Perfil de suscetibilidade antifúngica e fatores de virulência de leveduras isoladas de onicomicose de pacientes atendidos no Laboratório Central do Estado do Pará (LACEN)

Introdução: Onicomicoses são infecções ungueais causadas por fungos, podendo ser causadas por dermatófitos, leveduras e fungos filamentosos não dermatófitos. O diagnóstico de leveduras como agente de onicomicose tem aumentado significativamente, tal evidência tem sido atribuída ao crescente número de indivíduos imunocomprometidos e transplantados, ao aumento do uso de drogas antibacterianas de amplo espectro, à fatores genéticos, tendências atópicas e ao aumento da vida média da população. O objetivo principal do trabalho foi determinar o perfil de suscetibilidade antifúngica e alguns dos fatores de virulência de leveduras causadoras de onicomicoses. Métodos e Resultados: Foram estudadas 100 amostras de raspado ungueal semeadas em Agar Sabouraud com cloranfenicol e em Agar Mycosel. A identificação e o teste de suscetibilidade antifúngica (fluconazol, anfotericina B, fluocitocina e voriconazol) foram realizados através do método automatizado Vitek 2 e visando a pesquisa dos fatores de virulência para detecção de fosfolipase e proteinase foram utilizados os meios com emulsão de ovo a 50% e o ágar BSA (Bovine Serum Albumin), respectivamente. Das 100 amostras coletadas, 57 (57%) foram positivas no exame micológico direto e 42 (42%) na cultura. Dos isolados, 29 (69%) eram Candida parapsilosis, 8 (19%) C. albicans, 3 (7,2%) C. haemulonii, 1 (2,38%) C. lusitanea e 1 (2,38%) C.tropicalis. Todas as espécies de C. albicans, C. lusitanea e C. tropicalis foram sensíveis aos antifúngicos. As espécies de C. parapsilosis apresentaram resistência em 6 (20,7%) cepas ao fluconazol, e em 3 (10,34%) ao voriconazol. C. haemulonii apresentou resistência em 1 (33,33%) cepa ao fluconazol, 1 (33,33%) a flucitosina, 1 (33,33%) ao voriconazol e 3 (100%) à anfotericina B. Os Fatores de resistência, fosfolipase e proteinase, estiveram presentes somente nas espécies de C. albicans com positividade de 87,5% e 50% respectivamente. Conclusão: A espécie C. parapsilosis é um agente emergente de onicomicose, apresentando cepas resistentes aos antifúngicos. C. haemulonii apresentou perfil multirresistente. C. albicans, ainda que sensível a todos os fármacos testados foi a única espécie que apresentou os fatores de virulência estudados.

Efeitos protetores da prolactina em cultivo glial de córtex de ratos expostos ao metilmercúrio

O metilmercúrio (MeHg) é um composto comprovadamente neurotóxico cujos mecanismos degenerativos ainda não estão bem esclarecidos. No sistema nervoso central o MeHg é seqüestrado do interstício preferencialmente por astrócitos diminuindo a carga de exposição neuronal. Estudos in vitro demonstraram que a prolactina (PRL) possui efeitos mitogênicos sobre astrócitos, além de regular a expressão de citocinas pró-inflamatórias. Este estudo teve por objetivo investigar efeitos protetores da prolactina sobre distúrbios provocados por MeHg na viabilidade, morfologia, expressão de GFAP (glial fibrillary acidic protein), mitogênese e liberação de interleucina-1β (IL-1 β) em cultivo glial de córtex cerebral de ratos neonatos focalizando as células astrogliais. A exposição a diferentes concentrações de MeHg (0,1, 1, 5 e 10 μM) a diferentes intervalos de tempo (2, 4, 6, 18 e 24 h) ocorreu em cultivos com 10% de soro fetal bovino (SFB). Os resultados obtidos demonstraram diminuição progressiva de 20% e 62% da viabilidade celular após exposição às concentrações de 5 e 10 μM MeHg no tempo de 24 h, respectivamente, pelo método do 3-4,5-dimetiltiazol-2-yl)-2,5-difenil tetrazólio bromide (MTT) e distúrbios na expressão e distribuição de GFAP. Diferentes concentrações de prolactina (0.1, 1 e 10 nM) foram adicionadas em meio sem soro fetal bovino (FBS) para avaliar sua ação proliferativa isoladamente. Esta ação foi confirmada com indução de mitogênese em cerca de 4.5x em 18 h de observação na maior concentração (10 nM PRL). Nestas condições (sem SFB) foram analisados os efeitos da associação de 1 nM PRL + 5μM MeHg em teste de viabilidade, expressão de GFAP, morfologia celular, índice mitótico e liberação de IL-1β com o objetivo de estudar possíveis efeitos citoprotetores deste hormônio. A PRL atenuou os distúrbios provocados pelo MeHg, aumentando a viabilidade em 33%, a expressão de GFAP, proliferação celular (4x) e atenuando os distúrbios morfológicos, incluindo picnose nuclear e lise. Adicionalmente, a PRL induziu amplificação da liberação de IL1β quando associada ao MeHg. Estes achados confirmam a hipótese de que a PRL possa atuar como um agente citoprotetor em cultura primária de glia e particulamente em astrócitos, ação esta aditiva aos seus efeitos mitogênicos.

Estudo in vitro da infectividade de espécies de Leishmania do subgênero Viannia em macrófagos peritoneais de camundongo BALB/c

Os parasitos do gênero Leishmania apresentam variações de infectividade intra e inter específicas. Entretanto, são escassas as informações a respeito da infectividade das espécies de Leishmania do Novo Mundo, principalmente, daquelas encontradas na região Amazônica brasileira, onde, até o presente momento são conhecidas seis espécies pertencentes ao subgênero Viannia causadoras de LTA. Diante disso, o objetivo do presente trabalho foi investigar, in vitro, o comportamento da infectividade de 5 espécies de Leishmania do subgênero Viannia em macrófagos peritoneais de camundongos BALB/c e sua correlação com a produção de óxido nítrico pelos macrófagos infectados. Trinta cepas de Leishmania foram distribuídas em seis grupos iguais, de acordo com as espécies seguintes: I- L. (V) braziliensis/LCL, II- L. (V) braziliensis/LCM, III- L. (V) guyanensis, IV- L. (V) shawi, V -L. (V) naiffi e VI- L. (V) lainsoni. As cepas foram cultivadas em meio RPMI suplementado com 10% de soro bovino fetal e 1% de penicilina-gentamicina, até atingir a fase estacionária de cultivo, quando foram usadas para infectar macrófagos na proporção de 4 parasitos/macrófago. As culturas foram incubadas a 35°C e 5% de CO2 e após 24h, as lamínulas foram coradas com Giemsa para contagem do número de parasitos e determinação do índice de infecção, enquanto a concentração de NO (nitrito) foi calculada pelo método de Griess. Observou-se que as cepas de L. (V) braziliensis/LCM apresentaram o maior índice de infecção (385), sendo este significativamente maior (P<0,005) que as cepas de L. (V) braziliensis/LCL (264), L. (V) naiffi (215) e L. (V) lainsoni (272), porém, não significativamente maior que os índices das espécies L. (V) shawi (292) e L. (V) guyanensis (300). Quanto aos níveis de NO (nitrito), detectou-se maior concentração para a espécie L. (V) naiffi (4,1µM e menor concentração para as cepas de L. (V) braziliensis/LCM (2,15µM). As demais espécies tiveram concentrações de: L. (v:) lainsom (3,14µM), L. (V) shawi (2,96µM), L. (V) guyanensis (2,76µM) e cepas de L. (V) braziliensis/LCL (3,1µM). Diante do exposto, concluímos que cepas de L. (V) braziliensis/LCM são mais infectivas do que as demais espécies estudadas e, também, mais infectivas que cepas homólogas isoladas de casos clínicos de LCL. Além disso, observou-se menor infectividade da espécie L. (V) naiffi. Desse modo, notou-se que os níveis de NO produzidos pelos macrófagos infectados foram inversamente proporcionais ao grau do parasitismo.

Estudo do microcultivo in vitro para o isolamento de Leishmania sp no estado do Pará

Os parasitas do gênero Leishmania apresentam uma variabilidade de espécies na região Amazônica e para sua correta identificação é necessário o isolamento dos mesmos. Atualmente para o isolamento do parasita e posterior diagnóstico da doença têm se utilizado a técnica de microcultivo in vitro. O objetivo de nosso trabalho foi otimizar a técnica de microcultivo in vitro para o isolamento de Leishmania sp. Para o isolamento, além do microcultivo, foi analisado a técnica de vácuo-aspiração adaptada e a viabilidade do parasita a temperaturas abaixo de 25ºC. No total foram utilizados 18 hamsters, infectados com amostras de casos clínicos de Leishmaniose tegumentar americana, sendo 3 de Leishmania.(Leishmania) amazonensis e 2 de Leishmania.(Viannia) braziliensis o qual foram realizados 56 cultivos por vácuo-aspiração em meio NNN, 12 em microtubos e 23 por microcapilares com RPMI suplementado, mantidos entre 25º e 31ºC. Para a segunda etapa, participaram 7 pacientes, totalizando 6 culturas por vácuo-aspiração e 42 por microcapilares. Conservou-se a baixa temperatura 7 tubos com NNN que foram mantidas a 5ºC. Foi observado que os isolamentos por vácuo-aspiração de amostras de L. (L.) amazonensis e L. (V.) braziliensis em hamsters foram sensíveis a adaptação da técnica, diferente das amostras de pacientes. A positividade variou entre 2 a 8 dias e 4 e 5 dias respectivamente. Os microtubos apresentaram positividade para as mesmas amostras de hamsters no período de 5 a 8 dias. Para as amostras dos pacientes, 2/12 tubos por vácuo-aspiração foram positivos e para isolamento em microcapilares 6/42, valores inferiores aos encontrados na literatura. A amostras conservadas a 5ºC apresentaram viabilidade até o 30º dia. Com estes resultados foi observado que o microcultivo é viável para uso dentro de nossa região, entretanto se mostrou limitado para o isolamento de amostras provenientes de pacientes. Devem-se utilizar outros meios de cultivo, de modo a observar o comportamento do parasito e também aperfeiçoar a coleta do material da lesão a fim de melhorar os resultados de isolamento.