A influência do sistema nitrérgico no cultivo in vitro de embriões bovinos

O Óxido Nítrico (NO-) é uma molécula de sinalização celular que regula o desenvolvimento embrionário pré-implantacional. Nós investigamos o papel do NO- no cultivo de embriões bovinos produzidos in vitro, através do uso de N-Nitro-L-Arginina Metil Ester (L-NAME), um inibidor da produção de NO-, e L-arginina (ARG), um precursor de NO-, em diferentes períodos de cultivo (ativação do genoma embrionário e compactação). Foram avaliados seus efeitos sobre as taxas de desenvolvimento, cinética do desenvolvimento, qualidade embrionária, e expressão gênica. Os embriões foram produzidos por maturação e fertilização in vitro de oócitos aspirados de ovários provenientes de abatedouro frigorífico. No experimento 1, as taxas de desenvolvimento foram avaliadas em SOFaa na presença de L-NAME em diferentes períodos: do 1º ao 4º dia de cultivo (LN1-4), do 4º ao 8º (LN4-8) e do 1º ao 8º dia de cultivo (LN1-8). A inibição foi prejudicial a partir do 4º dia de cultivo (grupos LN4-8 e LN1-8), ao reduzir as taxas de eclosão (17,3%±13,44 e 13,7%± 14,51, respectivamente, p<0,05). Entretanto, o efeito mais negativo ocorreu do 1º ao 8º dia (LN1-8) em que a taxa de blastocisto foi significativamente menor comparada ao controle (29,4%±3,72 vs 47,8%±11,34, respectivamente, p<0,05). Por isso no experimento 2, a ARG (1, 10 e 50mM) foi adicionada desde o 1º dia de cultivo. As taxas de blastocisto usando 1 e 10mM de ARG foram similares ao controle (48%±13,03 e 34,2%±3,92 vs 49,4%±4,82, respectivamente, p>0,05), mas 50mM prejudicou a taxa de desenvolvimento embrionário (10,7%±7,24, p<0,001). No experimento 3, ARG a 1mM foi adicionada do 5º ao 8º dia de cultivo. Foram observadas taxas de desenvolvimento similares ao grupo GLN (somente com glutamina). Mas comparada ao controle (sem ambos os aminoácidos), rendeu melhores taxa de eclosão (54,8%±6,9 vs 41,4%±11,47, respectivamente, p<0,05) e qualidade embrionária (84,8%±2,63 vs 52%±8,62, respectivamente, p<0,05), mas não de taxa de blastocisto (49,4%±6,5 vs 49,4%±4,8, respectivamente, p>0,05). Neste período a produção de NO- foi positivamente correlacionada com a taxa de eclosão (R²=96,4%, p<0,001) e a qualidade embrionária (R²=75,5%, p<0,05). Adicionalmente, embriões foram cultivados na presença de L-NAME e ARG simultaneamente (grupo ARG/LN), do 5º ao 8º dia de cultivo, e os transcritos de OCT-4 e INT-t foram quantificados por PCR tempo real. Foi encontrada expressão similar de OCT-4 (p>0,05), mas redução de 1,8x e 1,5x de INT-t em relação aos grupos controles ARG e GLUT (p<0,05), respectivamente. Esses dados fornecem evidências da contribuição do NO-, principalmente no período entre os estágios de mórula e blastocisto, para a melhoria da eclosão e qualidade embrionária. A produção de NO- é requerida para o desenvolvimento pré-implantacional de embriões bovinos produzidos in vitro, e pode ser mediada pela suplementação do meio de cultivo com ARG.

Análise imunohistoquímica da ADAMTS-1 e proteoglicanos no ameloblastoma e no tumor odontogênico cístico calcificante

O ameloblastoma e o tumor odontogênico cístico calcificante (TOCC) são tumores odontogênicos que tem origem do epitélio odontogênico, porém ainda não é conhecido o estímulo ou gatilho que leva à transformação neoplásica desses tumores. O comportamento biológico das lesões é distinto, pois o ameloblastoma é um tumor mais agressivo e com taxa de recorrência significativa. Já o TOCC é um tumor menos agressivo e raramente há recorrência e por esse motivo foi utilizado como controle no estudo. Portanto, a elucidação completa dos mecanismos pelos quais esses tumores odontogênicos apresentam tais comportamentos biológicos continua sendo um desafio para os pesquisadores. As c (A Disintegrin and Metalloproteinase with ThromboSpondin) são metaloendopeptidases que são dependentes de zinco em seu domínio catalítico. Essas enzimas possuem ampla atividade catalítica contra uma variedade de substratos como os proteoglicanos (agrecan, brevican e versican), que são proteínas presente na matriz extracelular (MEC). As ADAMTS exibem características estruturais que lhes conferem um grande potencial para exibir múltiplas funções. Exibem função crucial em vários processos como proliferação, adesão, invasão e sinalização celular. As alterações nessas enzimas estão presentes em diversos tumores, o que sugere que estas proteínas podem estar envolvidas no processo carcinogênico em diferentes caminhos. Especificamente a ADAMTS-1 tem sido correlacionada com a tumorigênese de algumas neoplasias como no câncer de mama, pulmão e pâncreas. Assim como a ADAMTS, agrecan, brevican e versican são expressos em vários tumores e a regulação alterada desses proteoglicanos pode contribuir para o desenvolvimento da carcinogênese. Neste trabalho foram estudadas ADAMTS-1, agrecan, brevican e versican no ameloblastoma e TOCC. Foram incluídos 20 casos de ameloblastoma e 6 casos de TOCC, utilizados como controle. A expressão de ADAMTS-1, agrecan, brevican e versican foi avaliada por imunohistoquímica e as áreas de marcação foram mensuradas e analisadas. Para análise de correlação entre as proteínas estudadas utilizou-se o teste de Spearman. Todas as amostras de ameloblastoma expressaram ADAMTS-1, agrecan, brevican e versican. Todas as amostras de TOCC também expressaram as mesmas proteínas, porém numa quantidade significativamente menor que no ameloblastoma. A diferença de expressão de ADAMTS-1 e brevican no epitélio do ameloblastoma e do TOCC foi significante estatisticamente (p<0,0105). Assim como a expressão de agrecan e versican, no epitélio do ameloblastoma e do TOCC, também foi estatisticamente significante (p<0,0067) e (p<0,0148), respectivamente. Não houve correlação entre as proteínas estudadas.