Avaliação da técnica de aspiração ovocitária transvaginal (Ovum Pick Up) e produção in vitro de embriões da raça nelore (Bos taurus indicus) oriundos de doadoras com alterações da fertilidade

Este experimento teve como objetivo avaliar a possibilidade da utilização de fêmeas zebuínas de elevada qualidade genética, com problemas de fertilidade, adquiridos após um programa de transferência convencional de embriões, como doadoras de ovócitos em um programa de Ovum Pick Up e Produção In Vitro de embriões. Fêmeas da raça Nelore (n=16) (Bos taurus indicus), com idade média de 11 anos e 7 meses, foram submetidas às mesmas condições de ambiente, alimentação e manejo. Estes animais foram retirados do programa de T.E. por apresentarem problemas de fertilidade (cistos ovarianos, infecções genitais, mucometra e alguns casos de repetições de cio sem causa aparente). Os animais foram divididos em dois grupos conforme o tipo de patologia: GRUPO I (n=08) composto por animais que apresentaram patologias ovarianas (cistos) e GRUPO II (n=08) formado por animais com patologias extra ovarianas, ambos os grupos foram submetidos à aspiração folicular (OPU) utilizando dois tipos de agulhas (21G ; 19G ) e pressões (55 e 70mmHg) divididos em quatro tratamentos (T1 = 55/21G; T2 = 55/19G; T3 = 70/21G e T4 = 70/19G), posteriormente os ovócitos submeteramse a PIV. Foram realizadas 149 aspirações e colhidos 879 ovócitos (5,9 4,88) onde GRAU I = 16%; GRAU II = 43%; GRAU III = 21% e GRAU IV = 20%. As médias de ovócitos colhidos no GRUPO I foram (T1 = 7,06 5,10; T2= 7,00 3,64; T3 = 10,60 6,51 e T4 = 2,78 2,59) para os animais pertencentes ao GRUPO II obteve-se (T1= 4,90 4,47; T2= 2,93 3,05; T3 = 6,11 4,11 e T4 = 2,70 2,00). Para as médiasde ovócitos viáveis os resultados foram os seguintes: (T1 = 4,35 3,01; T2 = 4,88 2,96; T3 = 6,87 3,91 e T4 = 1,89 1,90) para o GRUPO I e (T1 = 2,70 2,22; T2 =1,92 1,98; T3 = 3,47 2,27 e T4 = 2,00 1,05) para o GRUPO II. Neste experimento foram levados à PIV 538 ovócitos dos quais 161 (32,85%) clivaram e 65 (13,26%) resultaram em Mórula ou Blastocistos. A análise estatística dos resultados não demonstrou diferença significativa entre os grupos quanto a colheita ovocitária. Quando analisada somente a pressão de sucção, foi observado que o tipo de agulha está diretamente relacionado a pressão da bomba de vácuo. Os melhores resultados foram obtidos com o tratamento T3 = 70/21G, além disso pode-se observar que as melhores médias de ovócitos colhidos foram as obtidas no grupo de animais que apresentaram cistos ovarianos (GRUPO I). Desta forma, concluímos neste experimento que a utilização da técnica de OPU/PIV é uma alternativa de grande utilidade no prolongamento da vida reprodutiva de animais zebuínos com alterações na fertilidade.

Estudo do microcultivo in vitro para o isolamento de Leishmania sp no estado do Pará

Os parasitas do gênero Leishmania apresentam uma variabilidade de espécies na região Amazônica e para sua correta identificação é necessário o isolamento dos mesmos. Atualmente para o isolamento do parasita e posterior diagnóstico da doença têm se utilizado a técnica de microcultivo in vitro. O objetivo de nosso trabalho foi otimizar a técnica de microcultivo in vitro para o isolamento de Leishmania sp. Para o isolamento, além do microcultivo, foi analisado a técnica de vácuo-aspiração adaptada e a viabilidade do parasita a temperaturas abaixo de 25ºC. No total foram utilizados 18 hamsters, infectados com amostras de casos clínicos de Leishmaniose tegumentar americana, sendo 3 de Leishmania.(Leishmania) amazonensis e 2 de Leishmania.(Viannia) braziliensis o qual foram realizados 56 cultivos por vácuo-aspiração em meio NNN, 12 em microtubos e 23 por microcapilares com RPMI suplementado, mantidos entre 25º e 31ºC. Para a segunda etapa, participaram 7 pacientes, totalizando 6 culturas por vácuo-aspiração e 42 por microcapilares. Conservou-se a baixa temperatura 7 tubos com NNN que foram mantidas a 5ºC. Foi observado que os isolamentos por vácuo-aspiração de amostras de L. (L.) amazonensis e L. (V.) braziliensis em hamsters foram sensíveis a adaptação da técnica, diferente das amostras de pacientes. A positividade variou entre 2 a 8 dias e 4 e 5 dias respectivamente. Os microtubos apresentaram positividade para as mesmas amostras de hamsters no período de 5 a 8 dias. Para as amostras dos pacientes, 2/12 tubos por vácuo-aspiração foram positivos e para isolamento em microcapilares 6/42, valores inferiores aos encontrados na literatura. A amostras conservadas a 5ºC apresentaram viabilidade até o 30º dia. Com estes resultados foi observado que o microcultivo é viável para uso dentro de nossa região, entretanto se mostrou limitado para o isolamento de amostras provenientes de pacientes. Devem-se utilizar outros meios de cultivo, de modo a observar o comportamento do parasito e também aperfeiçoar a coleta do material da lesão a fim de melhorar os resultados de isolamento.

Susceptibility of Cebus apella monkey (Primates: Cebidae) to experimental Leishmania (L.) infantum chagasi-infection

Na Amazônia Brasileira, o macaco Cebus apella (Primata: Cebidae) tem sido associado com o ciclo enzoótico da Leishmania (V.) shawi, um parasito dermotrópico causador da Leishmaniose Tegumentar Americana (LTA). Ele tem sido também empregado com sucesso como modelo experimental para estudo da leishmaniose tegumentar. Neste trabalho, foi investigada sua susceptibilidade à infecção experimental por Leishmania (L.) infantum chagasi, o agente etiológico da Leishmaniose Visceral Americana (LVA). Foram usados dez espécimes de C. apella oito adultos e dois jovens, quatro machos e seis fêmeas, todos nascidos e criados em cativeiro. Dois protocolos de infecção experimental foram feitos: i) seis macacos foram inoculados por via intradérmica (ID), na base da cauda com 2x106 formas promastigotas em fase estacionária de crescimento; ii) outros quatro macacos foram inoculados com 3x107 formas amastigotas de infecção visceral de hamsteres por duas vias diferentes: a) dois por via intravenosa (IV) e, b) outros dois pela via intraperitoneal (IP). A avaliação da infecção incluiu parâmetros: clínico: exame físico do abdômen, peso e temperatura corporal; b) parasitológico: aspirado de medula óssea por agulha para procura de amastigotas (esfregaço corado por Giemsa) e formas promastigotas (meio de cultura); c) imunológico: Reação de Imunofluorescência Indireta (RIFI) e, resposta de hipersensibilidade tardia (DTH). Nos seis macacos inoculados ID (formas promastigotas) todos os parâmetros de avaliação da infecção foram negativos durante o período de 12 meses. Entre os quatro macacos inoculados com formas amastigotas, dois inoculados IV mostraram parasitos na medula óssea do primeiro ao sexto mês p.i. e em seguida houve a resolução da infecção, no entanto os outros dois inoculados IP foram totalmente negativos. Esses quatro macacos apresentaram resposta específica de anticorpo IgG desde o terceiro mês p.i. (IP: 1/80 e IV: 1/320) até o décimo segundo mês (IP: 1/160 e IV: 1/5120). A conversão DTH ocorreu em apenas um macaco inoculado IV com uma forte reação na pele (30 mm). Considerando esses resultados, nós não recomendamos o uso do macaco C. apella como modelo animal para estudo da LVA.

Ativação partenogenética de oócitos maturados in vitro de Cebus apella

O objetivo deste trabalho foi avaliar a maturação oocitária in vitro (MIV) na espécie C. apella, relacionando com a expansão das células do cumulus e promovendo a produção in vitro de embriões (PIVE), por meio da ativação partenogenética e fecundação in vitro (FIV). Os oócitos puncionados dos folículos antrais medindo 2-9 mm de diâmetro foram classificados em desnudos (OD), com poucas células do cumulus (PCC) e complexo cumulus-oophorus intacto (CCO intacto). A expansão das células do cumulus foi analisada nos tempos de 0, 36 e 40 h de MIV e classificada em cinco categorias de expansão. A competência meiótica nos oócitos foi verificada pela extrusão do 1º corpúsculo polar (CP) após 40 h de MIV. Os oócitos foram divididos em 3 grupos para PIVE: grupo controle (FIV), ativação partenogenética utilizando 5 μM de ionomicina em associação com 2 mM de 6-DMAP ou em associação com 50 μM de roscovitina. Para a FIV, os espermatozóides obtidos do coágulo seminal, foram diluídos em água de coco em pó (ACP-118®) e submetidos ao resfriamento para serem levados posteriormente ao cultivo in vitro com os oócitos. O aumento no tempo da MIV e a presença de várias células do cumulus associadas aos oócitos proporcionaram maior expansão das células do cumulus, pois somente os CCO intactos alcançaram a expansão total em 40 h de MIV (p < 0,005). A presença das células do cumulus nos oócitos (PCC e CCO intactos) maturados in vitro por 40 h promoveu a competência meiótica (metáfase II) significamente mais elevada que os OD (p < 0,005). Após 6 h de resfriamento em ACP-118® e separação pelo método do swin-up, os espermatozóides utilizados na FIV possuíam 80% de motilidade e vigor 4. O tratamento com ionomicina/roscovitina promoveu a extrusão do 2º CP e formação pronuclear e com ionomicina/6-DMAP formou pronúcleos, sem extrusão do 2º CP. O protocolo utilizando a ionomicina/6-DMAP e da FIV originou as primeiras divisões embrionárias, observada pela taxa de clivagem. Os resultados encontrados sugerem que em C. apella a presença e a expansão total das células do cumulus estão relacionadas com a competência oocitária. A utilização dos oócitos maturados in vitro e dos espermatozóides diluídos e resfriados em ACP-118® promoveu a PIVE por diferentes métodos nesta espécie.

Hidatidose policística no Estado do Acre: contribuição para o diagnóstico, tratamento e prognóstico dos pacientes

A equinococose é uma zoonose cujos agentes etiológicos são helmintos do gênero Echinococcus. Há cinco espécies de Echinococcus, duas delas, o E. oligarthrus (Diesing, 1863) e o E. vogeli (Rausch & Bernstein, 1972) ocorrem apenas em zonas neotropicais. A equinococose pelo E. vogeli provoca cistos hidáticos múltiplos, principalmente no fígado dos hospedeiros intermediários, dos quais um deles é o ser humano. O pouco conhecimento acerca da doença faz com que o diagnóstico seja retardado ou até mesmo equivocado. A falta de sistematização nas indicações de tratamento também dificulta a avaliação dos resultados e prognóstico dos pacientes com lesões hepáticas e peritoneais causadas pelo E. vogeli. Neste trabalho, descrevemos o quadro clínico dos pacientes; propomos protocolo de classificação radiológica, utilizado na classificação da equinococose alveolar (E. multilocularis, Classificação “PNM”, Kern et al., 2006), que foi adequado também para a equinococose policística (E. vogeli); e descrevemos uma opção terapêutica para o tratamento dessa hidatidose que anteriormente só havia sido utilizada para casos de equinococose cística (E. granulosus, PAIR -Puncture, Aspiration, Injection, Reaspiration, Brunnetti et al., 2001). Uma coorte prospectiva foi iniciada no ano de 1999 e até 2009 foram incluídos 60 pacientes. Foram descritos os principais sintomas e sinais: dor no andar superior do abdome (65%) e hepatomegalia (60%) e os pacientes foram classificados conforme a Classificação “PNM” e submetidos a três modalidades terapêuticas: (i) quimioterapia com albendazol na dose de 10mg/Kg/dia, (ii) tratamento cirúrgico com ressecção dos cistos ou (iii) punção percutânea – PAIR. Após exclusão de 2 casos, por preenchimento inadequado do protocolo de pesquisa, os grupos foram assim distribuídos: terapêutica com albendazol: n=28 (48,3%; 28/58), terapêutica cirúrgica: n=25 (52,1%; 25/58) e PAIR: n=5 (8,1%; 5/58). Os resultados foram estratificados conforme o resultado da terapêutica: “Cura”, representada pelo desaparecimento das lesões após tratamento clínico ou cirúrgico; “Melhora clínica”, entendidas como pacientes assintomáticos, sem perda ponderal e com as funções fisiológicas preservadas; “Sem Melhora”, incluiu os pacientes que permaneceram sintomáticos; “Óbito”; e “Sem informação”, o acompanhamento não permitiu a conclusão sobre o desfecho. Nos três grupos terapêuticos a taxa de letalidade de 15,5% (9/58), “sem melhora” 1,7% (1/58), “melhora clínica” em 40,0% (23/58) e “cura” em 32,8% (19/58). Com relação ao desfecho “óbito”, não houve diferença entre as terapêuticas com albendazol ou cirúrgica com 4 (14,2%) e 3 (12%) óbitos respectivamente; porém, no primeiro grupo, albendazol, o desfecho “cura” foi de 4,3% (1/23) e “melhora clínica” 74,0% (17/23), enquanto que no grupo “cirurgia” a “cura” representou 71,0% (17/24) e “melhora clínica” com 16,7(4/24). A terapêutica “PAIR” foi associado a taxa de letalidade de 40% (2/5), cura em 20% (1/5) e melhora clínica em 40% (2/5). A Classificação “PNM” foi útil para indicar tipo terapêutica nos casos de hidatidose policística. Em conclusão, na série estudada a terapêutica cirúrgica apresenta melhor resultado que a terapêutica clínica quanto aos desfechos “cura” e “melhora clínica”. A terapêutica por PAIR necessita de mais estudos.

Caracterização do genoma de tumores bem diferenciados da tireóide por hibridização genômica comparativa em matriz (aCGH)

Os tumores bem diferenciados da tireóide representam mais de 95% das neoplasias malignas da glândula. A identificação pré-operatória dos carcinomas papilíferos está bem estabelecida através dos métodos de Punção aspirativa por Agulha fina e Ultrassonografia, com quase 100% de acurácia, enquanto os tumores foliculares significam um dilema para o cirurgião, visto que os métodos existentes não conseguem determinar com eficiência o diagnóstico sendo que 60-80% dos casos operados são benignos. Dessa forma, com o intuito de se analisar alterações genômicas do tipo variações no número de cópias (CNVs) que possam diferenciar esse tumor de outros tipos de doenças da tireóide, foram analisados 13 pacientes com doença tireoidiana (3 bócios, 2 hiperplasias, 4 adenomas foliculares e 4 carcinomas foliculares ) mais 1 individuo sadio através do método de aCGH, para identificação de CNVs que pudessem determinar com eficiência a presença de carcinoma folicular. Os achados foram confrontados com dados de carcinomas papilífero clássico (4 pacientes) e variante folicular (2 pacientes). Foram encontradas 725 CNVs na amostra, 703 dos pacientes com patologia. Dentre estas foram selecionadas 18 regiões mais frequentes. Houve um padrão de amplificação maior em pacientes jovens com adenomas e deleção em pacientes mais velhos. Os pacientes com carcinoma apresentaram taxas de CNVs muito próximas. Os carcinomas foliculares apresentaram padrões exclusivos de alteração nos cromossomos 8 e 12. Concluímos, assim, que os carcinomas foliculares da tireoide são uma patologia com um padrão exclusivo de alterações, não havendo correlação de progressão tumoral a partir de adenomas foliculares, sendo que duas regiões -8p22 e 12p13.32-p13.33, estão presentes em 100% e 75% das amostras respectivamente, podendo ser fortes candidatos a marcadores desse tipo tumoral.