Novos vectores baseados em dendrímeros com aplicações em terapia antisense

A terapia genética tem se revelado uma ferramenta potente na Medicina, na tentativa de revolucionar o tratamento de várias doenças hereditárias e adquiridas. A introdução de genes em células pretende a expressão estável e prolongada de proteínas com efeitos terapêuticos. O silenciamento de genes, através da terapia genética que faz uso de oligonucleótidos antisense, pequenos RNA de interferência (siRNA) ou ribozimas, visa o decréscimo ou anulação do funcionamento de um gene cuja expressão amplificada, por algum motivo, leva ao desenvolvimento de umapatologia. A internalização de material genético nas células, usualmente, carece de métodos e/ou sistemas de entrega (vectores). Estes podem pertencer a duas categorias, designadamente, métodos virais e métodos não-virais. O primeiro é considerado o mais eficiente, apresentando porém, sérias desvantagens como o risco de carcinogénese. A solução é a utilização de métodos não virais,que podem ser físicos ou químicos. O objectivo principal desta dissertação foi a utilização de dendrímeros para o silenciamento do gene da proteína fluorescente optimizada (EGFP) em células HeLa, previamente modificadas para expressarem esta proteína. Dendrímeros poli(amidoamina) geração 5 (PAMAM G5) modificados com 4 ou 8 moléculas de ácidos gordos de diferentes comprimentos foram complexados com oligonucleótidos antisense. A vantagem que estes apresentam em relação aos dendrímeros nativos é que são capazes de interagir com os lípidos da membrana celular, esperando-se, por isso, uma melhor eficiência de transfecção e efeitos antisense. Isto foi efectivamente verificado, sendo que o nível de silenciamento do gene da EGFP obtido, está directamente relacionado com o aumento da razão NP, o número e o comprimento das cadeias hidrofóbicas. O silencimento de genes tem sofrido grandes avanços, havendo actualmente uma série de ensaios clínicos para a sua utilização no tratamento de doenças como cancros de origem hereditária ou viral, prevendo-se que venha para ficar, juntamente com o silenciamento mediado por siRNA.

Deteção e caracterização molecular das estirpes de Wolbachia nos afídeos

A Wolbachiapertence a um grupo de bactérias intracelulares, transmitidas maternalmente, que se encontram amplamente distribuídas nos artrópodes. Estes endossimbiontes encontram-se normalmente nos tecidos do sistema reprodutor dos artrópodes e têm a capacidade manipular a sua reproduçãode modo a garantir a sua transmissão à descendência e rápida dispersão na população.A capacidade de manipulação reprodutiva da Wolbachia tornou-a o alvo de diversos estudos para uma maior e melhor perceção da sua implicação em processos biológicos e evolutivos e por acreditar-se que esta bactéria é uma promissora ferramenta no controlo de populações de insetos que são pragas agrícolas. Os afídeos são um grupo de insetos associados às plantas que podem ter um efeito devastador nas culturas agrícolas e hortícolas pois não só retiram nutrientes às plantas como podem ser vetores de doenças. Embora durante muito tempo se pensasse que estes insetos não albergavam a Wolbachia estudos recentes mostram que são várias as espécies de afídeos infetados com esta bactéria. O principal objetivo deste trabalho é estudar a prevalência de infeção por Wolbachia assim como a caracterização das suas estirpes em amostras de afídeos dos Arquipélagos da Madeira e dos Açores. Neste estudo foram analisadas 545 amostras de afídeos, 361 provenientes do Arquipélago da Madeira e 184 dos Açores. Utilizando a técnica da “Polymerase Chain Reaction” (reação em cadeia da polimerase) amplificou-se o gene 16S rRNA (RNA ribossomal) e verificou-se que 32 destas amostras encontravam-se infetadas com Wolbachia sendo a maior parte das amostras infetadas provenientes dos Açores. Para determinar a estirpe que infeta estes afídeos utilizou-se a tipagem sequencial multilocus (MLST) com os genesglutamil-tRNA amidotransferase, subunidade B (gatB), citocromo c oxidase, subunidade I (coxA), proteína hipotética conservativa (hcpA) e proteína da divisão celular (ftsZ). A análise filogenética realizada para os diferentes genes mostrou que grande parte das amostras analisadas estão incluídas em dois dos novos supergrupos descobertos para Wolbachia, supergrupo M e N.Foi detetada a presença da mesma estirpe de Wolbachia, supergrupo N, em duas espécies diferentes de afídeos, Neophyllaphis podocarpi e Aphis spiraecola da mesma planta hospedeira, Podocarpus macrophyllus. Esta infeção reforça a ideia de que a Wolbachia não recorre só a transmissão vertical para se difundir na população mas utiliza também a transmissão horizontal. A deteção e caracterização das estirpes de Wolbachia é essencial para um maior entendimento sobre a sua origem e forma de disseminação. Esta informação é importante para desenvolvimento de estratégias de controlo de pestes recorrendo a estes endossimbiontes.