Functionalization of dendrimers for improved gene delivery to mesenchymal stem cell

Disease, injury, and age problems compromise human quality of life and continuously motivate the search for new and more efficacious therapeutic approaches. The field of Tissue Regeneration and Engineering has greatly evolved over the last years, mainly due to the combination of the important advances verified in Biomaterials Science and Engineering with those of Cell and Molecular Biology. In particular, a new and promising area arose – Nanomedicine – that takes advantage of the extremely small size and especial chemical and physical properties of Nanomaterials, offering powerful tools for health improvement. Research on Stem Cells, the self-renewing progenitors of body tissues, is also challenging to the medical and scientific communities, being expectable the appearance of new and exciting stem cell-based therapies in the next years. The control of cell behavior (namely, of cell proliferation and differentiation) is of key importance in devising strategies for Tissue Regeneration and Engineering. Cytokines, growth factors, transcription factors and other signaling molecules, most of them proteins, have been identified and found to regulate and support tissue development and regeneration. However, the application of these molecules in long-term regenerative processes requires their continuous presence at high concentrations as they usually present short half-lives at physiological conditions and may be rapidly cleared from the body. Alternatively, genes encoding such proteins can be introduced inside cells and be expressed using cell’s machinery, allowing an extended and more sustained production of the protein of interest (gene therapy). Genetic engineering of stem cells is particularly attractive because of their self-renewal capability and differentiation potential. For Tissue Regeneration and Engineering purposes, the patient’s own stem cells can be genetically engineered in vitro and, after, introduced in the body (with or without a scaffold) where they will not only modulate the behavior of native cells (stem cell-mediated gene therapy), but also directly participate in tissue repair. Cells can be genetically engineered using viral and non-viral systems. Viruses, as a result of millions of years of evolution, are very effective for the delivery of genes in several types of cells, including cells from primary sources. However, the risks associated with their use (like infection and immunogenic reactions) are driving the search for non-viral systems that will efficiently deliver genetic material into cells. Among them, chemical methods that are promising and being investigated use cationic molecules as carriers for DNA. In this case, gene delivery and gene expression level remain relatively low when primary cells are used. The main goal of this thesis was to develop and assess the in vitro potential of polyamidoamine (PAMAM) dendrimers based carriers to deliver genes to mesenchymal stem cells (MSCs). PAMAM dendrimers are monodispersive, hyperbranched and nanospherical molecules presenting unique characteristics that make them very attractive vehicles for both drug and gene delivery. Although they have been explored for gene delivery in a wide range of cell lines, the interaction and the usefulness of these molecules in the delivery of genes to MSCs remains a field to be explored. Adult MSCs were chosen for the studies due to their potential biomedical applications (they are considered multipotent cells) and because they present several advantages over embryonic stem cells, such as easy accessibility and the inexistence of ethical restrictions to their use. This thesis is divided in 5 interconnected chapters. Chapter I provides an overview of the current literature concerning the various non-viral systems investigated for gene delivery in MSCs. Attention is devoted to physical methods, as well as to chemical methods that make use of polymers (natural and synthetic), liposomes, and inorganic nanoparticles as gene delivery vectors. Also, it summarizes the current applications of genetically engineered mesenchymal stem cells using non-viral systems in regenerative medicine, with special focus on bone tissue regeneration. In Chapter II, the potential of native PAMAM dendrimers with amine termini to transfect MSCs is evaluated. The level of transfection achieved with the dendrimers is, in a first step, studied using a plasmid DNA (pDNA) encoding for the β-galactosidase reporter gene. The effect of dendrimer’s generation, cell passage number, and N:P ratio (where N= number of primary amines in the dendrimer; P= number of phosphate groups in the pDNA backbone) on the level of transfection is evaluated, being the values always very low. In a second step, a pDNA encoding for bone morphogenetic protein-2, a protein that is known for its role in MSCs proliferation and differentiation, is used. The BMP-2 content produced by transfected cells is evaluated by an ELISA assay and its effect on the osteogenic markers is analyzed through several classical assays including alkaline phosphatase activity (an early marker of osteogenesis), osteocalcin production, calcium deposition and mineralized nodules formation (late osteogenesis markers). Results show that a low transfection level is enough to induce in vitro osteogenic differentiation in MSCs. Next, from Chapter III to Chapter V, studies are shown where several strategies are adopted to change the interaction of PAMAM dendrimers with MSCs cell membrane and, as a consequence, to enhance the levels of gene delivery. In Chapter III, generations 5 and 6 of PAMAM dendrimers are surface functionalized with arginine-glycine-aspartic acid (RGD) containing peptides – experiments with dendrimers conjugated to 4, 8 and 16 RGD units were performed. The underlying concept is that by including the RGD integrin-binding motif in the design of the vectors and by forming RGD clusters, the level of transfection will increase as MSCs highly express integrins at their surface. Results show that cellular uptake of functionalized dendrimers and gene expression is enhanced in comparison with the native dendrimers. Furthermore, gene expression is dependent on both the electrostatic interaction established between the dendrimer moiety and the cell surface and the nanocluster RGD density. In Chapter IV, a new family of gene delivery vectors is synthesized consisting of a PAMAM dendrimer (generation 5) core randomly linked at the periphery to alkyl hydrophobic chains that vary in length and number. Herein, the idea is to take advantage of both the cationic nature of the dendrimer and the capacity of lipids to interact with biological membranes. These new vectors show a remarkable capacity for internalizing pDNA, being this effect positively correlated with the –CH2– content present in the hydrophobic corona. Gene expression is also greatly enhanced using the new vectors but, in this case, the higher efficiency is shown by the vectors containing the smallest hydrophobic chains. Finally, chapter V reports the synthesis, characterization and evaluation of novel gene delivery vectors based on PAMAM dendrimers (generation 5) conjugated to peptides with high affinity for MSCs membrane binding - for comparison, experiments are also done with a peptide with low affinity binding properties. These systems present low cytotoxicity and transfection efficiencies superior to those of native dendrimers and partially degraded dendrimers (Superfect®, a commercial product). Furthermore, with this biomimetic approach, the process of gene delivery is shown to be cell surface receptor-mediated. Overall, results show the potential of PAMAM dendrimers to be used, as such or modified, in Tissue Regeneration and Engineering. To our knowledge, this is the first time that PAMAM dendrimers are studied as gene delivery vehicles in this context and using, as target, a cell type with clinical relevancy. It is shown that the cationic nature of PAMAM dendrimers with amine termini can be synergistically combined with surface engineering approaches, which will ultimately result in suitable interactions with the cytoplasmic membrane and enhanced pDNA cellular entry and gene expression. Nevertheless, the quantity of pDNA detected inside cell nucleus is always very small when compared with the bigger amount reaching cytoplasm (accumulation of pDNA is evident in the perinuclear region), suggesting that the main barrier to transfection is the nuclear membrane. Future work can then be envisaged based on the versatility of these systems as biomedical molecular materials, such as the conjugation of PAMAM dendrimers to molecules able to bind nuclear membrane receptors and to promote nuclear translocation.

Modelização das camadas junto aos eléctrodos em descargas de arco de alta pressão

Nesta dissertação foi realizada a modelização numérica das camadas de não-equilíbrio junto aos cátodos e ânodos em descargas de arco de alta pressão. Ao contrário de trabalhos anteriores, a modelização é uni cada, i.e., baseia-se num único conjunto de equações escritas sem suposições simpli cativas tais como equilíbrio térmico, equilíbrio de ionização (Saha) e quaseneutralidade, e não utiliza uma divisão a priori do domínio de cálculo em sub- camadas com propriedades físicas diferentes. Processos de transporte de iões e electrões são descritos no âmbito do modelo de difusão. Foi também desenvolvida uma teoria da camada de ionização junto ao cátodo no âmbito do modelo multi uido. Os resultados obtidos são comparados com dados experimentais. Os resultados da tese elucidam a física de transferência de corrente através das camadas junto aos eléctrodos em descargas de arco de alta pressão, e servem para melhor compreen- der os fenómenos que ocorrem em vários dispositivos industriais, como as lâmpadas de descarga de muito alta pressão e as tochas de plasma.

Modelação da interacção entre um plasma de arco de alta pressão e cátodos refractários

Nesta dissertação apresento um estudo detalhado de vários aspectos da interacção entre um plasma de arco de alta pressão e cátodos refractários. Um modelo da camada de plasma junto ao cátodo num plasma sujeito a uma pressão da ordem de uma ou várias atmosferas é reconsiderado com base em recentes resultados teóricos. A física da camada de plasma junto ao cátodo é analisada para valores da queda de tensão na camada de plasma junto ao cátodo até 50V, de acordo com recentes resultados experimentais que mostram que a queda de tensão na camada de plasma junto ao cátodo numa descarga de arco de alta pressão pode atingir valores tão elevados. São identificados os mecanismos que originam a não monotonia da dependência da densidade de fluxo de energia (proveniente do plasma para a superfície do cátodo) em relação à temperatura da superfície do cátodo, para um valor fixo da queda de tensão junto ao cátodo. Uma descrição fechada da interacção plasma-cátodo é obtida por meio da resolução numérica do problema não linear com condições de fronteira para a distribuição da temperatura no interior do corpo do cátodo. São apresentados resultados da modelação numérica da descarga difusa nas condições de funcionamento de uma lâmpada de descarga experimental, sendo bom o acordo entre os resultados numéricos e os dados experimentais. Manchas solitárias num cátodo plano infinito e modos difuso e mancha axialmente simétricos em cátodos finitos de descargas de arco de alta pressão são estudados num grande intervalo de corrente. São analisados aspectos gerais e apresentados resultados numéricos referentes a cátodos de tungsténio planos e de forma cilíndrica a operar num plasma de argon à pressão atmosférica para correntes de arco até 100 kA. Émostrado, em particular, que a temperatura da superfície do cátodo no interior de uma mancha solitária varia relativamente pouco, podendo ser estimada com uma precisão de cerca de 200 − 300K sem ser necesário resolver a equação da condução térmica no corpo do cátodo. O comportamento assimptótico das soluções para um cátodo finito no caso limite de altas correntes é encontrado e confirmado pelos resultados numéricos. É confirmado um padrão geral das características tensão-corrente de vários modos de transferência de corrente em cátodos finitos sugerido previamente com base numa análise de bifurcações. É estudada a transição de modos mancha num cátodo finito no limite de cátodos de grandes dimensões para o modo mancha solitária num cátodo plano infinito. É estabelecido que o modo mancha solitária representa uma forma limite do modo mancha de alta tensão num cátodo finito. É considerada a questão da distinção entre modo difuso e modo mancha num cátodo finito. É desenvolvida uma abordagem para o cálculo de pontos de bifurcação nos quais soluções mancha tridimensionais bifurcam-se a partir de soluções que descrevem o modo difuso e modos mancha axialmente simétricos. Em particular, é calculado o primeiro ponto de bifurcação posicionado na solução que descreve o modo difuso e, por conseguinte, o seu limite de estabilidade, isto é, a corrente abaixo da qual o modo difuso torna-se instável. São apresentados os resultados da modelação numérica efectuada para o caso de um cátodo de tungsténio de forma cilíndrica a operar num plasma de alta pressão. É estudado o efeito produzido no limite de estabilidade pelas variações dos parâmetros de controle (dimensões do cátodo, função de trabalho do material do cátodo, tipo e pressão do gás que produz o plasma). Foi encontrado que o comportamento do limite de estabilidade sujeito a estas variações está em conformidade com as tendências observadas experimentalmente. Foi encontrado que o limite de estabilidade é muito mais sensível às variações dos parâmetros de controle do que as características tensão-corrente do modo difuso, sendo o efeito mais forte produzido pelas variações das dimensões do cátodo e da função de trabalho do material do cátodo. Este resultado está em conformidade com o facto experimental de que a transição difuso-mancha é de difícil reprodução.

Os cruzeiros e o Porto do Funchal: importância económica para o turismo na região

O porto do Funchal é uma realidade recente. Historicamente podemos considerar que existe porto desde o final do Século XIX, muito embora já com D. José I tivesse havido uma Determinação real para proceder à construção de uma infra-estrutura portuária, o que só parcialmente foi cumprido, num processo apenas terminado em 2011. Até aí e desde a colonização, o desembarque de pessoas e bens era feito no calhau, ao ritmo e sabor das levadias e dos estados do mar e da força humana, numa tradição que ficou expressa em inúmeras obras e registos de viagem e igualmente no Pilar de Banger, mandado construir por um britânico, como base de guindaste para descargas. No século XX, o porto do Funchal, ao mesmo tempo que era local de comércio e descarga de mercadorias, assim como de passageiros, foi progressivamente assistindo ao surgir de um novo conceito em matéria de turismo, não já apenas e só como mero transporte, mas tendo como objectivo o cruzeiro. Esta Dissertação pretende estudar, quantificar e se possível teorizar, ainda que de forma sucinta, a importância que esse novo tipo de lazer, a partir de agora, por nós designado de cruzeiro, teve, tem e esperamos venha a ter, na nossa economia regional e no bemestar e progresso económico dos múltiplos intervenientes nesta actividade. Para nos apoiar neste desiderato, para além da teoria, construímos um inquérito, que foi apresentado ao turista de cruzeiro, durante a sua escala e a fruição desta, por si mesmo, em passeios a pé pela cidade do Funchal ou guiado por um guia, conhecendo o potencial do nosso porto. Este inquérito foi feito em colaboração com a APRAM, o SNATTI e a EUROMAR, assim como com outros intervenientes nesta cadeia de valor, tendo nós, conceptores e aplicadores do mesmo, procurado seguir uma linha de orientação que nos permitisse a comparação dos resultados, com inquéritos desenvolvidos anteriormente. O nosso objectivo essencial é não apenas o de prosseguir num percurso de valorização pessoal e académica mas também procurar dotar com dados quantificáveis, todos os parceiros deste negócio da nossa região e contribuir de uma forma activa e responsável na definição e planeamento do nosso melhor recurso económico, o Turismo. Esta Dissertação é, por agora, um objectivo em si, mas não se esgota como tal e a nossa missão não termina hic et nunc, uma vez que trabalhamos por mero prazer intelectual, sentimos que somos apoiados institucional e pessoalmente e temos a certeza de que o que estamos a desenvolver, poderá ser útil para a nossa economia e para a nossa Região.