Isolamento e quantificação de flavonóides e abordagem das atividades antioxidante e antimicrobiana de Jatropha gossypiifolia L.

Jatropha gossypiifolia L. (Euphorbiaceae), conhecida no Pará como pião-roxo, é utilizada no tratamento de hemorróidas, queimaduras, dores estomacais, entre outras doenças. Diante da importância do vegetal na região torna-se necessária a sua investigação visando contribuir para o seu aproveitamento no desenvolvimento de fitoterápicos. Para tanto, buscou-se determinar o perfil cromatográfico do extrato etanólico bruto (EEB), por cromatografia de camada delgada (CCD) e por cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE), o teor de flavonóides totais e dos flavonóides isolados no extrato. Foram realizados também ensaios de atividade antimicrobiana com o EEB e as frações obtidas a partir dele (frações hexânica, clorofórmica, acetato de etila e residual). A atividade antioxidante do extrato e suas frações também foi caracterizada. O material vegetal foi coletado no horto de plantas medicinais da EMBRAPA – Amazônia oriental e com ele preparou-se, por percolação, o EEB; utilizando um evaporador rotativo a baixa pressão, obteve-se o extrato seco que, posteriormente, foi fracionado por partição líquido-líquido sucessivamente com hexano, clorofórmio e acetato de etila. As frações obtidas foram também concentradas a baixa pressão. A fração acetato de etila foi novamente fracionada fornecendo uma fração acetona (FAct-II), uma nova acetato de etila (FA-II), metanólica (FM-II) e resíduo sólido (RS-II). FAct-II foi submetida a cromatografia líquida a média pressão obtendo-se as subfrações Fr SAc1-II e Fr SAc3-II denominadas de Jg1 e Jg2, respectivamente. A prospecção química no extrato e nas frações dos metabólitos foi realizada em triplicata, sendo evidenciada a presença dos seguintes polifenóis: taninos catéquicos e flavonóides. A análise por CCD foi realizada utilizando-se o eluente acetato de etila/ácido fórmico/ácido acético glacial/água (100:11:11:26), sobre gel de sílica de fase normal, sendo observadas zonas com fator de retenção 0,65, 0,72 e 0,77, reativas à solução de FeCl3. O cromatograma por CLAE do EEB apresentou três picos significativos (valores médios de tr: 13,24 min, 15,02 min e 16,00 min) cujos espectros são característicos de flavonóides. No calculo do teor de flavonóides, aplicando-se a média das leituras de absorvância (A: 0,874), chegou-se ao teor de 2,04%. A concentração encontrada para cada substância isolada foi de 340 μg para Jg1 e 406 μg para Jg2 por mililitro da solução de extrato. Quanto às atividades biológicas testadas, FA-I e FR-I inibiram o crescimento de S. aureus e C. albicans como também apresentaram maior potencial antioxidante. Os resultados fornecem parâmetros acerca de polifenóis adequados para o controle de qualidade como marcadores químicos, e teor de destes possíveis marcadores.

Estudo fitoquímico, avaliação da toxicidade oral aguda e da atividade antimalárica in vitro e in vivo das cascas de Parahancornia fasciculata (Poir.) Benoist (Apocynaceae)

Parahancornia fasciculata (Poir.) Benoist (Apocynaceae), também conhecida como Parahancornia amapa (Hub.) Ducke, é uma espécie vegetal empregada popularmente no tratamento da malária, infecções no útero, gastrite, anemia, problemas respiratórios, entre outros. Os objetivos do presente trabalho foram realizar o estudo fitoquímico, avaliar a toxicidade oral aguda e a atividade antimalárica in vitro e in vivo de extratos, frações e substância isolada obtidas a partir de cascas do caule de P. fasciculata. Foram realizados dois tipos de extrações com o pó das cascas de P. fasciculata, por maceração / percolação, com etanol 96°GL e diclorometano, esta última tendo sido realizada a com o pó das cascas alcalinizado com hidróxido de amônio, obtendo-se os extratos secos EEPF e EDAPF, respectivamente. Uma terceira extração foi realizada a partir do EEPF por aquecimento sob refluxo, sucessivamente, com Hex:DCM (1:1), AcOEt:DCM (1:1) e AcOEt. EEPF foi, também, submetido a fracionamento por extrações ácido-base resultando nas frações de neutros (EEPFN) e de alcalóides (EEPFA). A prospecção fitoquímica realizada com o EEPF foi desenvolvida por CCD em cromatoplacas de sílica gel tendo sido detectada a presença de triterpenos, esteróides, heterosídeos flavônicos, saponinas, polifenóis, taninos, heterosídeos antracênicos e heterosídeos cardiotônicos. EDAPF foi submetido à cromatografia em coluna de sílica gel. Foram recolhidas 30 frações sendo que as frações Fr1-3, Fr4, Fr5-7 e Fr11 concentraram a maior parte da massa do extrato cromatografado. Da Fr5-7 foi isolada uma mistura de ésteres do lupeol que representam os componentes majoritários do EDAPF. Esta fração passou por um processo de hidrólise alcalina e o produto obtido (Fr5-7Hid) foi analisado por espectrometrias no IV, RMN de ¹H e ¹³C e foi identificado como o triterpeno lupeol. A fração insolúvel em AcOEt obtida a partir do EEPF, por aquecimento sob refluxo, apresentou resultado positivo para o teste de proantocianidinas e foi submetido a doseamento desta classe de metabólitos. Os resultados foram expressos em porcentagem dos teores para a amostra não diluída (10,46±0,3419%), amostra diluída a 1:10 (9,94± 0,1598%) e amostra diluída a 1:100 (10,55± 0,9299%). A avaliação da atividade antiplasmódica in vitro em culturas de cepas W2 de Plasmodium falciparum foi realizada pelo teste da Proteína II Rica em Histidina (HRP-II) tendo sido testados EEPF, EEPFN, EEPFA, Fr1-3, Fr4, Fr5-7(ésteres do lupeol), Fr11 e o Fr5-7Hid (lupeol). Os melhores resultados obtidos foram para EEPF, EEPFA E EEPFN (CI₅₀= ~ 50 μg/mL) sendo considerados moderadamente ativos. As demais amostras apresentaram CI₅₀ > 50 μg/mL e foram consideradas inativas. Realizou-se também a avaliação da atividade antimalárica in vivo em camundongos fêmeas suíços infectados com cepas ANKA de P. berghei com o EEPF e o EEPF-HEX:DCM (1:1) em concentrações de 500, 250 e 125mg/kg de peso. EEPF foi parcialmente ativo, somente no 8° dia, em todas as concentrações. Já EEPF-HEX:DCM (1:1) foi parcialmente ativo na dose de 500mg/kg de peso e nas demais doses foi inativo. O teste de toxicidade oral aguda foi realizado em camundongos fêmeas suíços, pelo método da dose fixa (5.000mg/kg), com EEPF e não apresentou nenhum sinal de toxicidade evidente, o que foi confirmado pela ausência de alterações nos exames anátomohistopatológicos realizados.

Aplicação da cromatografia líquida de alta eficiência na investigação de hidrocarbonetos policíclicos aromáticos em testemunhos sedimentares

Hidrocarbonetos policíclicos aromáticos (HPAs) são compostos orgânicos originários de fontes naturais e antrópicas e, por apresentarem potencial carcinogênico e mutagênico, são considerados poluentes prioritários por agências ambientais. Desta forma, métodos analíticos para investigação de tais compostos que sejam rápidos e de baixo custo são de relevância considerável para o monitoramento ambiental. O presente trabalho teve como objetivos otimizar um método analítico para HPAs utilizando cromatografia líquida com detecção por arranjo de diodos (HPLC-DAD) e aplicar em testemunho sedimentar de região estuarina. Para otimização e avaliação do método, uma coluna sedimentar de 46 cm de comprimento foi coletada na foz do Rio Tucunduba (Belém, Pará) e seccionada em porções de 2 cm (subamostras). Após secagem, 30 g de cada porção foram extraídos com mistura de diclorometano em acetona (1:1) em ultrassom por 40 min. Os extratos obtidos foram centrifugados, purificados em sílica-gel, adaptação em funil necessária principalmente para reter partículas finas, e em seguida concentrados em rotaevaporador à vácuo e, por fim, filtrados com membrana de nylon 0,22 μm antes da injeção no HPLC. Amostras fortificadas com padrões analíticos de 16 HPAs e brancos também foram processados da mesma maneira. Um conjunto de parâmetros para validação do método foi investigado e observou-se: (1) boa linearidade: as curvas de calibração (analíticas) apresentaram coeficientes de correlação elevadas; (2) precisão adequada: obteve-se desvio padrão relativo dentro do aceitável, sendo o mínimo de 2,1% para acenaftileno e máximo de 19,7% para o fluoranteno; (3) limites de detecção baixos: entre 0,004 a 1,085 ng g g^-1, viabilizando análises em concentrações reais in situ; (4) recuperação adequada para traços: sendo a mínima de 40,0% para o acenaftileno e máxima de 103,1% para o benzo(k)fluoranteno. As concentrações de HPAs totais variaram nas seções do testemunho sedimentar entre 60,77 - 783,3 ng g^-1 de sedimento seco. O método otimizado mostrou-se vantajoso com relação aos tradicionais que utilizam extrator soxhlet e colunas de adsorventes para purificação de extratos por minimizar o tempo de extração e reduzir custos com uso de volumes menores de solventes para purificação do extrato. A limitação do método, porém, foi a coeluição do criseno e do benzo(a)antraceno e a sobreposição do fluoreno e acenafteno, além da quantificação benzo(g,h,i)perileno. Essa limitação provavelmente está associada à eficiência da coluna cromatográfica disponível para a análise, que é para aplicação geral. O método mostrou-se aplicável a amostras estuarinas complexas e ricas em silte e argila. Razões diagnósticas de HPAs parentais indicam fontes petrogênicas a profundidades de 24 – 26 cm, 28 – 30 cm; e fontes pirolíticas a profundidades de 6 – 8 cm, 10 – 12 cm e 14 – 16 cm respectivamente.

C25 steroid epimers produced by Penicillium janthinellum, a fungus isolated from fruits Melia azedarach

O fungo Penicillium janthinellum, obtido de Melia azedarach, produziu ergosterol, ergosterol 5a,8a-peróxido e uma mistura de esteróides C25 epiméricos de ocorrência restrita na natureza. Os esteróides C25, denominados neociclocitrinóis, possuem o mesmo sistema tetracíclico de anéis presente no ciclocitrinol, o qual foi isolado do fungo Penicillium citrinum, associado a uma esponja, com o mesmo esqueleto biciclo[4:4:1] nos anéis A/B, mas com cadeias laterais diferentes. O P. janthinellum isolado de M. azedarach, foi cultivado sobre milho branco e os três esteróides foram isolados por vários procedimentos cromatográficos e identificados por cuidadosa análise dos dados de RMN, principalmente correlações ¹H – ¹³C em duas dimensões bem como COSY e TOCSY ¹H – ¹H. A origem biossintética dos ciclocitrinóis é discutida.

Estudo fitoquímico e atividade antiplasmódica em Plasmodium falciparum (W2) de Himatanthus articulatus (Vahl) Woodson (Apocynaceae)

O presente trabalho descreve a análise fitoquímica e avaliação da atividade antiplasmódica em Plasmodium falciparum (W2) de Himatanthus articulatus (Vahl) Woodson. O extrato etanólico (EEHS) obtido por percolação do pó das cascas, após concentração, forneceu um precipitado (EEHSP) e um resíduo pastoso que foi submetido a liofilização (EEHS). Fracionou-se este por: re-extração sob refluxo, partição ácido-base e coluna cromatográfica de sílica gel. Além disso, submeteu-se o pó das cascas a extração com ácido clorídrico 1 N para separação de alcalóides. A prospecção fitoquímica, em CCD, foi realizada com EEHS e EEHSP, enquanto que EEHS, frações (FrDCM EEHS, FrAcOET EEHS e FrMeOH EEHS) e FAHS2 DCM foram analisadas por cromatografia líquida de alta eficiência acoplada a DAD (arranjo de diiodo-CLAE-DAD). FrAcOET EEHS foi fracioanda por coluna cromatográfica fornecendo uma substância isolada (S1). Analisou-se o EEHS, a fração majoritária obtida na coluna cromatográfica (F71), FAHS2 DCM e S1 por cromatografia liquida acoplada a espectrometria de massas (CL-EM). O espectro no infravermelho foi obtido para F71 e S1. A estrutura química de S1 foi definida como sendo o plumierídeo por ressonância magnética nuclear. A avaliação de atividade antiplasmódica foi realizada com EEHS, EEHSP, FrDCM EEHS, FrAcOET EEHS, FrMeOH EEHS, FAHS1 DCM, FAHS2 DCM, FAEEHS, FNEEHS, FNHS DCM e S1 pelo método da lactato desidrogenase parasitária (pLDH). Na prospecção fitoquímica, EEHS e EEHSP apresentaram resultados positivos para polifenóis e taninos, saponinas, triterpenos e esteroides, alcaloides e geninas flavônicas. EEHS e frações analisadas por CLAE-DAD mostraram os picos mais intensos sugestivos de iridoides, comprovados por CL-EM de EEHS que mostrou como substância majoritária o iridóide plumierídeo, coerente com o espectro no IV de F71 e S1 que revelou absorções de grupos funcionais presentes em iridóides. Nas análises destas por CL-EM, observou-se um pico a m/z 471 (M+H), atribuído ao íon pseudomolecular do plumierídeo e/ou isoplumierídeo. S1 foi identificada como plumierídeo. Até o presente momento não foi relatada a presença de alcaloides para a espécie, porém nas frações alcaloídicas (FAHS1 DCM, FAHS2 DCM, FAEEHS) e de neutros (FNEEHS e FNHS DCM) em análise por CCD revelada com reagente Dragendorff observaram-se manchas sugestivas de alcalóides, coerente com análise por CLAE-DAD de FAHS2 DCM, a qual mostrou pico majoritário com cromóforo sugestivo de alcaloide β-carbolínico. Em análises por CL-EM de FAHS2 DCM observou-se pico majoritário sugestivo do alcalóide 10-hidroxi-antirina-N-óxido com massa molecular 328 u. Os ensaios de atividade antiplasmódica foram negativos para EEHS, EEHSP, FrDCM EEHS, FrAcOET EEHS, FrMeOH EEHS, S1, FAEEHS, FAHS1 DCM, FNEEHS, FNHS DCM e moderadamente ativo (CI₅₀ 22,89 μg/mL) para FAHS2 DCM. Estes resultados indicam que a atividade antiplasmódica da planta pode se atribuída aos alcaloides, cuja presença em H. articulatus é descrita pela primeira vez.

Atividades antimicrobiana e antipromastigota de extratos e frações de Virola surinamensis (Rol ex Rottb.) Warb (Myristicaceae)

O presente estudo teve como objetivo avaliar as atividades antimicrobiana e antipromastigota de extratos de V. surinamensis e suas frações. Na obtenção dos extratos foram utilizados solventes de polaridade crescente (hexano, acetato de etila e metanol) e o extrato acetato de etila foi fracionado em coluna cromatográfica aberta, empregando como fase estacionária gel de sílica e como eluentes misturas de hexano e acetato de etila em gradiente de polaridade crescente. Para avaliação da atividade antimicrobiana utilizou-se o teste de difusão em Agar, sendo utilizados os seguintes microorganismos: Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa e Candida albicans. A fração ativa foi submetida à microdiluição, onde se determinou a concentração inibitória mínima (CIM). Na avaliação da atividade antipromastigota utilizou-se a Leishmania amazonensis e L. chagasi, sendo determinadas as concentrações inibitórias mínimas e Concentração Inibitória 50% (CI₅₀). Os extratos hexânico, acetato de etila e metanólico foram submetidos ao ensaio de difusão em Agar, não sendo observadas inibições do crescimento bacteriano e fúngico. Apenas a fração acetato de etila FA3, obtida do extrato acetato de etila, inibiu o crescimento do S. aureus no teste de difusão em Agar. Porém na microdiluição esta fração mostrou-se inativa (CIM>1000μg/mL). Apenas o extrato hexânico mostrou-se ativo em formas promastigota de L. amazonensis e L.chagasi. Em síntese, apenas o extrato hexânico mostrou-se ativo em formas promastigota de leishmanias.