Diretrizes para diagnóstico morfológico em síndromes mielodisplásicas

As síndromes mielodisplásicas são reconhecidas como doenças que se originam nas células-tronco da medula óssea e que requerem avaliação sistemática e criteriosa de sangue periférico e medula óssea para seu correto diagnóstico. O objetivo deste relato é estabelecer os critérios morfológicos (cito-histológicos) como parâmetros para o diagnóstico de SMD em amostras de sangue periférico e medula óssea, com especial direcionamento aos hematologistas e patologistas clínicos que exercem a hematologia laboratorial na sua rotina de trabalho. Os principais achados morfológicos são listados no final deste relato, na forma de check-list, objetivando a sistematização sobre estes achados.

Determinação da expressão da molécula de adesão CD56 em plasmócitos no mieloma múltiplo através de estudo imuno-histoquímico

O papel das moléculas de adesão celular, na fisiopatologia do mieloma múltiplo (MM), tem sido alvo de vários estudos nos últimos anos. A expressão de CD56 pelos plasmócitos tumorais está associada a comportamento clínico menos agressivo da doença, e sua perda tem sido descrita na fase de leucemização plasmocitária. A determinação da expressão da molécula CD56 pelos plasmócitos tumorais pode ser obtida através de citometria em fluxo, revelando positividade em 55% a 78% dos casos. No presente estudo, objetivamos verificar a expressão da molécula CD56 por plasmócitos tumorais na medula óssea de portadores de MM, utilizando o estudo imuno-histoquímico das amostras histológicas obtidas ao diagnóstico. Analisamos as amostras de medula óssea de vinte portadores de MM, e realizamos o estudo imuno-histoquímico para determinação da expressão das cadeias leves kappa e lambda e da molécula CD56 pelos plasmócitos tumorais. A expressão da molécula CD56 foi importante em três casos, moderada em seis, discreta em quatro e negativa em sete. O estudo imuno-histoquímico mostrou-se válido para determinação da expressão de CD56 por plasmócitos tumorais em portadores de MM, fornecendo resultados semelhantes aos descritos para os obtidos por citometria em fluxo. Através do estudo imuno-histoquímico, foi possível observar variações da expressão da molécula CD56.

Linfoma não-Hodgkin de órbita: relato de caso

O objetivo é relatar manifestação incomum de linfoma não-Hodgkin de órbita. Paciente masculino, de 75 anos, se apresentou com queixa de lacrimejamento crônico bilateral. Havia feito dacriocistorrinostomia endonasal à direita e à esquerda por duas vezes, sem sucesso. Ao exame, massas de consistência fibroelástica, em topografia das bolsas de gordura das pálpebras inferiores e proptose axial. O paciente negava outros sintomas ou sinais sistêmicos. Hemograma sem alteração, hormônios tireoidianos normais. A tomografia computadorizada mostrava infiltrado difuso na órbita e proptose axial. Biópsia de gordura orbitária e de medula óssea diagnosticaram linfoma não-Hodgkin. O paciente foi tratado com quimioterapia, sendo em seguida submetido à cirurgia da via lacrimal bilateral, com resolução do quadro. A doença sistêmica que exigia diagnóstico e tratamento adequados para que se tivesse bom prognóstico estava mascarada pelo quadro de epífora bilateral.

Extração de DNA de materiais de arquivo e fontes escassas para utilização em reação de polimerização em cadeia (PCR)

Este trabalho visou a comparação de cinco métodos diferentes de extração de DNA de materiais de arquivo (tecidos incluídos em parafina, esfregaços de sangue periférico - corados e não corados com Leishman, lâminas com mielogramas, gotas de sangue em Guthrie Card) e de fontes escassas (células bucais, um e três bulbos capilares e 2 mL de urina), para que fossem avaliadas a facilidade de aplicação e a facilidade de amplificação deste DNA pela técnica da reação de polimerização em cadeia (PCR). Os métodos incluíram digestão por proteinase K, seguida ou não por purificação com fenol/clorofórmio; Chelex 100® (BioRad); Insta Gene® (BioRad) e fervura em água estéril. O DNA obtido foi testado para amplificação de três fragmentos gênicos: Brain-derived neutrophic factor (764 pb), Factor V Leiden (220 pb) e Abelson (106 pb). de acordo com o comprimento do fragmento gênico estudado, da fonte potencial de DNA e do método de extração utilizado, os resultados caracterizaram o melhor caminho para padronização de procedimentos técnicos a serem incluídos no manual de Procedimentos Operacionais Padrão do Laboratório de Biologia Molecular do Hemocentro - HC - Unesp - Botucatu.

Avaliação das subclasses IgG1 e IgG3 na doença hemolítica perinatal

A doença hemolítica perinatal (DHPN) ainda é um problema clínico. Nenhum teste isolado prediz, com segurança, a gravidade do quadro hemolítico. O objetivo do presente estudo foi determinar as subclasses de anticorpos IgG1 e IgG3 por citometria de fluxo no soro de 42 gestantes isoimunizadas e correlacionar os dados obtidos com a gravidade da DHPN. A distribuição dos fetos ou neonatos segundo a gravidade do quadro hemolítico evidenciou 13 casos com doença leve, 16 casos com doença moderada e 13 com doença grave. As subclasses foram detectadas em 33/42 (79%) amostras. A subclasse IgG1, isoladamente, foi evidenciada em 14/33 (42,4%) casos. Na relação entre gravidade da doença e subclasses de IgG, observou-se que IgG1 isolada foi encontrada em todos os grupos, e os valores da mediana de intensidade de fluorescência (MIF) foram significativamente mais altos nas formas mais graves da DHPN (p<0,01). Contrariamente, os valores da MIF para IgG3 se apresentaram mais homogêneos em todas as categorias (p=0,11). A presença de IgG3 parece, portanto, estar mais associada à hemólise leve. A associação das subclasses IgG1 e IgG3 está relacionada à situação clínica mais grave, o que se deve, possivelmente, à presença de IgG1 associada. Apesar dos altos valores para IgG1 e a associação de IgG1 com IgG3 indicarem maior gravidade da DHPN, sugere-se que outras variáveis sejam analisadas conjuntamente, uma vez que os relatos existentes na literatura, até o momento, não dão suporte para seu uso como instrumento exclusivo de avaliação de gravidade e prognóstico da doença.

Conjugação e validação de controle isotípico IgG1-FITC para uso em citometria de fluxo

Em meados da década de 50 iniciou-se o desenvolvimento da citometria de fluxo, tecnologia que permite verificar características físico-químicas de células ou partículas suspensas em meio fluido. Esta tecnologia utiliza anticorpos monoclonais marcados com fluorocromos como ferramenta de investigação em diversas análises e necessita de controles isotípicos para definição da região negativa (background). Estes controles são constituídos por imunoglobulinas de mesmo isotipo e fluorocromo dos anticorpos testes, sendo o isotiocianato de fluoresceína (FITC) o marcador fluorescente mais utilizado na conjugação de anticorpos. Os controles isotípicos têm como função definir a fluorescência inespecífica (células negativas) e as regiões fluorescentes (células positivas). No presente estudo foi selecionado anticorpo monoclonal murino (AcMm) dirigido contra antígeno eritrocitário canino, produzido no Laboratório de Anticorpos Monoclonais do Hemocentro de Botucatu, o qual reage positivamente com hemácias de cães, mas nunca com leucócitos humanos, tendo, portanto, potencial utilidade como controle negativo em citometria de fluxo. A purificação do AcMm da subclasse IgG1 foi feita por cromatografia de afinidade em Proteína-A Sepharose, e o controle da purificação realizado por eletroforese em géis de ágarose e poliacrilamida (SDS-PAGE). A imunoglobulina purificada foi conjugada ao FITC e filtrado em coluna de Sephadex G-25 para separação das proteínas marcadas e não-marcadas. O AcMm conjugado foi testado contra hemácias de cães, e o êxito da conjugação comprovado por testes de fluorescência, sendo a mediana de positividade de 94,70. Frente a leucócitos humanos a mediana de positividade foi 0,03 contra 0,50 dos reagentes comerciais. Os testes estatísticos não-paramétricos de Wilcoxon e correlação de Spearman comprovaram a eficiência e validam o controle isotípico produzido em comparação aos reagentes comerciais testados.

Evaluation of castor oil-based polyurethane membranes in rat bone-marrow cell culture

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq)

Efeito da idade e sexo sobre a concentração sérica de eritropoietina em equinos da raça Árabe

A EPO é um fator de crescimento glicoprotéico sintetizado pelas células adjacentes aos túbulos proximais renais regulada via mecanismo de feed back envolvendo a tensão de oxigênio tissular. Na baixa tensão de oxigênio arterial, a produção de EPO aumenta causando uma maior produção de eritrócitos na medula óssea. Devido ao pouco conhecimento da concentração de EPO sérica em equinos e a ausência de trabalhos sobre o efeito da idade e sexo sobre a sua concentração o trabalho teve como objetivo comparar a concentração sérica de eritropoietina em equinos da raça Árabe de sexos e idades diferentes. Foram utilizados 31 equinos da raça Árabe, com idades de seis a 12 meses (jovens) e acima de 24 meses (adultos), sendo 13 machos (seis jovens e sete adultos) e 18 fêmeas (oito jovens e 10 adultas), clinicamente sadios. As amostras de sangue foram colhidas por venipunção jugular e o soro armazenado até o momento do processamento. A concentração sérica de eritropoetina foi determinada pelo método de radioimunoensaio (RIA) utilizando kit comercial (EPO Trac TM125I RIA, Diagnostic Systems Laboratories, Webster, Texas, USA). Para análise estatística dos dados utilizou-se o Teste t de Student ao nível de 5% de significância (P<0,05). Não foram observadas diferenças significativas (P<0,05) quando se compararam os animais divididos entre sexos e as idades de seis a 12 meses (jovens) e acima de 24 meses (adultos). Conclui-se que a concentração de eritropoietina em equinos da raça Árabe independe do sexo e idade, e pode ser utilizada como valores de referência, porém ressalta-se a necessidade da obtenção de valores de referência para cada laboratório.

Valores de ferritina sérica em beta talassemia heterozigota

A low iron level, the commonest nutritional deficiency in the world, is a public health problem in developing countries. on the other hand, an excessive amount of iron is toxic, causing several organic dysfunctions, such as diabetes, cirrhosis, endocrinopathies and heart disease. Researchers have reported an association of iron overload with beta-thalassemia. The aim of this paper was to compare the serum ferritin levels of women with the beta-thalassemia trait. The results of serologic tests of 137 women of childbearing age were analyzed; 63 had the beta-thalassemia trait and 74 had Hb AA. In the beta-thalassemia carriers, the median ferritin value was 51.90 ng/mL and in the non-carriers 31.60 ng/mL (p = 0.0052). Levels of less than 20 and above 150 ng/mL were observed in 28% and 3% of the non-carriers and in 16% and 11% of the carriers, respectively. With these results it is possible to conclude that women in the reproductive age with the beta-thalassemia trait present higher ferritin levels in the northeastern region of São Paulo State. Further studies are necessary to clarify possible genetic and/or environment factors which interfere in iron absorption.

Investigação de hemoglobinopatias em sangue de cordão umbilical de recém-nascidos do Hospital de Base de São José do Rio Preto

As hemoglobinopatias são as doenças genéticas mais freqüentes na população humana. Cerca de 12 a 15% da população é portadora de uma ou mais formas de hemoglobinas anormais, resultando em um grande problema de saúde pública. O diagnóstico neonatal possibilita o tratamento e o aconselhamento genético precoce, incluindo a conscientização dos portadores sobre o risco do nascimento de homozigotos. O objetivo deste trabalho é apresentar os resultados da investigação de hemoglobinopatias em recém-nascidos do Hospital de Base de São José do Rio Preto. O estudo foi realizado em 913 amostras de sangue de cordão umbilical, que foram submetidas a testes eletroforéticos, bioquímicos e citológicos, específicos para análise de hemoglobinas. Foram identificadas 100 (10,95%) amostras com hemoglobinas anormais, das quais 40 (4,38%) com Hb Bart's, sugerindo alfa talassemia, 34 (3,72%) com Hb S, 23 (2,52%) com beta talassemia, duas (0,22%) com Hb C e uma (0,11%) amostra apresentou Hb rápida. A frequência elevada de alterações encontradas evidencia a necessidade da triagem neonatal de hemoglobinopatias que pode resultar em amplos benefícios para os portadores destas patologias e seus familiares.

Interação entre Hb C [beta6(A3)Glu>Lys] e IVS II-654 (C>T) beta-talassemia no Brasil

Thalassemias are a heterogeneous group of inherited disorders characterized by a microcytic hypochromic anemia and an imbalance in the synthesis of the globin-chains. Hb C is the second most frequently variant of hemoglobin found in Brazil. The laboratory diagnosis of hemoglobinopathies, including thalassemias, is growing in importance, particularly because of an increasing requirement for neonatal diagnosis of abnormal hemoglobins. Screening tests were carried out using alkaline and acid electrophoresis, globin-chain analysis by cellulose acetate in alkaline pH, isoelectric focusing and HPLC. The molecular characterization was made by PCR-ASO for Hb C and beta thalassemia mutants. Large-scale screening and discriminative methodologies must provide information about the hemoglobin polymorphisms in Brazilian population. HPLC is a powerful tool in these cases. Molecular characterization is important to genetic counseling and clinical management, in particular for the Brazilian population that have an intense racial admixture, with great variability of hemoglobins. In this paper an association between Hb C and beta thalassemia (IVS-II-654) in a black family from Brazil was described.

Interação entre Hb B2 e Hb S

As hemoglobinopatias e talassemias constituem as afecções genéticas mais comuns, apresentando-se, na maioria dos casos, em heterozigose. Diante da diversidade de hemoglobinas variantes encontrada na população brasileira, metodologias específicas e complementares para um diagnóstico laboratorial preciso, capaz de elucidar possíveis interações entre estas variantes genéticas, são necessárias. Este relato de caso descreve a interação entre hemoglobina B2 e a hemoglobina S em um indivíduo do sexo feminino, caucasoide, proveniente da região Sudeste do Brasil, identificada por meio de técnicas eletroforéticas em diferentes pH, cromatografia líquida de alta performance e PCR- RFLP. Visto que a hemoglobina B2 coelui com a hemoglobina S na análise cromatográfica e dificilmente é visualizada em eletroforese pH alcalino, devido à sua baixa concentração, justifica-se a necessidade da associação de testes laboratoriais, inclusive moleculares, na rotina do diagnóstico de hemoglobinas para a correta identificação do perfil de hemoglobinas do indivíduo e real frequência na população brasileira. Rev. Bras. Hematol. Hemoter.

The identification of beta-thalassemia mutants in Brazilians with high Hb F levels

As hemoglobinopatias são um grupo de afecções genéticas que representam problema de saúde pública em muitos países em que sua incidência é alta, com significativa morbidade. Objetivamos identificar defeitos moleculares que pudessem explicar o perfil laboratorial obtido por eletroforese e HPLC com Hb F elevada, em um grupo de indivíduos adultos sem sinais ou sintomas de anemia. Encontramos cinco diferentes mutações que originam beta talassemia por PCR-ASO: três casos com CD 6 (-A), um CD 39, um IVS 1-5, um -87 todas de origem mediterrânea, e um IVS II-654 de origem asiática. As mutações CD 6 (-A), -87 e IVS II-654 foram descritas pela primeira vez na população brasileira.