Sexagem de embriões bovinos fecundados in vitro pela técnica de PCR multiplex

Neste trabalho, a técnica de PCR (polymerase chain reaction) foi utilizada para a sexagem de 92 embriões bovinos fertilizados in vitro. Os embriões originaram-se de fertilização in vitro de oócitos aspirados de ovários de fêmeas bovinas, provenientes de abatedouros comerciais. Os oócitos foram maturados, fertilizados e cultivados até o estádio de blastocisto. Os embriões foram lavados em solução de PBS, transferidos para tubos de polipropileno contendo água ultrapura, e imediatamente congelados a -196ºC. Os embriões foram descongelados sobre isopor contendo gelo picado e tratados com proteinase K. Para a reação de PCR, utilizaram-se alíquotas de 34 µl de cada tudo, onde foram acrescidos dois pares de primers, seqüência BC1.2 e seqüência satélite 1.715, desoxinucleotídeos, MgCl2, tampão PCR 10X, TaqDNA polimerase e água, em um volume final de 50 µl. As amostras foram amplificadas e a eletroforese realizada em gel de poliacrilamida a 8%. Os géis foram corados com solução de brometo de etídio e analisados em transiluminador de luz ultravioleta. Um índice de 93,47% de amplificação foi atingido, com 41 embriões (47,67%) machos e 45 (52,32%) embriões fêmeas. O uso de gel de poliacrilamida a 8% foi eficaz na separação de fragmentos de DNA muito próximos.

Avanços metodológicos na seleção do sexo de espermatozóides bovinos para utilização no melhoramento genético e na produção animal

O mercado demanda, desde final da década de 20, uma tecnologia para a sexagem de espermatozóides que possa ser inserida na indústria de produção de sêmen congelado e que tenha as seguintes características: a) não altere a viabilidade espermática; b) seja compatível com a congelação do espermatozóide sexado; c) permita a sexagem de espermatozóides previamente congelados e descongelados; d) permita a produção de várias doses de sêmen sexado congelado por dia, com custo compatível ao mercado. A importância dessa tecnologia para maximizar a produção animal a um custo baixo tem sido um desafio da pesquisa a vários anos. A possibilidade de produzir, em escala comercial, doses de sêmen enriquecidas com espermatozóides X ou Y aumentará os benefícios do uso da inseminação artificial no seu papel de maximizar o progresso genético entre gerações de acordo com os requerimentos de cada programa de melhoramento animal. Diferentes rotas tecnológicas são percorridas na tentativa de selecionar-se o sexo em mamíferos, tanto nas espécies de interesse zootécnico quanto em espécies ameaçadas de extinção, animais de companhia. Neste sentido, existem duas alternativas: a separação de espermatozóides portadores do cromossomo X, daqueles portadores do cromossomo Y; ou a sexagem de embriões pré-implantados. A viabilidade da sexagem de espermatozóides em bovinos é esperada por muitos anos e os desenvolvimentos recentes tornaram essa tecnologia de aplicação commercial. Entretanto, muitas limitações ainda existem, principalmente, referente à taxa de gestação em condições de campo. Isso restringe a utilização dessa tecnologia no melhoramento genético e produção animal. Nessa palestra abordaremos os potenciais sistemas de criação e produção que poderão beneficiar-se com a sexagem de espermatozóides, quando essas limitações forem solucionadas.

Sexagem de espermatozoides bovinos por centrifugação em gradiente descontínuo de densidade de Percoll

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)

Transmission electron microscopy for characterization of acrosomal damage after Percoll gradient centrifugation of cryopreserved bovine spermatozoa

The objective of this study was to characterize acrosomal ultrastructure following discontinuous Percoll gradient centrifugation of cryopreserved bovine sperm. Semen was collected from six bulls of different breeds and three ejaculates per bull were evaluated. Frozen semen samples were thawed and the acrosomal region of sperm cells was evaluated by transmission electron microscopy (TEM) before (n = 18) and after (n = 18) Percoll centrifugation. The evaluation of 20 sperm heads from each of the 36 samples analyzed ensured that a large number of cells were investigated. The data were subjected to analysis of variance at a level of significance of 5%. Percoll centrifugation reduced the percentage of sperm exhibiting normal acrosomes (from 61.77 to 30.24%), reduced the percentage of sperm presenting atypical acrosome reactions (from 28.38 to 4.84%) and increased the percentage of sperm exhibiting damage in the acrosome (from 6.14 to 64.26%). The percentage of sperm with typical acrosome reactions was not significantly different before (3.70%) and after (0.67%) centrifugation. TEM distinguished four different types of acrosomal status and enabled ultrastructural characterization of acrosomal injuries. The percentage of sperm exhibiting normal acrosomes decreased and damage in the acrosome was the most frequent acrosomal injury with the Percoll gradient centrifugation protocol utilized.

Assessment of field fertility and several in vitro sperm characteristics following the use of different Angus sires in a timed-AI program with suckled Nelore cows

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)

Effect of breed and corpus luteum on pregnancy rate of bovine embryo recipients

The objective of this study was to evaluate pregnancy rates of recipients of different breed groups (Nellore and crossbreed), as well as the effects of size and type of the corpus luteum (CL) on plasmatic concentrations of progesterone and pregnancy rates of embryo recipients. A total of 152 heifers were synchronized with progesterone implants and on the day of embryo transfer, previously obtained by superovulation and frozen in ethylene glycol, the diameter and type of the corpus luteum (cavitary and compact) was measured and blood was collected for progesterone measurement. The pregnancy rate was 44.1%, with a diameter of corpus luteum higher in recipients that became pregnant (2.03±0.41) compared with non-pregnant ones (1.86±0.34 cm). Plasmatic concentrations of progesterone did not differ between pregnant (1.50±1.05) and non-pregnant (1.31±0.91 ng/mL) animals. The type of corpus luteum did not influence the pregnancy rates. Only Angus and crossbred Marchigiana differ among themselves in pregnancy rates (33.3 and 59.2%, respectively). The pregnancy probability was affected only by CL diameter, but not by P4 plasmatic concentration. Selection of the corpus luteum size at the time of embryo transfer is an important factor to increase pregnancy rates in recipients, and compact and cavitary corpora lutea do not influence the pregnancy rates of bovine embryo recipients. Nellore recipients have pregnancy rates that are satisfactory and comparable to crossbred (Bos taurus × Bos indicus) recipients.

Effects of glycosaminoglycan polysulphate on the organisation of collagen fibres in experimentally induced tendonitis in horses

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)

Infestation of froghopper nymphs changes the amounts of total phenolics in sugarcane

The increased rate of sugarcane harvest without previous burn has provided a very favorable environment to the froghopper Mahanarva fimbriolota (Stal, 1854), with high Moisture and low temperature variation. Few works have Studied the response of sugarcane to this pest, so little is known about resistant cultivars. Plant phenolics are widely studied compounds because of their known antifierbivore effect. This research aims to determine if the attack of M.fimbriolata nymphs stimulates the acccumulation of total phenolics in sugarcane. The experiment was carried Out in greenhouse and arranged in completely randomized design, in a 3 x 2 x 4 factorial with three replications. Second instar nymphs of M. fimbriolota were infested at the following rates: control, 2-4 and 4-8 nymphs per pot (first-second infestations, respectively). Pots were covered with nylon net and monitored daily to isolate the effect of leaf Sucking adults. Leaf and root samples were collected and kept frozen in liquid nitrogen until analyses. Infested plants showed higher levels of phenolics in both root and leaf tissues. In roots, the cultivar SP80-1816 accumulated more phenolic compounds in response to the infestation of M. fimbriolata. on the other hand, higher levels were found in leaves and roots of control plants of SP86-42, which might be an indication of a non-preference mechanism. The increase of total phenolics in sugarcane infested with root-sucking froghopper nymphs does not seem to be useful to detect the resistance to this pest.

Produção in vitro de embriões bovinos: utilização de diferentes fontes de gonadotrofinas na maturação dos oócitos

O presente trabalho foi conduzido com o objetivo de avaliar o efeito da utilização de diferentes fontes de gonadotrofinas para maturação in vitro dos oócitos bovinos fecundados e desenvolvidos in vitro sobre as taxas de clivagem (TC) e de blastocistos (TBL). Oócitos imaturos provenientes de ovários de vacas de abatedouro foram submetidos a maturação in vitro sob diferentes condições: meio TCM 199, acrescido de 10% de soro de vaca em estro (SVE), aditivos, hepes, NaHCO3, piruvato de sódio, antibióticos (meio B-199), 20 UI/mL de PMSG e 10 UI/mL de hCG (PMSG/hCG) ou meio B-199, acrescido de 5 mig/mL de FSH e 5 mig/mL de LH (FSH/LH). Seguidos 24 h de cultura a 38,5ºC em atmosfera com 5% de CO2, os oócitos maturos foram incubados com sêmen descongelado durante 18 a 21 horas. Após esse período, os oócitos foram transferidos para placas contendo microgotas de meio Ménezo suplementado com 10% de SVE e células epiteliais do oviduto bovino em suspensão, cobertas com óleo de silicone, os quais permaneceram em cultura por mais 9 dias. Os dados foram analisados pelo teste do Qui-quadrado. A TC e a TBL, para PMSG/hCG e FSH/LH, foram 60 e 13,9% e 61,2 e 10,6%, respectivamente. Não houve diferença entre os tratamentos com relação a TC ou a TBL. Esses resultados sugerem que ambas as fontes de gonadotrofinas podem ser utilizadas para maturação in vitro dos oócitos fecundados e desenvolvidos in vitro.

Desempenho, parâmetros plasmáticos e características de carcaça de novilhos alimentados com farelo de girassol e diferentes fontes energéticas, em confinamento

Avaliaram-se consumo, desempenho, parâmetros plasmáticos e características de carcaça de 24 novilhos, 3/4 Simental 1/4 Nelore, com peso médio inicial de 370 kg. As dietas foram compostas por 55% de silagem de milho e diferentes fontes energéticas: milho (MI) e substituição parcial do milho pela casca de soja (CS) ou pelo farelo de gérmen de milho (FGM), tendo como fonte de proteína o farelo de girassol. O período de avaliação de consumo e ganho de peso foi de 49 dias. Foram realizadas amostragens de sangue para mensuração dos parâmetros plasmáticos: glicose, uréia, proteína total e albumina. As meia-carcaças direitas resfriadas foram utilizadas para medir a área de olho de lombo (AOL), a espessura de gordura (EG) e o comprimento de carcaça. As dietas não influenciaram os parâmetros plasmáticos. A média obtida para uréia plasmática foi elevada (26,1 mg/dL). As diferentes fontes energéticas não afetaram o ganho de peso e a conversão alimentar, com médias de 1,15 kg/dia e 9,17 kg de MS ingerida/kg de ganho. Não houve efeito sobre o rendimento de carcaça (52,8% peso final e 63,11% PCV), AOL (63,6 cm²) e EG (4,7 mm). O grão de milho pode ser substituído parcialmente pela casca de soja e pelo farelo de gérmen de milho, em dietas para novilhos em confinamento, sem afetar o desempenho e as características de carcaça, permitindo que a escolha entre esses ingredientes seja realizada pela análise econômica.

Características químicas, microbiológicas e sensoriais de leite de cabra congelado

O objetivo deste trabalho foi avaliar as modificações químicas, microbiológicas e sensoriais do leite caprino pasteurizado e congelado durante armazenamento por 90 dias. Foram realizadas análises para caracterização química da matéria prima utilizada nos experimentos (gordura, acidez Dornic, densidade, extrato seco total, pH e ácidos graxos livres-AGL) e caracterização microbiológica (contagem total, psicrotróficos, coliformes totais e fecais). Utilizou-se pasteurização lenta a 63°±1°C por 30 minutos para as amostras de leite seguido de armazenamento em freezer à temperatura de -18°C±1°C. Nos tempos 0, 30, 60 e 90 dias de congelamento foram efetuadas análises químicas (pH, acidez e AGL), microbiológicas (contagem total, psicrotróficos e coliformes) e sensoriais (sabor e aroma característico, sabor e odor estranho e aparência geral). Também, realizou-se análise sensorial do leite nos tempos zero e com 90 dias de armazenamento, após descongelamento e homogeneização em liquidificador por dois minutos. Foi observado que o congelamento prolongado do leite pasteurizado não alterou significativamente suas características químicas e microbiológicas. Apenas a acidez apresentou decréscimo significativo. No entanto, a qualidade do leite do ponto de vista sensorial apresentou modificações significativas, com perdas de sabor e aroma característicos e declínio acentuado da aparência geral durante o armazenamento. A homogeneização do leite em liquidificador, após o descongelamento melhorou a aparência geral e a aceitação do produto pela equipe de provadores.

Elaboração de um queijo análogo ao pecorino romano produzido com leite de cabra e coalhada congelados

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)

Qualidade de fruto da aceroleira cv. Olivier em dois estádios de maturação

A acerola é um fruto de grande potencial econômico e nutricional devido ao seu alto teor de vitamina C, destacando-se como alimento funcional. É comercializada principalmente na forma de polpa congelada e fruto in natura. O objetivo deste estudo foi avaliar a qualidade dos frutos da aceroleira cv. Olivier em dois estádios de maturação. Para tanto, foram colhidas amostras de frutos em um pomar comercial no município de Junqueirópolis-SP. Foram realizadas a determinação da cor externa dos frutos e análises das características químicas de teor de sólidos solúveis, pH, acidez titulável, açúcares redutores, 'ratio' e ácido ascórbico de frutos semi-maduros e maduros. Os resultados obtidos permitiram concluir que os frutos semimaduros apresentaram maior acidez total, menor teor de sólidos solúveis e menor concentração de açúcares; no entanto, estes frutos apresentaram maiores teores de vitamina C, expressa em ácido ascórbico. Portanto, quando se buscam altos índices de vitamina C, os frutos devem ser colhidos num estádio de maturação menos avançado, com coloração alaranjada. O estudo demonstrou também que a cv Olivier produz frutos com características adequadas tanto para o mercado in natura quanto para a indústria, apresentando boa coloração e características químicas dentro dos padrões para esta fruta.

Preservação do inóculo de Plasmodiophora brassicae utilizando o método de congelamento

A preservação das estruturas de resistência de Plasmodiophora brassicae, em condições laboratoriais, é dificultada pelo fato de se tratar de um parasita obrigatório. O método de congelamento, utilizando freezer, comum foi testado com o objetivo de viabilizar a sobrevivência e a preservação de suas características infectivas. Raízes de diferentes brássicas, naturalmente infectadas por P. brassicae, contendo sintomas típicos de hérnia, de uma mesma propriedade localizada no município de Pardinho, Estado de São Paulo, foram coletadas em diferentes épocas e imediatamente congeladas, em freezer, a aproximadamente -20ºC. Os tratamentos foram divididos da seguinte maneira: T1: hérnias congeladas por 389 dias (rúcula); T2: hérnias congeladas por 242 dias (brócolis); T3: hérnias congeladas por 21 dias (couve chinesa) e T4: testemunha (sem inóculo). Os testes de patogenicidade, após diferentes períodos de armazenamento, foram realizados em condições de casa de vegetação (25±2ºC). Cada planta de uma variedade suscetível de couve-chinesa (Pak choi) foi inoculada com 2mL da suspensão de esporos de cada tratamento, na concentração de 10(7) esporos.mL-1. Cada tratamento contou com seis repetições distribuídas em blocos ao acaso. Passadas cinco semanas após a inoculação, as raízes das plantas foram lavadas e avaliadas. Houve diferença significativa entre os tratamentos. Os materiais congelados, entre 21 a 242 dias preservaram suas características infectivas, mostrando que o método de congelamento em freezer, nesse período, pode ser uma boa opção para a preservação das estruturas de resistência deste patógeno.

Lesão por esmagamento do nervo isquiático de ratos: estudo da vascularização

Este trabalho teve como objetivo estudar as alterações microvasculares intraneurais aguda em nervo isquiático de rato submetido a esmagamento por diferentes cargas. Foram utilizados 60 ratos machos da linhagem Wistar, distribuídos em grupos experimentais de acordo com a injeção de vasos e com a carga de esmagamento. Os nervos isquiáticos direitos foram isolados e submetidos ao esmagamento com cargas (0,5 Kg, 1 Kg, 5 Kg, 10 kg e 15 kg) por 10 minutos e os nervos isquiáticos esquerdos foram utilizados como controle. Após esmagamento, os animais foram submetidos à cateterização da aorta abdominal e injeção dos vasos, em seguida 30 nervos direitos e esquerdos foram fixados em formol 10%, desidratados e diafanizados para análise longitudinal dos vasos intraneurais e os restantes retirados em toda a sua extensão, cortados em 3 fragmentos, congelados em isopentano em gelo seco e armazenados em freezer -70°C, seccionados transversalmente para análise e contagem dos vasos intraneurais. As análises macroscópica e microscópica mostraram regiões de hematoma endoneural e epineural nas diferentes cargas de esmagamento. A análise morfométrica sugere que a lesão aos vasos intraneurais foi proporcional à carga de esmagamento, causando hematoma endoneural e epineural, que cria microambiente desfavorável para a regeneração das fibras nervosas.