nordeste do Estado do Pará distribuídos em áreas de drenagem com floresta primária até áres de plantio de dendezeiro. De acordo com os resultados do índice de integridade física (IIF), dos 23 igarapés amostrados, todos que drenam áreas de fragmentos florestais foram classificados como íntegros (IIF = 5,00 – 4,00), enquanto que os 15 igarapés que drenam plantações de dendezeiro foram classificados como alterados (IIF = 3,67 – 2,67). Foram coligidos 9.734 espécimes de peixes pertencentes a seis ordens, 24 famílias, distribuídos em 64 espécies. As espécies mais abundantes durante o estudo foram Microcharacidium weitzmani, Apistogramma gr. regani, Trichomycterus hasemani, Hyphessobrycon heterorhabdus e Copella arnoldi. A riqueza observada em igarapés que drenam plantações foi superior (S = 61) a encontrada em igarapés que drenam fragmentos florestais (S = 42). Os resultados da PERMANOVA evidenciam que existe diferença entre os ambientes amostrados (G.L. = 22; pseudo-F = 2,44; P = 0,01), no entanto, o ordenamento produzido pelo NMDS demonstra que essa diferença é sutil (stress = 0,19), pois apenas três espécies são exclusivas de florestas e 22 exclusivas de áreas de palmeiras de dendezeiro. Resultado semelhante foi obtido utilizando-se a abundância dos grupos tróficos funcionais (GTF) (stress = 0,18). Os resultados do TITAN indicam que algumas espécies apresentam adaptações para persistir em determinadas situações ambientais, como por exemplo, Aequidens tetramrus, Apistogramma agassizii e Microcharacidium weitzmani que estão associadas a igarapés que drenam plantações de dendezeiro e são boas indicadoras de locais com menor integridade do hábitat físico (P < 0,05; pureza > 0,95; confiabilidade > 0,95), enquanto que as espécies Hyphessobrycon heterorhabdus e Helogenes marmoratus demonstaram ser indicadoras de hábitats mais íntegros (P < 0,05; pureza > 0,95; confiabilidade > 0,95). Não houve correlação entre a riqueza de espécies de peixes e o índice de integridade física, enquanto que os únicos grupos tróficos funcionais que apresentaram correlação com o índice de integridade física foram os escavadores e coletores navegadores. Esses grupos são compostos por peixes da família Cichlidae que apresentam comportamentos tolerantes e generalistas que podem ter explicado sua grande contribuição na assembleia de peixes mesmo em locais onde a sedimentação foi alta comparada aos locais com a configuração mais próxima do natural. Isso evidencia que mesmo a riqueza de espécies sendo maior em igarapés alterados há fortes indícios de perda de qualidade ambiental nos igarapés que drenam plantações gerada pelo cultivo de dendezeiro.

Maturação in vitro de oócitos bovinos em meios suplementados com quercetina e seu efeito sobre o desenvolvimento embrionário

A quercetina é um flavonoide, amplamente encontrada em frutas, vegetais, grãos, flores, com elevada concentração no vinho tinto, e tem sido caracterizada funcionalmente pela atividade antioxidante. Para avaliação da maturação nuclear e do desenvolvimento embrionário bovino, os oócitos foram maturados por 22h na presença de quercetina (0,4, 2, 10 e 50µM), cisteamina (100µM) e na ausência dos antioxidantes. Os oócitos maturados foram corados com Hoechst para avaliação da maturação in vitro. Para avaliação do desenvolvimento embrionário, os oócitos foram fertilizados e cultivados in vitro, as taxas de desenvolvimento embrionário foram determinadas no sétimo dia de cultivo e o percentual de eclosão e o número de células dos embriões no oitavo dia. Os níveis de glutationa (GSH) dos oócitos foram mensurados por emissão de fluorescência com CMF₂HC. A porcentagem de maturação nuclear (±89%) não diferiu entre os grupos. O desenvolvimento embrionário variou entre os tratamentos, o percentual de blastocisto foi superior (P<0,05) nos grupos tratados com 0,4, 2, 10 e 50∝M de quercetina (56,9, 59,5, 53,6 e 49,6%, respectivamente) e com 100∝M de cisteamina (50,4%) em relação ao grupo controle (42,3%). Na comparação entre os dois antioxidantes, a quercetina (0,4 e 2µM) foi superior na produção de embriões (56,9 e 59,5%, respectivamente) em comparação com cisteamina (50,4%). As taxas de embriões eclodidos foram similares (P>0,05) entre os grupos (±63,0%). O número médio de células dos embriões também foi similar entre os grupos (±233). Os níveis intracelulares de GSH foram superiores nos oócitos maturados com cisteamina, mas similares entre os oócitos tratados com quercetina e o controle. A suplementação da maturação in vitro com antioxidantes melhora as taxas de blastocistos. A quercetina foi superior à cisteamina, que, por sua vez, foi superior ao controle. Mas os níveis de GSH foram superiores somente nos oócitos tratados com cisteamina.