Identificação e caracterização de genes vip e cry coleóptero-específicos em isolados de Bacillus thuringiensis

O objetivo deste trabalho foi identificar e caracterizar os genes cry3, vip1, vip2 e vip1/vip2 em uma coleção de 1.078 isolados de Bacillus thuringiensis potencialmente tóxicos para larvas de coleópteros. Foram utilizados pares de oligonucleotídeos iniciadores gerais obtidos a partir de regiões conservadas dos genes e do alinhamento de sequências consenso. Posteriormente, os isolados positivos foram caracterizados por meio da técnica de PCR‑RFLP, tendo-se utilizado enzimas de restrição específicas, para identificar novas subclasses de genes nos isolados. Cento e cinquenta e um isolados foram positivos para os genes avaliados, com maior frequência para o gene vip1/vip2 (139 isolados). Pela técnica de PCR‑RFLP, foram observados 14 perfis polimórficos, o que indica a presença de diferentes alelos e, consequentemente, de distintas subclasses desses genes.

Caracterização de novos isolados de Bacillus thuringiensis para o controle de importantes insetos-praga da agricultura

A bactéria Bacillus thuringiensis Berliner produz um corpo de inclusão paraesporal (cristal) de natureza proteica, formado durante a esporulação, que atua de forma eficiente no controle de insetos-praga de culturas economicamente importantes. Esse cristal é constituído de proteínas Cry, que são codificadas pelos genes cry; um isolado pode ser caracterizado pelo conteúdo de genes cry que apresenta. Visando caracterizar novos isolados no combate de insetos-praga pertencentes às ordens Lepidoptera e Coleoptera, 76 isolados bacterianos foram analisados molecularmente e tiveram seu potencial de controle avaliado por meio de bioensaios com larvas de Spodoptera frugiperda (J.E. Smith), Sphenophorus levis Vaurie e Tenebrio molitor Linnaeus. As análises moleculares indicaram 11 isolados (14,5% da coleção), contendo genes lepidóptero-específicos e 17 (22,37%) com genes coleóptero-específicos. As análises de patogenicidade revelaram dois isolados com alto potencial de controle para lagartas de S. frugiperda, um para larvas de S. levis e seis prejudiciais ao desenvolvimento das larvas de T. molitor. Esses isolados de B. thuringiensis podem ser promissores no controle biológico das referidas pragas.

Caracterização molecular de isolados de Flavobacterium columnare de tilapia do nilo e piracanjuba por meio de RAPD-PCR

Flavobacterium columnare is a cosmopolite bacteria and it is one of the main problem in Brazilian aquaculture, causing high mortalities index and economic damage. The main factors that contribute to columnaris disease are inadequate water quality, excess handling, high density of fish and temperature variations. For a successful epidemiological study and disease control, it is essential to differentiate the F. columnare from other yellow pigmentation bacteria. The present study used molecular techniques to characterize, by RAPD-PCR, two strains of F. columnare isolated from Oreochromis niloticus and Brycon orbignyanus. Data were analyzed as binary (0 and 1) and a genetic similarity matrix was generated by Jaccard's coefficient. Cluster analysis was performed by the neighbor joining method. The RAPD-PCR technique confirmed to be a usefull tool to obtain genetic profiles from F. columnare isolates based on the oligonucleotides used and to verify genetic similarity.

Associação de bioensaios e caracterização molecular para seleção de novos isolados de Bacillus thuringiensis efetivos contra Spodoptera frugiperda (J.E. Smith) (Lepidoptera: Noctuidae)

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq)

Atividade tóxica de isolados de Bacillus Thuringiensis a larvas de Aedes Aegypti (l.) (diptera: culicidae)

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq)

Crescimento e esporulação de isolados de Verticillium lecanii sob diferentes condições nutricionais

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)

Crescimento e esporulação de isolados de Verticillium lecanii sob diferentes fatores ambientais

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)

Seleção de isolados de Beauveria bassiana potenciais para o controle da traça-das-crucíferas

A traça-das-crucíferas, Plutella xylostella (Lepidoptera: Plutellidae), é considerada a principal praga das brássicas no mundo, sendo o uso de inseticidas o método mais usado para o seu controle. Assim, o objetivo desta pesquisa foi selecionar isolados de Beauveria bassiana com viabilidade para utilização no controle da traça-das-crucíferas. Dezessete isolados e um produto comercial de B. bassiana foram testados. Lagartas de segundo ínstar da traça-das-crucíferas foram pulverizadas com suspensão de conídios na concentração de 10(7) conídios mL-1. Para o bioensaio de concentração letal (CL) sete concentrações espaçadas em escala logarítmica foram testadas. Os isolados CCA/UFES-4, 18, 31 e 35 foram selecionados para o bioensaio de CL por causarem mortalidade confirmada superior a 90%. O isolado padrão ESALQ-447 e o produto comercial tiveram resultados semelhantes e também foram selecionados para o bioensaio de CL. Com base nas estimativas da CL50, os isolados CCA/UFES-4, 18, 31, ESALQ-447 e o produto comercial podem ser selecionados para utilização no controle da traça-das-crucíferas.

Caracterização molecular através da técnica fAFLP de isolados de Diaporthe citri

A citricultura é um mercado em expansão, principalmente no Estado de São Paulo, cuja importância na balança comercial já é reconhecida. Como em qualquer espécie cultivada, o crescimento das áreas de cultivo favorecem também o crescimento de problemas fitossanitários. Desta forma, as espécies de citros são afetadas por diversas doenças destacando-se entre elas a melanose, causada por Diaporthe citri (Wolf.), à qual a grande maioria das variedades comerciais são suscetíveis. O conhecimento da diversidade intra-específica é de grande importância, já que esta poderá auxiliar na seleção de variedades com resistência. O objetivo deste trabalho foi avaliar a variabilidade genética em isolados de Diaporthe citri, originários de diferentes locais, variedades e partes da planta, utilizando marcadores moleculares. Marcadores do tipo AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) foram utilizados para caracterização de dez isolados do patógeno. Os DNAs genômicos extraídos da massa micelial foram utilizados nas reações de amplificação. A técnica fluorescent AFLP permitiu a distinção dos isolados estudados, tendo sido classificados em quatro grupos distintos. Contudo, estes grupos não foram formados em razão da região geográfica, parte da planta ou variedade.

Seletividade da soja transgênica tolerante ao glyphosate e eficácia de controle de Commelina benghalensis com herbicidas aplicados isolados e em misturas

O objetivo do trabalho foi avaliar os possíveis efeitos fitotóxicos de herbicidas aplicados em pós-emergência, isolados e em misturas, na soja transgênica (cv. M-SOY 8008 RR) tolerante ao glyphosate e no controle de plântulas de Commelina benghalensis. Os experimentos foram desenvolvidos no período de janeiro a maio de 2006, em vasos, mantidos em condições de ambiente não controlado, no Departamento de Fitossanidade, UNESP, Campus de Jaboticabal (SP). Os tratamentos avaliados foram: glyphosate (1,20 kg ha-1 e.a.), chlorimuron-ethyl (0,02 kg ha-1), lactofen (0,18 kg ha-1), fomesafen (0,25 kg ha-1), flumioxazin (0,025 kg ha-1), imazethapyr (0,10 kg ha-1), chlorimuron-ethyl (0,01 kg ha-1) mais lactofen (0,096 kg ha-1), chlorimuron-ethyl (0,01 kg ha-1) mais fomesafen (0,125 kg ha-1), lactofen (0,096kg ha-1) mais fomesafen (0,125 kg ha-1), as misturas de glyphosate (0,60kgha-1) com chlorimuron-ethyl (0,01 kg ha-1), lactofen (0,096 kg ha-1), fomesafen (0,125 kg ha-1), flumioxazin (0,0125 kg ha-1), imazethapyr (0,05 kg ha-1) e uma testemunha sem aplicação de herbicida. No experimento com C. benghalensis, testou-se também a aplicação seqüencial de glyphosate (0,96 mais 0,72 kg ha-1 e.a.). A associação de ghyphosate a herbicidas utilizados em soja convencional ocasionou danos visuais às plantas de soja. em alguns casos, como nas misturas de glyphosate com lactofen e glyphosate com flumioxazin, os sintomas foram severos, com necroses e pontos cloróticos nas folhas. Mesmo assim, essa fitointoxicação não influenciou no desenvolvimento vegetativo e reprodutivo da soja. A mistura de glyphosate a outros herbicidas, assim como a sua aplicação seqüencial, não foram eficazes no controle de C. benghalensis, nas doses testadas e quando as plantas estavam no estádio de 4 a 6 folhas totalmente expandidas.

Patogenicidade de isolados de Beauveria bassiana para ovos, larvas e ninfas ingurgitadas de Rhipicephalus sanguineus

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)

Patogenicidade de isolados de três fungos entomopatogênicos a soldados de Atta sexdens sexdens (Linnaeus, 1758) (Hymenoptera : Formicidae)

As formigas cortadeiras atacam diversas culturas agrícolas, pastagens e os reflorestamentos, atuando sobre muitas espécies vegetais. O presente trabalho teve por objetivo avaliar a patogenicidade dos fungos Beauveria bassiana (isolados AM 9 e JAB 06), Metarhizium anisopliae (isolados E 9 e AL) e Paecilomyces farinosus (isolados CG 189 e CG 195) a soldados de Atta sexdens sexdens, em condições de laboratório. Após a coleta em formigueiro isento de produtos fitossanitários, exemplares de soldados foram cuidadosamente separados em grupos de oito indivíduos e, a seguir, banhados em suspensões contendo 1,0 x 10(6), 1,0 x 10(7), 1,0 x 10(8) e 1,0 x 10(9) conídios/mL de cada isolado. em seguida, cada grupo de formigas foi transferido para unidades de câmara úmida e mantido, sem alimentação, a 27 ± 1 ºC. A mortalidade foi verificada diariamente. Os três fungos se mostraram eficientes patógenos, pois provocaram alta mortalidade, matando mais que 80% dos soldados nos quatro primeiros dias após a inoculação. Os melhores isolados foram JAB 06 e AL, na concentração de 1,0 x 10(9) con./mL. Os isolados JAB 06, AL, CG 195 apresentaram maior capacidade de esporular nos cadáveres das formigas e os tempos letais decresceram com o aumento da concentração de conídios usada.

Relações filogenéticas e diversidade de isolados de Guignardia spp oriundos de diferentes hospedeiros nas regiões ITS1-5,8S-ITS2

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)

Variabilidade genética em isolados de Curtobacterium flaccumfaciens

A cultura do feijoeiro está sujeita à incidência de várias doenças que acarretam perdas significativas na produção, dentre as quais encontra-se a murcha-de-curtobacterium ou murcha bacteriana, causada por Curtobacterium flaccumfaciens pv. flaccumfaciens (Cff). Atualmente a murcha-de-curtobacterium tem se constituído em um novo problema para a cultura do feijoeiro em várias regiões brasileiras. A resistência genética tem sido o meio mais eficiente no controle da doença, porém a possibilidade da existência de variabilidade genética presente em isolados de Cff, pode ser uma conseqüência maléfica ao melhoramento visando a obtenção de cultivares de feijoeiro resistentes, especialmente na estabilidade e durabilidade da resistência. Neste sentido, o presente trabalho teve como objetivo o estudo da variabilidade genética de 26 isolados de Curtobacterium flaccumfaciens, 20 dos quais provenientes de feijoeiro (Cff), coletados em diferentes regiões do Brasil, quatro provenientes de coleções internacionais (Cff) e dois endofíticos de citros (C. flaccumfaciens). Foram utilizados dois pares de oligonucleotídeos, CffFOR2-CffREV4 e CF4-CF5, avaliando-se na especificidade em reação de PCR, para a caracterização dos 26 isolados. No estudo da variabilidade genética, utilizou-se da técnica rep-PCR e os iniciadores REP, ERIC e BOX. A partir do padrão eletroforético gerado pela amplificação dessas seqüências repetitivas no DNA genômico dos 26 isolados bacterianos, foram realizadas análises pertinentes (UPGMA SM) e obtenção de um dendograma. Considerando-se um índice de similaridade de 75%, os isolados foram distribuídos em quatro grupos distintos. Os isolados de Cff provenientes do Paraná e DF foram separados em grupos diferentes, enquanto que isolados endofíticos de citros não formaram um grupamento distinto dos de feijoeiro. Os isolados procedentes do Estados de São Paulo mostraram-se geneticamente heterogêneos, alguns se agruparam com o isolado de USA, Santa Catarina e de citros, enquanto outros agruparam-se com isolados provenientes da França e Paraná. A avaliação da especificidade dos dois pares de oligonucleotídeos, mostrou que os oligonucleotídeos CffFOR2-CffREV4 detectaram todos os 26 isolados. Os oligonucleotídeos CF4-CF5 apresentaram menor especificidade não detectando dois isolados de Cff de feijoeiro (2928) e (2936) e os isolados endofíticos de citros. Portanto como ferramenta para detecção de Cff em feijoeiro os oligonucleotídeos CffFOR2-CffREV4 revelaram ser os mais indicados.

Diversidade de Phytophthora parasitica isolados de Citrus usando seqüências de nucleotídeos da região ITS-5.8S rDNA

Realizou-se estudo para caracterização e verificação da diversidade genética de Phytophthora parasitica, agente causador da gomose dos citros. Quatorze isolados de Phytophthora parasitica, provenientes do Estado de São Paulo, foram seqüenciados a partir das regiões internas transcritas (ITS1 e ITS2) do gene 5.8S. Obtiveram-se seqüências de 812 pb a 860 pb que foram comparadas com seqüências de outras espécies de Phytophthora spp depositadas no NCBI. Foram feitos estudos filogenéticos, utilizando-se o método neighbor-joining com 1000 bootstrap e construído o dendrograma mais representativo. Obtiveram-se os resultados de 98,88% a 100% de similaridade genética entre os 14 isolados paulistas, e 99,5% a 98,8% entre estes e a seqüência de P. nicotianae (gi| 8927482) obtida do GenBank NCBI.