Clonagem de sequ��ncias codificantes de citocinas felinas para constru����o de curva padr��o para PCR em tempo real

A quantifica����o de citocinas felinas possibilita uma avalia����o do sistema imune do animal em diferentes doen��as, permite tamb��m a identifica����o de diferentes fatores que alteram sua secre����o, e colabora na compreens��o da patog��nese das enfermidades. Em humanos e camundongos essa mensura����o �� feita principalmente pelo m��todo de ELISA, mas para os felinos h�� uma menor disponibilidade de kits espec��ficos para determinadas citocinas, e estes possuem um custo elevado. Assim, uma alternativa �� utilizar a rea����o de PCR em tempo real com transcri����o reversa (RT-qPCR) para quantifica����o absoluta dos RNAs mensageiros das citocinas felinas, uma t��cnica bastante sens��vel e espec��fica para analisar a express��o desses genes. Com esse intuito, esse trabalho teve como objetivo clonar as sequ��ncias g��nicas codificantes de citocinas, para construir uma curva padr��o para a qPCR. Assim, foi feita extra����o de RNA de amostras de sangue total de gatos dom��sticos, e estes foram tratados com DNAse para evitar contamina����o por DNA gen��mico. O cDNA foi sintetizado, e amplificado com os primers espec��ficos para cada fragmento codificante de citocina e o GAPDH felino. Cada amplicon purificado foi inserido em um plasm��deo comercial, e introduzido em bact��rias E. coli cepa DH5���. Os clones recombinantes foram sequenciados para confirmar a inser����o do fragmento no vetor. As curvas padr��o da qPCR foram constru��das com cada plasm��deo recombinante numa de 106 a 101 c��pias por rea����o. O sequenciamento mostrou que todos os clones eram semelhantes ��queles encontrados no GenBank. A efici��ncia das amplifica����es, baseado no slope das curvas padr��o foram: 101,3% para GAPDH, 99,1% para IL-1, 83,2% para IL-6, 94,4% para IL-10, 105,5% para IL-12, 83,4% para IFN-��� e 83,8% para TNF-. O valor de r2 foi de 0,99 em todas as rea����es. Dessa forma, com a clonagem dos fragmentos... (Resumo completo, clicar acesso eletr��nico abaixo)

Padroniza����o da t��cnica de PCR em tempo-real na avalia����o da pluripot��ncia de c��lulas-tronco mesequimais caninas

Este relat��rio final tem como objetivo apresentar as atividades desenvolvidas no per��odo de janeiro/2009 a mar��o/2010, pela aluna Thaila Isabel Wodewotzky, relativas ao projeto de conclus��o de curso intitulado ���Padroniza����o da T��cnica de PCR em tempo-real na Avalia����o da Pluripot��ncia de C��lulas-tronco Mesenquimais Caninas���, para fins de obten����o do t��tulo de Bacharel em Ci��ncias Biol��gicas. O referido projeto objetiva avaliar a quantifica����o e relev��ncia dos n��veis de express��o g��nica do fator de transcri����o Oct4 em CTM��s, por meio da padroniza����o da t��cnica de PCR em tempo-real. Para tanto, o RNA total das CTM��s obtidas, isoladas e cultivadas a partir da medula ��ssea de c��es foi extra��do a partir da medula ��ssea de c��es a fim de avaliar a quantifica����o e relev��ncia dos n��veis de express��o g��nica do Oct4 por meio da utiliza����o da t��cnica de PCR em tempo-real com transcri����o reversa (RT-qPCR). O RNA total foi extra��do e submetido �� rea����o de transcriptase reversa, para a obten����o do cDNA. Posteriormente esse cDNA foi utilizado na padroniza����o da t��cnica de qPCR utilizando primers desenhados a partir de sequ��ncias obtidas no genebank. . Como normalizador utilizou-se o RNA codificante de GAPDH.Verificou-se desempenho satisfat��rio dos primers para Otc4 na avalia����o de CTM��s de c��es. Tamb��m o RNAm do GAPDH foi adequado como normalizador. Dessa forma, esse sistema pode ser utilizado na realiza����o de testes quantitativos utilizando amostras de c��lulas-tronco embrion��rias caninas

Aplica����o de conjugado de microesferas de poliestireno para preparo de RNA no diagn��stico da cinomose canina por RT-qPCR

Funda����o de Amparo �� Pesquisa do Estado de S��o Paulo (FAPESP)

Pat��genos periodontais: compara����o entre cultura bacteriana e PCR em tempo real para teste diagn��stico

The correct distinguishment of microorganisms involved in the periodontal disease pathogen, it is important in the understanding of its progression and adequate treatment planning. Considering this fact, some molecular methods of identification and quantification were developed and are extremely sensitive and precise in the characterization of different bacteria species. The present study aimed to realize a literature review, including studies that realized a comparative analysis between bacterial culture and real time PCR methods in the identification of pathogens. The bacterial culture method can possibly identify new microorganisms and realize antibiotics sensitivity tests. The real time PCR is a microbiologic test that identifies and quantifies bacterial species, through gene amplification of predetermined DNA fragments, with high sensitivity and specificity, and need a shorter operation time of the operator when compared to the bacterial culture method. In this way, to determine a specific diagnostic test, should be considered not only its precision in the identification of microorganisms, but the cost-benefit relationship as well.

DDRT-PCR approaches applied for preeminent results in the isolation of DETs from fish brain tissues

Funda����o de Amparo �� Pesquisa do Estado de S��o Paulo (FAPESP)

Caracteriza����o das esp��cies de leishmania em sangue perif��rico de c��es por PCR-RFLP NA ��rea end��mica de Bauru/SP

P��s-gradua����o em Ci��ncia Animal - FMVA

Detec����o do herpes v��rus felino tipo 1 (HVF-1) pela t��cnica de PCR em tempo real e sua associa����o com sinais oculares em uma poipula����o de gatos dom��sticos

Funda����o de Amparo �� Pesquisa do Estado de S��o Paulo (FAPESP)

Improving DNA extraction quality by the salting-out method to prepare blood samples for real-time PCR.

Funda����o de Amparo �� Pesquisa do Estado de S��o Paulo (FAPESP)

Differentiation of Haemonchus placei from Haemonchus contortus by PCR and by morphometrics of adult parasites and third stage larvae

Funda����o de Amparo �� Pesquisa do Estado de S��o Paulo (FAPESP)

Detection of Trypanosoma vivax using PCR and LAMP during aparasitemic periods

Funda����o de Amparo �� Pesquisa do Estado de S��o Paulo (FAPESP)

Validation of absolute quantitative real-time PCR for the diagnosis of streptococcus agalactiae in fish

Funda����o de Amparo �� Pesquisa do Estado de S��o Paulo (FAPESP)

Detec����o de Histophilus somni (Haemophilus somnus) no s��men bovino mediante rea����o em cadeia pela polimerase (PCR)

The present study evaluated the use of PCR for Histophilus somni detection in bovine semen. Semen samples were experimentally infected with H. somni at dilutions ranging from 107 to 101 bacteria/mL and subjected to DNA extraction by the phenol/chloroform method, followed by PCR amplification. The amplification products were analyzed by electrophoresis in 8% acrylamide gel. The oligonucleotide primers used yielded an amplification fragment of 400 base pairs from the bacterial DNA. Positive amplification was obtained even for the 101 bacteria/mL dilution. PCR proved to be an efficient method for the detection of H. somni. The results obtained in this study have brought relevant information for the diagnosis of H. somni, justifying the need for the diagnosis of this bacterium in bulls, especially in semen samples that should be free of contamination. The PCR method has shown to be a useful tool for the quality control of semen produced in artificial insemination centers.

Avalia����o da dilui����o do DNA extraido de material parafinado para amplifica����o em PCR

Introduction: Several reasons may lead to the failure of polymerase chain reaction (PCR) using DNA purified from paraffin-embedded materials: presence of inhibitors and degradation of target DNA. DNA dilution will often reduce the concentration of potential inhibitors and still contain enough DNA to allow PCR amplification. Objective: To evaluate the dilution influence of DNA purified from paraffin-embedded materials on ��-globin PCR amplification. Material and Method: Paraffin-embedded blocks from 30 patients with oropharynx squamous cell carcinomas, diagnosed and treated at the Oral Oncology Center were selected. DNA extraction was performed using QIAmp minikit (Quiagen). DNA was quantified and evaluated for purity by spectrophotometer analysis. Two groups were formed with different amounts of DNA: group I had the originally extracted DNA and group II had the same DNA, however diluted with ultrapure water addition. PCR was performed in both groups using oligonucleotides for human ��-globin gene. Results: For Group I, amplification of the ��-globin gene sequence was successful in 33.33% of the samples and for Group II, in 23.33%. Conclusion: Dilution of the DNA extracted of paraffin-embedded materials did not modify statistically the amount of positive samples ��-globin gene amplified in PCR, although the results suggest that this is a way to increase the method for efficacy amplification of PCR.

Detec����o precoce e quantifica����o de v��rus da cinomose por PCR quantitativa em Tempo Real (qPCR) em diferentes tecidos e fluidos de um c��o

A cinomose �� uma doen��a de desafio diagn��stico, especialmente quando n��o h�� hist��rico de vacina����o. O objetivo deste estudo foi detectar e quantificar part��culas virais de cinomose em diferentes fluidos e tecidos biol��gicos de um c��o, determinando o melhor tecido para diagn��stico viral ante mortem na fase de viremia. Atendeu-se um c��o adulto com manifesta����es cl��nicas inespec��ficas e corp��sculos de Sinegaglia Lentz em linf��citos. Amostras post mortem foram submetidas a PCR em tempo real (qPCR), que demonstrou RNA viral em concentra����es de (x105) em l��quor (1.216), bexiga (1.009), c��rebro (605), sangue (572), cerebelo (523), rins (373), f��gado (257), pulm��es (191), est��mago (154), terceira p��lpebra (70) e urina (2,1). A t��cnica de qPCR permitiu confirmar a infec����o pelo v��rus, descartando vacina����o recente. A amostra de l��quor mostrou-se representativa para diagn��stico molecular de fase aguda de cinomose no animal estudado.

Indu����o de resist��ncia a Tomato severe rugose virus e Tomato chlorosis virus em tomateiro determinado

Coordena����o de Aperfei��oamento de Pessoal de N��vel Superior (CAPES)