Modelos de cura: aplicação ao cancro da mama feminino

A Análise de Sobrevivência tem como objetivo o estudo do tempo desde um instante inicial bem definido até ao acontecimento de determinado evento. Por exemplo, poderá ser o tempo de vida de um indivíduo desde o momento em que lhe é diagnosticada uma doença até a sua morte ou cura. Com a evolução da medicina, começou a se verificar a existência de indivíduos para os quais nunca se observava o acontecimento de interesse e designaram-se esses indivíduos por curados, imunes, ou não suscetíveis. Assim, da Análise de Sobrevivência clássica surgem os modelos de cura. Neste trabalho, aplicaram-se estes conceitos a uma base de dados referentes a 833 mulheres diagnosticadas com cancro da mama, entre 1998 e 2005. Verificou-se a existência de um risco de morte maior em mulheres na faixa etária dos 50 a 59 anos. Comprovou-se que o estadiamento tem um papel preponderante em relação ao prognóstico, sendo que, quanto mais avançado o estadio pior o prognóstico. Dos tratamentos a que os doentes foram submetidos, a realização de cirurgia é indicativa de um melhor prognóstico, assim como a realização de hormonoterapia e de radioterapia. No entanto, este último tratamento não se revelou estatisticamente significativo para o modelo de regressão de Cox. A realização de quimioterapia apenas reflete um melhor prognóstico nos primeiros dois anos, o que já não acontece a partir dai. Esta caraterística inesperada ficou-se a dever à esperança de vida que o tratamento oferece aos doentes no estadio IV e da associação entre a existência de gânglios metastizados e o agravamento do prognóstico, no caso do estadio II. O modelo de cura foi aplicado apenas ao grupo de mulheres no estadio IV, pois só neste caso se admitiu que o tempo de follow-up era suficiente, obtendo-se uma taxa de cura de 7;4%.

Estabelecimento do perfil metabolómico volátil da urina e saliva, como estratégia não-invasiva, para a deteção de potenciais biomarcadores de diferentes tipos de cancro

Com este trabalho pretendeu-se estabelecer o perfil metabolómico volátil de amostras de fluidos biológicos, nomeadamente saliva e urina, de pacientes com cancro da mama e do pulmão e de indivíduos saudáveis (grupo controlo), utilizando a Microextração em Fase Sólida em modo headspace (HS-SPME) seguida de Cromatografia Gasosa acoplada à Espectrometria de Massa (GC-MS). Efetuou-se a comparação entre os perfis voláteis dos grupos estudados com o objetivo de identificar metabolitos que possam ser considerados como potenciais biomarcadores dos tipos de cancro em estudo. De modo a otimizar a metodologia extrativa, HS-SPME, foram avaliados os diferentes parâmetros experimentais com influência no processo extrativo. Os melhores resultados foram obtidos com a fibra CAR/PDMS, usando um volume de 2 mL de saliva acidificada, 10% NaCl (m/v) e 45 minutos de extração a uma temperatura de 37±1°C. Para a urina foi utilizada a mesma fibra, 4 mL de urina acidificada, 20% NaCl (m/v) e 60 minutos de extração a 50±1°C. Nas amostras de saliva e urina, foram identificados 243 e 500 metabolitos voláteis respetivamente, sendo estes pertencentes a diferentes famílias químicas. Posteriormente, utilizou-se a análise discriminante por mínimos quadrados parciais (PLS-DA) que permitiu observar uma boa separação entre os grupos controlo e oncológicos. Nas amostras salivares o grupo de pacientes com cancro da mama foi maioritariamente caracterizado pelo metabolito ácido benzeno carboxílico e o grupo de pacientes com cancro do pulmão pelo ácido hexanóico. Na urina o grupo de pacientes com cancro da mama foi maioritariamente caracterizado pelo metabolito 1-[2-(Isobutiriloxi)-1-metiletil]-2,2-dimetilpropil 2-metilpropanoato e o grupo de pacientes com cancro do pulmão pelo o-cimeno. Além da metodologia PLS-DA foi realizada a validação cruzada de monte carlo (MCCV) tendo-se obtido uma elevada taxa de classificação, sensibilidade e especificidade o que demonstra a robustez dos dados obtidos.

Avaliação de nova estratégia extrativa, baseada em NTDs, combinada com dados de análise cromatigráfica e quimiométrica para a deteção de biomarcadores de diferentes tipos de cancro

A elevada incidência e mortalidade mundiais associadas ao cancro justificam o desenvolvimento e implementação de estratégias eficazes e não-invasivas conducentes a um diagnóstico precoce. Neste contexto, pretendeu-se avaliar a performance de uma metodologia inovadora, a microextração por “needle trap” (NTME), na extração de metabolitos voláteis (VOMs) da urina de pacientes oncológicos com diferentes tipos de cancro - cólon, pulmão e mama, e de indivíduos saudáveis, com a finalidade de identificar um conjunto de VOMs potenciais biomarcadores dos diferentes tipos cancros em estudo. De modo a maximizar a eficiência da extração dos VOMs, foram otimizados diferentes parâmetros experimentais, nomeadamente a natureza do sorvente, a temperatura, o tempo de equilíbrio, o volume de headspace, a força iónica, o pH do meio e o volume e a agitação da amostra. Usando como sorvente o DVB/Car1000/CarX, os melhores resultados foram obtidos com 4 mL de urina acidificada (pH= 2), 20% NaCl, 40 mL de headspace e 40 min de equilíbrio a 50 °C. Foi ainda avaliada a estabilidade dos VOMs no sorvente até 72 h após a extração. Nos quatro grupos em estudo foram identificados, por GC-MS, 259 VOMs pertencentes a diversas famílias químicas, nomeadamente cetonas, compostos sulfurados, furânicos e terpénicos. A matriz de dados obtida para cada grupo em estudo foi submetida a análise discriminante, usando o método dos mínimos quadrados parciais (PLS-DA), que resultou em clusters distintos diferenciadores de cada grupo. A aplicabilidade do modelo foi avaliada através do método de classificação SIMCA (modelagem suave e independente de analogias de classe), com elevadas taxas de classificação, sensibilidade e especificidade. Este foi o primeiro estudo usando NTME para o estabelecimento do padrão volatómico da urina. Os resultados obtidos revelam-se muito promissores originando perfis voláteis de maior expressividade, mais completos e abrangentes, que os obtidos usando metodologias de referência.

Functionalization of dendrimers for improved gene delivery to mesenchymal stem cell

Disease, injury, and age problems compromise human quality of life and continuously motivate the search for new and more efficacious therapeutic approaches. The field of Tissue Regeneration and Engineering has greatly evolved over the last years, mainly due to the combination of the important advances verified in Biomaterials Science and Engineering with those of Cell and Molecular Biology. In particular, a new and promising area arose – Nanomedicine – that takes advantage of the extremely small size and especial chemical and physical properties of Nanomaterials, offering powerful tools for health improvement. Research on Stem Cells, the self-renewing progenitors of body tissues, is also challenging to the medical and scientific communities, being expectable the appearance of new and exciting stem cell-based therapies in the next years. The control of cell behavior (namely, of cell proliferation and differentiation) is of key importance in devising strategies for Tissue Regeneration and Engineering. Cytokines, growth factors, transcription factors and other signaling molecules, most of them proteins, have been identified and found to regulate and support tissue development and regeneration. However, the application of these molecules in long-term regenerative processes requires their continuous presence at high concentrations as they usually present short half-lives at physiological conditions and may be rapidly cleared from the body. Alternatively, genes encoding such proteins can be introduced inside cells and be expressed using cell’s machinery, allowing an extended and more sustained production of the protein of interest (gene therapy). Genetic engineering of stem cells is particularly attractive because of their self-renewal capability and differentiation potential. For Tissue Regeneration and Engineering purposes, the patient’s own stem cells can be genetically engineered in vitro and, after, introduced in the body (with or without a scaffold) where they will not only modulate the behavior of native cells (stem cell-mediated gene therapy), but also directly participate in tissue repair. Cells can be genetically engineered using viral and non-viral systems. Viruses, as a result of millions of years of evolution, are very effective for the delivery of genes in several types of cells, including cells from primary sources. However, the risks associated with their use (like infection and immunogenic reactions) are driving the search for non-viral systems that will efficiently deliver genetic material into cells. Among them, chemical methods that are promising and being investigated use cationic molecules as carriers for DNA. In this case, gene delivery and gene expression level remain relatively low when primary cells are used. The main goal of this thesis was to develop and assess the in vitro potential of polyamidoamine (PAMAM) dendrimers based carriers to deliver genes to mesenchymal stem cells (MSCs). PAMAM dendrimers are monodispersive, hyperbranched and nanospherical molecules presenting unique characteristics that make them very attractive vehicles for both drug and gene delivery. Although they have been explored for gene delivery in a wide range of cell lines, the interaction and the usefulness of these molecules in the delivery of genes to MSCs remains a field to be explored. Adult MSCs were chosen for the studies due to their potential biomedical applications (they are considered multipotent cells) and because they present several advantages over embryonic stem cells, such as easy accessibility and the inexistence of ethical restrictions to their use. This thesis is divided in 5 interconnected chapters. Chapter I provides an overview of the current literature concerning the various non-viral systems investigated for gene delivery in MSCs. Attention is devoted to physical methods, as well as to chemical methods that make use of polymers (natural and synthetic), liposomes, and inorganic nanoparticles as gene delivery vectors. Also, it summarizes the current applications of genetically engineered mesenchymal stem cells using non-viral systems in regenerative medicine, with special focus on bone tissue regeneration. In Chapter II, the potential of native PAMAM dendrimers with amine termini to transfect MSCs is evaluated. The level of transfection achieved with the dendrimers is, in a first step, studied using a plasmid DNA (pDNA) encoding for the β-galactosidase reporter gene. The effect of dendrimer’s generation, cell passage number, and N:P ratio (where N= number of primary amines in the dendrimer; P= number of phosphate groups in the pDNA backbone) on the level of transfection is evaluated, being the values always very low. In a second step, a pDNA encoding for bone morphogenetic protein-2, a protein that is known for its role in MSCs proliferation and differentiation, is used. The BMP-2 content produced by transfected cells is evaluated by an ELISA assay and its effect on the osteogenic markers is analyzed through several classical assays including alkaline phosphatase activity (an early marker of osteogenesis), osteocalcin production, calcium deposition and mineralized nodules formation (late osteogenesis markers). Results show that a low transfection level is enough to induce in vitro osteogenic differentiation in MSCs. Next, from Chapter III to Chapter V, studies are shown where several strategies are adopted to change the interaction of PAMAM dendrimers with MSCs cell membrane and, as a consequence, to enhance the levels of gene delivery. In Chapter III, generations 5 and 6 of PAMAM dendrimers are surface functionalized with arginine-glycine-aspartic acid (RGD) containing peptides – experiments with dendrimers conjugated to 4, 8 and 16 RGD units were performed. The underlying concept is that by including the RGD integrin-binding motif in the design of the vectors and by forming RGD clusters, the level of transfection will increase as MSCs highly express integrins at their surface. Results show that cellular uptake of functionalized dendrimers and gene expression is enhanced in comparison with the native dendrimers. Furthermore, gene expression is dependent on both the electrostatic interaction established between the dendrimer moiety and the cell surface and the nanocluster RGD density. In Chapter IV, a new family of gene delivery vectors is synthesized consisting of a PAMAM dendrimer (generation 5) core randomly linked at the periphery to alkyl hydrophobic chains that vary in length and number. Herein, the idea is to take advantage of both the cationic nature of the dendrimer and the capacity of lipids to interact with biological membranes. These new vectors show a remarkable capacity for internalizing pDNA, being this effect positively correlated with the –CH2– content present in the hydrophobic corona. Gene expression is also greatly enhanced using the new vectors but, in this case, the higher efficiency is shown by the vectors containing the smallest hydrophobic chains. Finally, chapter V reports the synthesis, characterization and evaluation of novel gene delivery vectors based on PAMAM dendrimers (generation 5) conjugated to peptides with high affinity for MSCs membrane binding - for comparison, experiments are also done with a peptide with low affinity binding properties. These systems present low cytotoxicity and transfection efficiencies superior to those of native dendrimers and partially degraded dendrimers (Superfect®, a commercial product). Furthermore, with this biomimetic approach, the process of gene delivery is shown to be cell surface receptor-mediated. Overall, results show the potential of PAMAM dendrimers to be used, as such or modified, in Tissue Regeneration and Engineering. To our knowledge, this is the first time that PAMAM dendrimers are studied as gene delivery vehicles in this context and using, as target, a cell type with clinical relevancy. It is shown that the cationic nature of PAMAM dendrimers with amine termini can be synergistically combined with surface engineering approaches, which will ultimately result in suitable interactions with the cytoplasmic membrane and enhanced pDNA cellular entry and gene expression. Nevertheless, the quantity of pDNA detected inside cell nucleus is always very small when compared with the bigger amount reaching cytoplasm (accumulation of pDNA is evident in the perinuclear region), suggesting that the main barrier to transfection is the nuclear membrane. Future work can then be envisaged based on the versatility of these systems as biomedical molecular materials, such as the conjugation of PAMAM dendrimers to molecules able to bind nuclear membrane receptors and to promote nuclear translocation.

Caracterização e isolamento de compostos bioactivos do fungo Laurobasidium lauri (Madre de louro)

Os objectivos deste trabalho consistiram em desenvolver um método de separação eficaz e reprodutível de modo a isolar as lactonas sesquiterpénicas - dehidrocostus e costunolida - de extractos do fungo parasita da espécie Laurus novocanariensis - Laurobasidium lauri; em testar os compostos relativamente às suas capacidades antioxidantes e bioactivas - citotoxicidade e alelopatia - e em obter uma quantidade considerável destas lactonas de modo a enviar para laboratórios em parceria para realização de testes de actividade anticancerígena in vitro (Instituto Canário de Investigação em Cancro), de antituberculose in vivo (Instituto politécnico Nacional, México), de actividade anti-inflamatória in vivo (UNIVALI, Brasil) e de actividade anti-ulcerativa in vivo. Neste trabalho foi possível isolar 116 mg de lactona costunolida com 97% de pureza através do fraccionamento do extracto de Madre de Louro em hexano pela técnica de cromatografia em coluna aberta com sistema de eluentes Hexano:Acetato de etilo (50:0 – 43:7 mL), procedendo à sua identificação por HPLC-MS e RMN 13C, não tendo sido possível atingir o mesmo objectivo para a lactona dehidrocostus. O extracto de Madre de Louro em Metanol demonstrou ser a amostra com maior poder antioxidante relativamente aos teste de ABTS, DPPH e FRAP, enquanto o extracto em Diclorometano apresentou maior poder antioxidante no teste do β-caroteno/ácido linoléico. No que toca aos ensaios biológicos, o extracto de madre de louro em hexano foi o que apresentou um valor de DL50 mais baixo (0,1mg/mL) representando assim maior poder de toxicidade perante as larvas de camarão (Artemia salina).

Detecção e caracterização de biomarcadores voláteis em indivíduos com patologias oncológicas

Com a realização deste trabalho, pretendeu-se traçar o perfil padrão da composição volátil típico de fluidos biológicos (urina) de indivíduos sem patologia oncológica (grupo de controlo) comparando-os com os de pacientes (grupo com patologia oncológica). As amostras de urina de ambos os grupos foram analisadas por microextracção em fase sólida em modo de headspace acoplada à espectrometria de massa (HS-SPME-GC/qMS). Com o intuito de aumentar a eficiência de extracção da SPME, foram optimizados alguns parâmetros com influência no processo extractivo, nomeadamente o tipo de fibra, o tempo e a temperatura de extracção. Assim sendo, foram testadas e comparadas seis fibras comercialmente disponíveis, polidimetilsiloxano (PDMS, 100 m), poliacrilato (PA, 85 m), carboxeno-polidimetilsiloxano (CAR/PDMS, 75 m), carbowax-divinilbenzeno (CW/DVB, 65 m), divinilbenzeno-carboxen-polidimetilsiloxano (DVB/CAR/PDMS, 50/30 m) e polidimetilsiloxano-divinilbenzeno (PDMS/DVB, 65 m). A influência do tempo (30, 45, 60 e 75 min) e temperatura (30, 50 e 60 ºC) de extracção foram optimizados de modo a obter uma melhor eficiência de extracção dos compostos voláteis presentes nas amostras de urina. Os melhores resultados foram obtidos usando a fibra carboxeno-polidimetilsiloxano (CAR/PDMS, 75 m), com uma velocidade de agitação de 800 rpm durante 75 min a uma temperatura de 50 ºC. Para os dois grupos em estudo, foram identificados 80 compostos voláteis pertencentes a diversas famílias químicas, nomeadamente, aldeídos, cetonas, derivados benzénicos, compostos terpénicos, ácidos orgânicos, compostos furânicos, compostos sulfurados, fenóis voláteis, ésteres, álcoois superiores e derivados do naftaleno. Os compostos maioritários pertencentes aos grupos analisados foram a 4-heptanona, a 2-pentanona, a acetona, a 2-butanona, o 1(2- furanil)etanona, o 3-metil-3-fenil-2-propenal, o 3,4-dimetilbenzaldeído, o decanal, o dissulfureto de dimetilo, o metanotiol, o 2-metoxitiofeno, o 4-metil-fenol, o p-tert-butil-fenol, o 2,4-bis(1,1- dimetiletil)fenol, o fenol, o m-cimeno, o p-cimeno, o tolueno, o 1-etil-3,5-diisopropilbenzeno, o 2,6-dimetil-7-octen-2-ol, a D-carvona, o vitispirano I e o vitispirano II. O teste One-Way ANOVA foi aplicado aos resultados com o intuito de verificar se existiam diferenças significativas entre os grupos avaliados (Controlo e Oncológico), sendo o dissulfureto de dimetilo, o 2-metoxitiofeno, e o p-cimeno estatisticamente significativos. A aplicação da análise multivariável às amostras de urina das diferentes patologias permitiu diferenciá-las no qual se obteve 81,02% da variância total.A aplicação da análise multivariável às amostras de urina das diferentes patologias permitiu diferenciá-las no qual se obteve 81,02% da variância total. A patologia de Hodgkin é influenciada pelas variáveis heptanal e o 2-metil-3-fenil-2-propenal. O Controlo é afectado essencialmente pelas variáveis p-cimeno, 1,4,5-trimetilnaftaleno e o dissulfureto de dimetilo. O Cólon é influenciado pelo 4-metilfenol, anisole e 1,2-dihidro-1,1,6-trimetil-naftaleno. O 1-octanol e a 3-heptanona influenciam, essencialmente as patologias da Mama e Leucemia.