A influência do sistema nitrérgico no cultivo in vitro de embriões bovinos

O Óxido Nítrico (NO-) é uma molécula de sinalização celular que regula o desenvolvimento embrionário pré-implantacional. Nós investigamos o papel do NO- no cultivo de embriões bovinos produzidos in vitro, através do uso de N-Nitro-L-Arginina Metil Ester (L-NAME), um inibidor da produção de NO-, e L-arginina (ARG), um precursor de NO-, em diferentes períodos de cultivo (ativação do genoma embrionário e compactação). Foram avaliados seus efeitos sobre as taxas de desenvolvimento, cinética do desenvolvimento, qualidade embrionária, e expressão gênica. Os embriões foram produzidos por maturação e fertilização in vitro de oócitos aspirados de ovários provenientes de abatedouro frigorífico. No experimento 1, as taxas de desenvolvimento foram avaliadas em SOFaa na presença de L-NAME em diferentes períodos: do 1º ao 4º dia de cultivo (LN1-4), do 4º ao 8º (LN4-8) e do 1º ao 8º dia de cultivo (LN1-8). A inibição foi prejudicial a partir do 4º dia de cultivo (grupos LN4-8 e LN1-8), ao reduzir as taxas de eclosão (17,3%±13,44 e 13,7%± 14,51, respectivamente, p<0,05). Entretanto, o efeito mais negativo ocorreu do 1º ao 8º dia (LN1-8) em que a taxa de blastocisto foi significativamente menor comparada ao controle (29,4%±3,72 vs 47,8%±11,34, respectivamente, p<0,05). Por isso no experimento 2, a ARG (1, 10 e 50mM) foi adicionada desde o 1º dia de cultivo. As taxas de blastocisto usando 1 e 10mM de ARG foram similares ao controle (48%±13,03 e 34,2%±3,92 vs 49,4%±4,82, respectivamente, p>0,05), mas 50mM prejudicou a taxa de desenvolvimento embrionário (10,7%±7,24, p<0,001). No experimento 3, ARG a 1mM foi adicionada do 5º ao 8º dia de cultivo. Foram observadas taxas de desenvolvimento similares ao grupo GLN (somente com glutamina). Mas comparada ao controle (sem ambos os aminoácidos), rendeu melhores taxa de eclosão (54,8%±6,9 vs 41,4%±11,47, respectivamente, p<0,05) e qualidade embrionária (84,8%±2,63 vs 52%±8,62, respectivamente, p<0,05), mas não de taxa de blastocisto (49,4%±6,5 vs 49,4%±4,8, respectivamente, p>0,05). Neste período a produção de NO- foi positivamente correlacionada com a taxa de eclosão (R²=96,4%, p<0,001) e a qualidade embrionária (R²=75,5%, p<0,05). Adicionalmente, embriões foram cultivados na presença de L-NAME e ARG simultaneamente (grupo ARG/LN), do 5º ao 8º dia de cultivo, e os transcritos de OCT-4 e INT-t foram quantificados por PCR tempo real. Foi encontrada expressão similar de OCT-4 (p>0,05), mas redução de 1,8x e 1,5x de INT-t em relação aos grupos controles ARG e GLUT (p<0,05), respectivamente. Esses dados fornecem evidências da contribuição do NO-, principalmente no período entre os estágios de mórula e blastocisto, para a melhoria da eclosão e qualidade embrionária. A produção de NO- é requerida para o desenvolvimento pré-implantacional de embriões bovinos produzidos in vitro, e pode ser mediada pela suplementação do meio de cultivo com ARG.

Efeito do estradiol e da progesterona no desenvolvimento e na qualidade de embriões bovinos produzidos in vitro

Avaliaram-se o desenvolvimento e a qualidade de embriões bovinos, cocultivados com células epiteliais do oviduto bovino (CEOBs) expostas ou não ao estradiol e à progesterona. Os ovócitos foram maturados in vitro por 24h e, então, fertilizados utilizando-se sêmen congelado, em estufa de CO2 a 5% e 38,5oC. As CEOBs foram cultivadas em TCM-199 com ou sem estradiol (E2) (24 horas), nas mesmas condições da maturação e fertilização in vitro (MIV e FIV), e, em seguida, adicionadas aos diferentes grupos em CR2 com ou sem progesterona (P4) (G1=P4+E2); (G2=E2); (G3=P4) e (G4=controle). Após 18h da FIV, as células foram cultivadas nos diferentes sistemas. Nenhuma diferença (P>0,05) foi observada nas taxas de clivagem entre G1, G2 e G4 (53,5%; 56,3%; 51,7%) e nos padrões de blastocistos (BLs) (29,3%; 31,2%, 28,7%). Índices menores (P<0,05) foram obtidos no G3 para ambas as variáveis (34,5%; 16,4%). G1 e G2 apresentaram taxas de eclosão maiores (P<0,05) que os outros grupos (23,3%; 23,2%), sendo G4 (19,3%) diferente de G3 (16,1%). Em G1, G2 e G3, o número de células nos BLs aumentou 125,9; 128,4 e 123,6, respectivamente (P<0,05), em relação ao G4 (112,5). Conclui-se que o tratamento das CEOBs com o E2, nas primeiras 24 horas de cultivo, pode ser usado isoladamente ou em combinação com a progesterona, a fim de melhorar a qualidade de embriões bovinos produzidos in vitro.

Co-cultivo de embriões bovinos com células-tronco adultas derivadas de tecido adiposo

A produção in vitro de embriões (PIV) é uma biotecnologia utilizada para aumentar o potencial reprodutivo de animais geneticamente superiores, os embriões produzidos in vitro são de qualidade inferior aos produzidos in vivo, por isso técnicas tentam melhorar os índices de embriões produzidos in vitro. Uma técnica é o sistema de co-cultivo com células somáticas que removem metabólitos tóxicos e protegem contra o stress oxidativo. As células-tronco mesenquimais derivadas de tecido adiposo (CTA) são células multipotentes que segregam fatores de crescimento e citocinas. As células-tronco foram utilizadas em co-cultivo in vitro de embriões bovinos em diferentes concentrações com o objetivo de melhorar o protocolo de PIVE. CTAs foram submetidas à diferenciação em três linhagens mesenquimais, e foi realizada a imunofenotipagem de marcadores específicos de membrana das CTMs. A taxa de clivagem foi avaliada no segundo dia após a fertilização e taxa de blastocistos no sétimo dia, quando foram armazenados para contagem do número total de células e expressão gênica. Os resultados foram analisados por ANOVA, Teste-t e pós-teste de Fisher, adotando um nível de significância de 5%. O tratamento do co-cultivo com CTAs influenciou significativamente a formação de blastocisto, o número total de células de embriões e a expressão gênica correlacionada a pluripotência e metabolismo de carboidratos. Estes resultados mostraram aumento da taxa de produção e qualidade dos embriões produzidos in vitro em co-cultivo com CTAs em relação ao co-cultivo com células da granulosa. Os resultados deste trabalho indicam também que a presença constante de CTAs em co-cultivo é superior ao condicionamento com CTAs. Os efeitos verificados das CTAs podem ocorrer através de fatores solúveis ou via exossomos secretados pelas CTAs. Estudos futuros são necessários para esclarecer a possível via causadora dos efeitos positivos verificados neste trabalho pelas CTAs em co-cultivo.

Produção in vitro de embriões bovinos: uso da glutationa durante o processo de lavagem e capacitação espermática

O objetivo deste trabalho foi verificar o efeito da glutationa (GSH – 0,3mg/mL), no processo de separação, lavagem e capacitação espermática sobre a taxa de produção in vitro de embriões bovinos. O sêmen de um touro foi separado através de gradientes de Percoll e centrifugados duas vezes em meio de fecundação in vitro (lavagem). Espermatozóides foram capacitados in meio de FIV durante 1 h em estufa úmida a 38,5°C e 5% de CO2. Os grupos experimentais foram: Controle (não possui a etapa de lavagem; Grupo 1: sem GSH nas três etapas; Grupo2: GSH somente na capacitação; Grupo3: GSH somente na separação e na lavagem (primeira lavagem); Grupo 4: GSH em todas as etapas. Oócitos provenientes de abatedouro foram maturados in vitro e fertilizados após as preparações feitas no sêmen. Os embriões foram cultivados durante 7 dias com análise da clivagem no 2º dia, taxa de blastocisto e número total de células embrionárias no 7º dia. As taxas de desenvolvimento embrionário foram analisadas pelo qui-quadrado (χ2) e a qualidade embrionária pela ANOVA através do programa Bio Estat 3.0 (AYRES, et al., 2003) com nível de significância de 5%. Não houve diferença estatística efeito do uso da GSH nas diferentes etapas do processo de preparação espermática sobre as taxas de clivagem, blastocisto e eclosão (Grupo Controle: 52, 35 e 50%; Grupo 1: 60, 37 e 44%; Grupo 2: 57, 40 e 50; Grupo 3: 56, 37 e 51%; Grupo 4: 47, 30 e 48%, respectivamente, p>0,05). Também não foi observado diferença estatística quanto ao número de células embrionárias (Grupo Controle: 30,9±21,87, Grupo 1: 57,8±18,26; Grupo 2: 66,2±20,14; Grupo 3: 62,1±22,48; Grupo 4: 76,7±29,28; p>0,05).

Maturação in vitro de oócitos bovinos em meios suplementados com quercetina e seu efeito sobre o desenvolvimento embrionário

A quercetina é um flavonoide, amplamente encontrada em frutas, vegetais, grãos, flores, com elevada concentração no vinho tinto, e tem sido caracterizada funcionalmente pela atividade antioxidante. Para avaliação da maturação nuclear e do desenvolvimento embrionário bovino, os oócitos foram maturados por 22h na presença de quercetina (0,4, 2, 10 e 50µM), cisteamina (100µM) e na ausência dos antioxidantes. Os oócitos maturados foram corados com Hoechst para avaliação da maturação in vitro. Para avaliação do desenvolvimento embrionário, os oócitos foram fertilizados e cultivados in vitro, as taxas de desenvolvimento embrionário foram determinadas no sétimo dia de cultivo e o percentual de eclosão e o número de células dos embriões no oitavo dia. Os níveis de glutationa (GSH) dos oócitos foram mensurados por emissão de fluorescência com CMF₂HC. A porcentagem de maturação nuclear (±89%) não diferiu entre os grupos. O desenvolvimento embrionário variou entre os tratamentos, o percentual de blastocisto foi superior (P<0,05) nos grupos tratados com 0,4, 2, 10 e 50∝M de quercetina (56,9, 59,5, 53,6 e 49,6%, respectivamente) e com 100∝M de cisteamina (50,4%) em relação ao grupo controle (42,3%). Na comparação entre os dois antioxidantes, a quercetina (0,4 e 2µM) foi superior na produção de embriões (56,9 e 59,5%, respectivamente) em comparação com cisteamina (50,4%). As taxas de embriões eclodidos foram similares (P>0,05) entre os grupos (±63,0%). O número médio de células dos embriões também foi similar entre os grupos (±233). Os níveis intracelulares de GSH foram superiores nos oócitos maturados com cisteamina, mas similares entre os oócitos tratados com quercetina e o controle. A suplementação da maturação in vitro com antioxidantes melhora as taxas de blastocistos. A quercetina foi superior à cisteamina, que, por sua vez, foi superior ao controle. Mas os níveis de GSH foram superiores somente nos oócitos tratados com cisteamina.

Direct detection of Mycobacterium tuberculosis complex in bovine and bubaline tissues through nested-PCR

Post-mortem bacterial culture and specific biochemical tests are currently performed to characterize the etiologic agent of bovine tuberculosis. Cultures take up to 90 days to develop. A diagnosis by molecular tests such as PCR can provide fast and reliable results while significantly decreasing the time of confirmation. In the present study, a nested-PCR system, targeting rv2807, with conventional PCR followed by real-time PCR, was developed to detect Mycobacterium tuberculosis complex (MTC) organisms directly from bovine and bubaline tissue homogenates. The sensitivity and specificity of the reactions were assessed with DNA samples extracted from tuberculous and non-tuberculous mycobacteria, as well as other Actinomycetales species and DNA samples extracted directly from bovine and bubaline tissue homogenates. Regarding the analytical sensitivity, DNA of the M. bovis AN5 strain was detected up to 1.5 pg by nested-PCR, whereas DNA of M. tuberculosis H37Rv strain was detected up to 6.1 pg. The nested-PCR system showed 100% analytical specificity for MTC when tested with DNA of reference strains of non-tuberculous mycobacteria and closely-related Actinomycetales. A clinical sensitivity level of 76.7% was detected with tissues samples positive for MTC by means of the culture and conventional PCR. A clinical specificity of 100% was detected with DNA from tissue samples of cattle with negative results in the comparative intradermal tuberculin test. These cattle exhibited no visible lesions and were negative in the culture for MTC. The use of the nested-PCR assay to detect M. tuberculosis complex in tissue homogenates provided a rapid diagnosis of bovine and bubaline tuberculosis.

Inefficacy of albendazole sulphoxide and ivermectin for the treatment of bovine parasitic otitis caused by rhabditiform nematodes

O objetivo deste estudo foi avaliar a eficácia do sulfóxido de albendazol administrado oralmente e da ivermectina "pour-on" no tratamento da otite parasitária bovina causada por nematóides rhabditiformes. Dezoito vacas Gir apresentando otite clínica foram divididas em três grupos de seis animais cada. O primeiro não recebeu tratamento (grupo controle). O segundo foi tratado com ivermectina "pour-on" a 0,05% na dose de 500µg/kg de peso vivo. O terceiro grupo foi tratado com sulfóxido de albendazol oral a 6% na dose 6,0mg/kg. Os condutos auditivos de todos os animais foram reexaminados nos dias 7 e 21 pós-tratamento. Os animais do grupo controle permaneceram infectados nos dias de observação. O tratamento com ivermectina não demonstrou eficácia alguma para os dias 7 e 21 pós-tratamento. O tratamento com sulfóxido de albendazol obteve 16,7 e 25% de eficácia nos dias 7 e 21, respectivamente. Mais estudos são necessários para determinação de tratamentos eficazes para tal doença parasitária, especialmente através de vias alternativas de administração, por causa de seu significante impacto na criação de Bos taurus indicus nas Regiões Tropical e Subtropical.