Functionalization of dendrimers for improved gene delivery to mesenchymal stem cell

Disease, injury, and age problems compromise human quality of life and continuously motivate the search for new and more efficacious therapeutic approaches. The field of Tissue Regeneration and Engineering has greatly evolved over the last years, mainly due to the combination of the important advances verified in Biomaterials Science and Engineering with those of Cell and Molecular Biology. In particular, a new and promising area arose – Nanomedicine – that takes advantage of the extremely small size and especial chemical and physical properties of Nanomaterials, offering powerful tools for health improvement. Research on Stem Cells, the self-renewing progenitors of body tissues, is also challenging to the medical and scientific communities, being expectable the appearance of new and exciting stem cell-based therapies in the next years. The control of cell behavior (namely, of cell proliferation and differentiation) is of key importance in devising strategies for Tissue Regeneration and Engineering. Cytokines, growth factors, transcription factors and other signaling molecules, most of them proteins, have been identified and found to regulate and support tissue development and regeneration. However, the application of these molecules in long-term regenerative processes requires their continuous presence at high concentrations as they usually present short half-lives at physiological conditions and may be rapidly cleared from the body. Alternatively, genes encoding such proteins can be introduced inside cells and be expressed using cell’s machinery, allowing an extended and more sustained production of the protein of interest (gene therapy). Genetic engineering of stem cells is particularly attractive because of their self-renewal capability and differentiation potential. For Tissue Regeneration and Engineering purposes, the patient’s own stem cells can be genetically engineered in vitro and, after, introduced in the body (with or without a scaffold) where they will not only modulate the behavior of native cells (stem cell-mediated gene therapy), but also directly participate in tissue repair. Cells can be genetically engineered using viral and non-viral systems. Viruses, as a result of millions of years of evolution, are very effective for the delivery of genes in several types of cells, including cells from primary sources. However, the risks associated with their use (like infection and immunogenic reactions) are driving the search for non-viral systems that will efficiently deliver genetic material into cells. Among them, chemical methods that are promising and being investigated use cationic molecules as carriers for DNA. In this case, gene delivery and gene expression level remain relatively low when primary cells are used. The main goal of this thesis was to develop and assess the in vitro potential of polyamidoamine (PAMAM) dendrimers based carriers to deliver genes to mesenchymal stem cells (MSCs). PAMAM dendrimers are monodispersive, hyperbranched and nanospherical molecules presenting unique characteristics that make them very attractive vehicles for both drug and gene delivery. Although they have been explored for gene delivery in a wide range of cell lines, the interaction and the usefulness of these molecules in the delivery of genes to MSCs remains a field to be explored. Adult MSCs were chosen for the studies due to their potential biomedical applications (they are considered multipotent cells) and because they present several advantages over embryonic stem cells, such as easy accessibility and the inexistence of ethical restrictions to their use. This thesis is divided in 5 interconnected chapters. Chapter I provides an overview of the current literature concerning the various non-viral systems investigated for gene delivery in MSCs. Attention is devoted to physical methods, as well as to chemical methods that make use of polymers (natural and synthetic), liposomes, and inorganic nanoparticles as gene delivery vectors. Also, it summarizes the current applications of genetically engineered mesenchymal stem cells using non-viral systems in regenerative medicine, with special focus on bone tissue regeneration. In Chapter II, the potential of native PAMAM dendrimers with amine termini to transfect MSCs is evaluated. The level of transfection achieved with the dendrimers is, in a first step, studied using a plasmid DNA (pDNA) encoding for the β-galactosidase reporter gene. The effect of dendrimer’s generation, cell passage number, and N:P ratio (where N= number of primary amines in the dendrimer; P= number of phosphate groups in the pDNA backbone) on the level of transfection is evaluated, being the values always very low. In a second step, a pDNA encoding for bone morphogenetic protein-2, a protein that is known for its role in MSCs proliferation and differentiation, is used. The BMP-2 content produced by transfected cells is evaluated by an ELISA assay and its effect on the osteogenic markers is analyzed through several classical assays including alkaline phosphatase activity (an early marker of osteogenesis), osteocalcin production, calcium deposition and mineralized nodules formation (late osteogenesis markers). Results show that a low transfection level is enough to induce in vitro osteogenic differentiation in MSCs. Next, from Chapter III to Chapter V, studies are shown where several strategies are adopted to change the interaction of PAMAM dendrimers with MSCs cell membrane and, as a consequence, to enhance the levels of gene delivery. In Chapter III, generations 5 and 6 of PAMAM dendrimers are surface functionalized with arginine-glycine-aspartic acid (RGD) containing peptides – experiments with dendrimers conjugated to 4, 8 and 16 RGD units were performed. The underlying concept is that by including the RGD integrin-binding motif in the design of the vectors and by forming RGD clusters, the level of transfection will increase as MSCs highly express integrins at their surface. Results show that cellular uptake of functionalized dendrimers and gene expression is enhanced in comparison with the native dendrimers. Furthermore, gene expression is dependent on both the electrostatic interaction established between the dendrimer moiety and the cell surface and the nanocluster RGD density. In Chapter IV, a new family of gene delivery vectors is synthesized consisting of a PAMAM dendrimer (generation 5) core randomly linked at the periphery to alkyl hydrophobic chains that vary in length and number. Herein, the idea is to take advantage of both the cationic nature of the dendrimer and the capacity of lipids to interact with biological membranes. These new vectors show a remarkable capacity for internalizing pDNA, being this effect positively correlated with the –CH2– content present in the hydrophobic corona. Gene expression is also greatly enhanced using the new vectors but, in this case, the higher efficiency is shown by the vectors containing the smallest hydrophobic chains. Finally, chapter V reports the synthesis, characterization and evaluation of novel gene delivery vectors based on PAMAM dendrimers (generation 5) conjugated to peptides with high affinity for MSCs membrane binding - for comparison, experiments are also done with a peptide with low affinity binding properties. These systems present low cytotoxicity and transfection efficiencies superior to those of native dendrimers and partially degraded dendrimers (Superfect®, a commercial product). Furthermore, with this biomimetic approach, the process of gene delivery is shown to be cell surface receptor-mediated. Overall, results show the potential of PAMAM dendrimers to be used, as such or modified, in Tissue Regeneration and Engineering. To our knowledge, this is the first time that PAMAM dendrimers are studied as gene delivery vehicles in this context and using, as target, a cell type with clinical relevancy. It is shown that the cationic nature of PAMAM dendrimers with amine termini can be synergistically combined with surface engineering approaches, which will ultimately result in suitable interactions with the cytoplasmic membrane and enhanced pDNA cellular entry and gene expression. Nevertheless, the quantity of pDNA detected inside cell nucleus is always very small when compared with the bigger amount reaching cytoplasm (accumulation of pDNA is evident in the perinuclear region), suggesting that the main barrier to transfection is the nuclear membrane. Future work can then be envisaged based on the versatility of these systems as biomedical molecular materials, such as the conjugation of PAMAM dendrimers to molecules able to bind nuclear membrane receptors and to promote nuclear translocation.

As práticas do modelo pedagógico do movimento da Escola Moderna e a inovação pedagógica: um estudo de caso no Primeiro Ciclo do Ensino Básico

Este trabalho expõe o percurso realizado no intuito de perceber se são ou não inovadoras as práticas pedagógicas desenvolvidas por uma professora, em contexto de aula, com os seus alunos, a qual fundamenta a sua ação no modelo pedagógico do Movimento da Escola Moderna. Desenvolvemos a investigação através de uma metodologia qualitativa, um estudo de caso, que foi efetuado numa escola do Primeiro Ciclo do Ensino Básico, do ensino particular, da Região Autónoma da Madeira, numa turma cuja professora era responsável por dezasseis alunos que frequentavam o terceiro ano de escolaridade. Procuramos, no enquadramento teórico da investigação, definir o conceito de inovação e compreendê-lo no campo da pedagogia articulando-o depois, com o modelo pedagógico do MEM, numa perspetiva construtivista. No estudo empírico descrevemos a postura pessoal e profissional da professora na tentativa de entender se as práticas por ela desenvolvidas vão ao encontro da inovação pedagógica. No final verificamos que as conclusões se direcionam para uma evidência: a postura profissional e pessoal, assumida pela professora, bem como as suas práticas pedagógicas, fundamentadas no modelo pedagógico do MEM, evidenciam uma rutura paradigmática aproximando-se da inovação pedagógica.

A tecnologia móvel como potencializadora no desenvolvimento do protagonismo infantil: um olhar sobre inovação pedagógica

O desenvolvimento das Tecnologias da Informação e Comunicação (TIC) têm revolucionado a sociedade contemporânea, a escola nesse contexto é chamada a incorporar esses recursos não de forma acrítica ou como recurso auxiliar de ensino, mas como potencializador da construção do conhecimento. O Governo brasileiro através de políticas públicas educacionais vêm disseminando o uso das TIC nas escolas através de programas a exemplo do PROINFO e PROUCA, este último visa a distribuição de laptops educacionais na modalidade 1-1 às crianças. Essa pesquisa visa compreender as práticas pedagógicas na perspectiva de sua consideração como sendo ou não efetiva na melhoria objetivada enquanto inovação pedagógica e promoção do protagonismo infanto juvenil. Para tanto, foi necessário verificar se a utilização desse dispositivo móvel tem contribuído para a construção do conhecimento a ponto de permitir considerar as práticas pedagógicas como inovação pedagógica. Trata-se de uma pesquisa qualitativa de cunho etnográfico com análise de conteúdo, utilizando-se entrevistas com 10 professores e 30 alunos e observações participantes, fundamentada na abordagem Construcionista de Seymour Papert, base de sustentação teórica para a análise dos resultados. O estudo evidenciou, categorias, como: construção do conhecimento, mudança de prática, dificuldades e limitações, motivação e fascínio, mobilidade, acesso a internet, habilidades, autonomia, colaboração e autoria, através das quais foi possível compreender o objeto, como uma potencialidade, visto que, a persistência e a busca alternativa se fizeram presentes na superação gradativa das limitações e entraves que se mostraram no decorrer da pesquisa.

Relatório de estágio para obtenção do grau de mestre em Educação Pré-Escolar e Ensino do 1º Ciclo do Ensino Básico

O relatório aqui explanado teve como alicerces as intervenções pedagógicas realizadas nas valências de Educação Pré-Escolar e do 1.º Ciclo do Ensino Básico, ambas decorridas na Escola Básica do 1.º Ciclo com Pré-Escolar do Lombo Segundo e visa a obtenção do grau de mestre em Educação Pré-Escolar e Ensino do 1.º Ciclo do Ensino Básico. Este agrega uma panóplia de pressupostos teóricos que apoiaram a prática realizada e que contribuíram para a edificação de novos saberes em ambos os grupos, promovendo aprendizagens significativas e de qualidade. Ambas as práticas pedagógicas foram alvo de um período de observação inicial que possibilitaram a obtenção de informações acerca dos grupos com quem foi realizada uma intervenção planeada e sustentada por uma constante reflexão a avaliação dos métodos utilizados. A estruturação de questões fundamentadas pela metodologia de investigação-ação culminaram na pesquisa e implementação de estratégias, propiciadoras de ténues mudanças nos grupos em questão. Na Educação Pré-Escolar, com crianças com idades compreendidas entre os cinco e os seis anos de idade, com o intuito colmatar a disparidade existente entre o nível de aptidões sociais de algumas crianças instituiu-se a seguinte questão orientadora: Como desenvolver competências interpessoais entre as crianças deste grupo?. Posto isto, foram colocadas em prática algumas estratégias apoiadas num trabalho sequencial que promovia a cooperação e as competências sociais das crianças do grupo. Em contexto de 1.º Ciclo do Ensino Básico, com crianças cujas idades se encontravam entre os sete e os dez anos de idade, foram verificadas dificuldades no domínio da leitura e da escrita e como tal, foi estruturada a seguinte questão orientadora da investigação-ação: Como desenvolver competências de leitura e escrita numa turma de 2.º ano?. Neste seguimento de ideias, colocaram-se em prática algumas estratégias com a finalidade de atenuar estas dificuldades.

O jornal escolar no ensino fundamental: do letramento à formação cidadã

O presente trabalho investiga a construção do Jornal Escolar na sala de aula como recurso pedagógico, com intuito de mobilizar os alunos do Ensino Fundamental em prol da melhoria do processo de leitura e escrita, tentando verificar se o mesmo se assume como inovação pedagógica. O estudo fundamentado teoricamente sob a perspectiva sociocultural e de formação cidadã compreende o aprendiz como um ser de potencialidades comunicativas, cívicas, políticas e sociais, embasado em estudos dos autores: Freinet, precursor do jornal escolar como prática educativa e inovadora na sala de aula; Vygotsky, que estudou as implicações sociais e culturais da mente; Papert; Sousa & Fino; autores que promovem ampla reflexão sobre práticas educativas transformadoras e defensores da inovação pedagógica promotora de dinâmicas que mobilizam os alunos na aprendizagem escolar. O campo de pesquisa foi uma Escola Pública do Município de Madalena – Ceará, Brasil, que trabalha o jornal escolar em sala de aula e teve como sujeitos estudados, os alunos do 5º ano do Ensino Fundamental, os professores, os pais e os funcionários. A metodologia desenvolvida é de pesquisa-ação, de natureza qualitativa, que adota a observação participante como procedimento principal de coleta de dados bem como o inquérito por questionário, assim como a participação do investigador com o intuito de melhorar as práticas pedagógicas existentes. A pesquisa-ação, segundo concepções de Stenhouse, Marangon e Macedo, consiste na investigação no cotidiano escolar, com o envolvimento dos professores, dos alunos e da própria comunidade nas fases de desenvolvimento da pesquisa. Sousa enfatiza a identificação do pesquisador com o objeto investigado; Toffler entende que esse tipo de intervenção é benéfico para a transformação e a melhoria do objeto pesquisado, dando ênfase ao planejamento e ao desenvolvimento de ações interdisciplinares. A fundamentação desse trabalho é baseada nas concepções de Khun e Toffler, que abordam a ruptura paradigmática e a inovação pedagógica pressupondo um salto, uma descontinuidade das velhas práticas pedagógicas. Os resultados indicam que o jornal escolar pode ser uma ferramenta significativa para o processo de ensinoaprendizagem bem como motivador de engajamento social, cultural e de formação cidadã. Portanto, a prática educativa do jornal escolar investigada manifesta traços de inovação pedagógica. Dessa forma, a postura dos professores e alunos tem demonstrado, práticas pedagógicas inovadoras, diferenciadas das anteriores, uma vez que a discussão coletiva e a produção ganharam espaço para o fortalecimento das atividades realizadas na sala de aula.