Avaliação do impacto do herbicida glifosato na microbiota do solo e biodegradação por cepas de Fusarium

Investigou-se o impacto e a biodegradação do glifosato pela microbiota do solo. O solo utilizado foi (Argissolo vermelho distrofico arênico) coletado a 30 e 60 cm de profundidade onde foi quantificado a taxa de CO2 produzido e as UFC de bactérias e fungos . Foram utilizadas 5 cepas de fungos filamentosos pertencentes do gênero Fusarium crescidos em meio de cultura Czapeck com adição de glifosato, no qual foram testadas: a utilização como substrato, a concentração máxima inibitória e a biodegradação em agitador e em biorreator. Foi observado que a introdução do herbicida no solo não apresentou efeito negativo sobre a microbiota e que a população de bactérias cultiváveis foi mais numerosa que a de fungos. Dentre as cepas testadas nenhuma foi inibida pela presença do glifosato, mesmo a altas concentrações. Todas as cepas estudadas foram capazes de biodegradá-lo e utilizá-lo como fonte de nutriente. A formação de consórcio não apresentou maior eficiência na metabolização do composto quando comparado as culturas crescidas puras, sendo a biodegradação em biorreator mais eficiente que aquela realizada em agitador horizontal.

Dessorção do herbicida atrazina e atividade microbiana em duas classes de solos do Estado do Rio Grande do Sul

A atrazina (ATZ) foi utilizada em experimentos de laboratório para estudos de mineralização e dessorção em amostras de Argissolo Vermelho (PV) e Vertissolo Ebânico (VE), sob campo nativo, com o intuito de identificar os atributos do solo que afetam estes processos. A influência da umidade do solo sobre a atividade microbiana foi avaliada variando-se os teores de umidade em 20, 40, 65 e 85% da capacidade de água disponível do solo (CAD) e aplicando-se 1,5 kg de princípio ativo ha-1 (menor dose recomendada (DR)). Para a avaliação do efeito das doses do herbicida ATZ sobre a atividade microbiana e sobre a taxa de degradação do herbicida foram feitas aplicações de 1x, 2x, 4x, 7x e 10x a DR. Na avaliação do efeito da matéria orgânica sobre a atividade microbiana e sobre a taxa de degradação da ATZ foi feita a aplicação de 10x a DR. Num estudo adicional foram testados quatro métodos de desinfestação de solos (fumigação, tindalização, autoclavagem e irradiação em forno de microondas). A determinação da ATZ na solução foi feita por cromatografia gasosa em extratos de metanol. A atividade microbiana foi monitorada pela evolução de CO2 e a microbiota foi avaliada pela contagem de unidades formadoras de colônias Os resultados indicam que a população microbiana apresenta maior atividade entre 65 e 85% de umidade da CAD e que o aumento das doses de aplicação da ATZ não provoca alterações relevantes na atividade microbiana. Aproximadamente 70% do herbicida aplicado fica sorvido ao solo, independentemente de dose de ATZ aplicada e da classe de solo estudada (PV e VE). As taxas de degradação da ATZ lábil foram baixas e dependentes de doses e tipos de solos, sendo maiores em doses mais elevadas e em solos com maior teor de C. Dentre os métodos de desinfestação, a irradiação em forno de microondas foi o mais adequado, uma vez que apresentou um comportamento similar à testemunha quanto à sorção do herbicida e foi eficiente na redução da população microbiana do solo.

Estudo sobre a biodegradação do herbicida trufluralina por bactérias isoladas de solo agrícola e proposta metodológica para o ensino de biodegradação

Trifluralina (a, a, a,trifluoro-2,6-dinitro-N, N-dipropil-p-toluidina) (TFL) é um herbicida pré-emergente, incorporado ao solo que tem sido usado na agricultura desde a década de sessenta; ele é moderadamente persistente em vários tipos de solos do Brasil. O objetivo deste estudo foi isolar - de um solo agrícola contaminado por quatro décadas - e caracterizar bactérias resistentes a TFL, determinar suas habilidades em degradar a TFL, investigar a presença de gens degardadores que possam estar envolvidos na degradação da TFL e propor um método de ensino teórico prático sobre a biodegradação, para cursos de graduação. Oito bactérias foram isoladas, pela técnica de subculturas repetidas em meio contendo TFL como única fonte de carbono, e identificadas, pelo método bioquímico e seqüenciamento do rDNA 16S como Klebsiella oxytoca, Herbaspirillum seropedicae, 3 strains of Bacillus simplex, 2 de Pseudomonas montelli e uma outra Pseudomonas sp. Uma terceira bactéria (iaolado #9), não identificada, que crescia ao redor de cristais de TFL em meio sólido, foi isolada; esta é uma técnica nova que poderá ser útil no isolamento de bactérias que são resistentes a outros compostos pouco solúveis em água. Todas as bactérias isoladas foram submetidas ao teste de biodegradação, em um meio contendo sais minerais, 0,1% succinato, 0,1 % de extrato de leveduras e 50 mg. L-1 de TFL Cinco bactérias reduziram a concentração de TFL no meio, após trinta dias de incubação: Klebsiella oxytoca (24,6 %), Herbaspirillum seropedicae (16,4 %), Bacillus simplex 2 (25.0 %), Bacillus simplex 3 (16.0 %) e isolado 9 (21.0 %). Uma bactéria conhecida como degradadora da TFL, Brevundimonas diminuta (NCIMB 10329) degradou a TFL, neste meio, de maneira semelhantes ao das bactérias isoladas. Os DNAs extraídos das quatro bactérias identificadas degradadoras da TFL, foram sondados para os gens catbólicos ndoB, todC, xylX, catA e xylE, os quais codificam as enzimas naftaleno 1,2-dioxigenase, toluene dioxigenase, toluate 1,2-dioxigenase, catecol 1,2-dioxigenase e catecol 2,3-dioxigenase, respectivamente. Técnicas de PCR e hibridização demonstraram que os DNAs de todas estas quatro bactérias foram fortemente hibridizadas para o gen ndoB, contudo, usando a técnica de ¨zonas claras¨, observou-se que nenhuma delas degradou naftaleno. Estes resultados indicam a presença de gens dioxigenases, nestas bactérias degradadoras da TFL, que poderiam estar transformando a TFL como substrato principal, ou como cometabolismo. O conhecimento sobre processos de biodegradação é necessário para os graduados dos cursos de agronomia, química, biologia, tecnologia de alimentos, etc. Neste trabalho, também, propomos o estudo teórico e prático da compostagem o qual estimula o interesse dos estudantes em aprender sobre o metabolismo envolvido neste, e em outros, processos biotecnológicos.

Toxicidade reprodutiva do herbicida glifosato-Roundup em ratos Wistar.

Nos últimos 50 anos houve uma redução significativa na fertilidade de animais selvagens. Estudos revelam que as alterações morfológicas e fisiológicas sobre os órgãos reprodutivos de animais e também de seres humanos podem ser conseqüência da exposição a contaminantes ambientais. Vários pesticidas presentes no ambiente têm sido apontados como substâncias capazes de afetar o sistema endócrino, incluindo efeitos sobre a reprodução (COLBORN et al., 1993). Inúmeros fatores contribuem para que o Brasil seja um dos maiores consumidores de pesticidas do mundo. E, neste país, os herbicidas são os pesticidas líderes em vendas. O Roundup® é o herbicida mais utilizado, sendo comercializado em preparação contendo 36% de glifosato e 18% de polioxietilenamida (POEA) (ANVISA, 2002a e 2002b). Estudos de toxicidade reprodutiva realizados com o glifosato técnico referem a possibilidade de efeito sobre o sistema reprodutivo (WHO, 1994). Entretanto a literatura carece de estudos sobre os efeitos do POEA e dos produtos comerciais que o contém associado ao glifosato (DALLEGRAVE, 2002). Sendo assim, o presente trabalho objetivou verificar a influência do herbicida glifosato-Roundup® sobre a fertilidade e o desenvolvimento de ratos Wistar e a possibilidade deste desregular o sistema endócrino. Foram avaliados os efeitos do herbicida glifosato Roundup (lote BS 1096/98) sobre a reprodução de ratos Wistar, incluindo os efeitos teratogênicos (segmento II), sobre fertilidade e performance reprodutiva de machos e fêmeas (segmento I) e sobre animais expostos pré e perinatalmente (segmento III). As concentrações desejadas foram elaboradas mediante adição de água destilada. As progenitoras do ensaio de teratogenicidade foram tratadas, por via oral, com 500, 750 ou 1000mg/kg de glifosato (Roundup) ou água destilada (10ml/kg), do 6° ao 15° dia de gestação. Os animais da geração paterna (segmento I) foram tratados diariamente, por via oral, com 50, 150 ou 450mg/kg de glifosato (Roundup) ou água destilada (10ml/kg). Os machos foram tratados por 70 dias no pré-acasalamento e por 15 dias consecutivos na fase de acasalamento. As fêmeas foram tratadas por 15 dias no pré-acasalamento, de 1 a 15 dias na fase de acasalamento, por 21 a 23 dias durante a gestação, e aquelas que foram deixadas parir, por mais 21 dias referente ao período de lactação. A segunda geração (segmento III) foi exposta apenas durante a gestação e a lactação (fêmeas do segmento I). Os resultados do ensaio de teratogênese mostraram sinais de toxicidade materna com 50% de letalidade para as fêmeas tratadas com 1000mg/kg e sinais de retardo de desenvolvimento do esqueleto dos fetos. Os machos da geração paterna mostraram sinais de toxicidade sistêmica, com aumento na massa relativa de fígado e rins, acompanhado de alterações histopatológicas, e de toxicidade reprodutiva, caracterizada por alterações histopatológicas nos testículos, redução na concentração de espermatozóides, na produção diária de espermatozóides, na concentração de testosterona e aumento no percentual de espermatozóides anormais. As fêmeas da geração paterna não apresentaram sinais de toxicidade sistêmica e/ou reprodutiva nas variáveis avaliadas. Os machos expostos durante as fases pré e perinatal manifestaram sinais de toxicidade reprodutiva, caracterizados por alterações histopatológicas nos testículos, como degeneração das espermátides em ambas as fases, aumento no percentual de espermatozóides anormais na puberdade e redução na concentração de espermatozóides na fase adulta. As fêmeas expostas durante as fases pré e perinatal não apresentaram sinais de toxicidade sistêmica e/ou reprodutiva nas variáveis avaliadas, como também a prole das mesmas não manifestou alterações de desenvolvimento ponderal ou geral. Este estudo revelou que o herbicida glifosato-Roundup provocou um retardo no desenvolvimento esquelético dos fetos expostos durante a fase de organogênese. Afetou ainda o sistema reprodutivo masculino de indivíduos tratados na fase adulta e expostos durante as fases pré e perinatal, interferindo nas variáveis de fertilidade masculina em puberdade e fase adulta. Também houve sinais de toxicidade sistêmica nas fêmeas do ensaio de teratogênese (segmento II) e nos machos do ensaio de fertilidade e performance reprodutiva (segmento I), em doses muito inferiores aquelas referidas na literatura (WHO, 1994) para o glifosato grau técnico. Conclui-se que o glifosato-Roundup manifestou maior grau de toxicidade sistêmica, reprodutiva masculina e de desenvolvimento esquelético fetal, do que o referido na literatura para o glifosato grau técnico. E, frente à toxicidade reprodutiva masculina evidenciada neste estudo, pode-se sugerir que o glifosato- Roundup® manifestou efeitos de modulação endócrina e conseqüentemente, potencial desregulador endócrino.

Avaliação pontual da degradação e transporte do herbicida glifosato no solo da bacia do Arroio Donato - Pejuçara (RS)

O Glifosato (herbicida sistêmico não seletivo, altamente usado no cultivo de arroz e soja) tem sido muito utilizado sob sistema de plantio direto, na região noroeste do Rio Grande do Sul, podendo ser considerado como o principal herbicida de aplicação. O presente estudo visa uma avaliação da degradação e transporte do Glifosato na bacia do Arroio Donato, cuja área é de aproximadamente 1,1 km2 no município de Pejuçara (RS). As amostras foram coletadas diretamente na lavoura, nas profundidades de 5, 10, 25 e 50 cm de um único ponto da lavoura de soja em dois períodos: 5 e 137 dias após a aplicação do herbicida. As amostras foram extraídas com solução de hidróxido de sódio e os extratos submetidos a processo de clean up em resinas CHELEX 100 e AG1-X8, seguido de concentração em rotavapor. Os extratos, assim obtidos, foram analisados por cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE), com reação pós-coluna. Os resultados obtidos revelaram que nas amostras da coleta após cinco dias de aplicação do herbicida, o Glifosato foi somente detectado nas profundidades de 5 e 10 cm. Já o seu metabólito AMPA (Ácido aminometilfosfônico) foi identificado em todas as profundidades analisadas. Nas amostras da coleta de 137 dias após a aplicação, o herbicida Glifosato só foi constatado na amostra de 5 cm profundidade, enquanto que o seu metabólito AMPA foi identificado em todas as profundidades. Tais dados induzem que ocorre uma baixa tendência de lixiviação do Glifosato para camadas inferiores do solo em estudo, provavelmente devido sua forte interação com o solo. A presença do metabólito AMPA, em todas as camadas em estudo pode indicar sua lixiviação para camadas inferiores uma vez que, foi possível detectá-lo em todas as profundidades. Desta forma, fica claro que não houve degradação total do Glifosato em seu principal metabólito (AMPA) após um período de mais de quatro meses de aplicação.

Estudo de diferentes métodos de extração por Ultra-Som de pesticidas em latossolo utilizando técnicas cromatográficas

Amostras de solo (latossolo vermelho destroférrico) coletadas em três pontos distintos, no município de Caibaté (Região das Missões, RS), na profundidade de aproximadamente 10 cm (da superfície do solo), em diferentes estações do ano e com diferentes tipos de manejo de solo (plantio convencional; plantio direto e cultivo mínimo), foram analisadas com o intuito de verificar a presença e a persistência de pesticidas no solo. Adicionalmente foi avaliada a relação entre a concentração dos produtos e tipo de manejo de solo aplicado. Este estudo é justificado por ser esta região de caráter tipicamente agrícola, com uso sistemático de pesticidas, tais como: monocrotofós, tiabendazole, triadimenol, lufenuron e imazetapir. Primeiramente foram estudadas as melhores condições de extração, considerando as técnicas mais comumente utilizadas, como o soxhlet, o banho e a sonda de ultra-som. As análises foram realizadas por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência com Detector UV-visível (lufenuron e imazetapir) e Cromatografia Gasosa com Detector Seletivo de Massas (monocrotofós, tiabendazole e triadimenol), dependendo das características do analito em estudo. Os resultados mostram a presença de todos os pesticidas estudados, permitindo inferir que os mesmos persistem no solo. Além disto, os resultados indicam que não há uma uniformidade da extração dos analitos nas amostras dos solos, que foram extraídas com as técnicas de soxhlet, banho e sonda de ultra-som. Tais diferenças podem ser devido à heterogeneidade das amostras ou uma extração seletiva dos analitos. Quanto as influências do tipo de manejo das lavouras, não foi possível constatar a contribuição destas formas de plantio para a persistência de resíduos de pesticidas no solo.

Análise da associação dos herbicidas Metribuzin e Cloazone como modelo para o estudo do sinergismo entre herbicidas

Hipotetiza-se que haja sinergismo na associação de herbicidas inibidores do fotossistema II e da síntese de carotenóides, pelos seus mecanismos de ação específicos. Com o objetivo de demonstrar a existência de sinergismo na associação de herbicidas pertencentes a estes dois grupos foram conduzidos trabalhos em laboratório, casa-de-vegetação e a campo. Em laboratório avaliou-se a interação de metribuzin e clomazone através da estimativa do estresse oxidativo gerado pela associação, em plantas de girassol, com a determinação dos níveis de malondialdeído e extravasamento eletrolítico. Em casa-de-vegetação, plantas de girassol foram tratadas com os mesmos herbicidas e foram tomadas amostras para eletromicrografias que produziram visualização dos cloroplastos tratados e não tratados. Também foram aplicados tratamentos a fim de permitir a formação de curvas de resposta às doses dos mesmos herbicidas, com a representação das doses causadoras de 50% de efeito em isobologramas. Avaliou-se também o impacto da associação metribuzin e clomazone sobre as relações de interferência entre soja e girassol, pelo delineamento dialélico A campo foram conduzidos experimentos de controle de Bidens pilosa infestando a cultura da soja com os herbicidas metribuzin e clomazone. Para avaliar a seletividade das associações, conduziu-se experimentos com a cultura da soja, onde testou-se metribuzin e clomazone e com a cultura do milho, testando-se atrazine e isoxaflutole. Nos trabalhos com malondialdeído, extravasamento eletrolítico e eletromicrografias, obteve-se sinergismo valendo-se do método de Colby. No ensaio de curvas de resposta, a variável massa seca apresentou probabilidade de sinergismo de 0,90 em uma combinação. No dialélico, a associação dos produtos reduziu a tolerância da soja ao metribuzin e à sua associação com clomazone. No controle de B. pilosa, as variáveis percentual de cobertura e controle demonstraram sinergismo pelo método de Limpel. Na avaliação de seletividade, não se observou nenhum dano resultante da associação dos herbicidas.

Efeito in vitro dos ácidos etilmalônico e metilsucínico sobre as atividades enzimáticas dos complexos da cadeia respiratória mitocondrial e da creatina quinase em córtex cerebral, músculo esquelético e músculo cardíaco de ratos jovens

A deficiência de desidrogenase das acil-CoA de cadeia curta (SCAD) é um erro inato do metabolismo devido a um defeito no último ciclo de β-oxidação, sendo específica para ácidos graxos de cadeia curta (4 a 6 carbonos), resultando no acúmulo de ácidos orgânicos de cadeia curta, principalmente dos ácidos etilmalônico e metilsucínico, formados pela metabolização por rotas secundárias do butiril-CoA acumulado. A deficiência de SCAD manifesta-se principalmente no período neonatal ou durante a infância e até mesmo na idade adulta. Os achados clínico-laboratoriais são heterogêneos, incluindo acidose metabólica, acidose lática, vômitos, atraso no desenvolvimento, convulsões, fraqueza muscular e miopatia crônica. No entanto, o sintoma mais comum apresentado pelos pacientes portadores dessa deficiência é a disfunção neurológica, a qual pode estar relacionada ao acúmulo de ácidos orgânicos de cadeia curta e sua toxicidade ao sistema nervoso central. No presente trabalho nosso objetivo foi investigar o efeito in vitro dos ácidos etilmalônico e metilsucínico sobre algumas atividades enzimáticas fundamentais para o metabolismo energético. Visando contribuir para uma melhor compreensão da fisiopatogenia dessa doença testamos o efeito desses metabólitos sobre a atividade dos complexos da cadeia respiratória e da creatina quinase em córtex cerebral, músculo esquelético e músculo cardíaco de ratos jovens. Verificamos que os ácidos etilmalônico e metilsucínico, na concentração de 1 mM, inibiram significativamente a atividade do complexo I+III da cadeia respiratória em córtex cerebral de ratos, porém não alteraram a atividade dos demais complexos da cadeia respiratória (II, SDH, II+III, III e IV) nesses tecido bem como não alteraram a atividade de todos os complexos da cadeia repiratória em músculo esquelético e músculo cardíaco dos ratos nas concentrações de 1 e 5 mM. Observamos também que o ácido etilmalônico (1 e 2,5 mM) reduziu de forma significativa a atividade total de creatina quinase em córtex cerebral de ratos, mas não alterou essa atividade nos músculos esquelético e cardíaco. Por outro lado o ácido metilsucínico não modificou a atividade total da creatina quinase em nenhum dos três tecidos estudados, córtex cerebral, músculo esquelético e músculo cardíaco de ratos. Testamos então o efeito do ácido etilmalônico sobre a atividade da creatina quinase nas frações mitocondrial e citosólica de córtex cerebral, músculo cardíaco e músculo esquelético de ratos. O ácido (1 e 2,5 mM) inibiu significativamente a atividade da creatina quinase apenas na fração mitocondrial de córtex cerebral. Demostramos também que o antioxidante glutationa (1 mM) preveniu o efeito inibitório do ácido etilmalônico sobre a atividade total da creatina quinase em córtex cerebral. A glutationa (0,5 mM) e o ácido ascórbico (0,5 mM) também preveniram o efeito inibitório do ácido etilmalônico sobre a atividade da creatina quinase na fração mitocondrial de córtex cerebral. Por outro lado a adição de L-NAME ou trolox não alterou o efeito inibitório do ácido etilmalônico sobre a atividade da creatina quinase. Esses resultados indicam que o ácido etilmalônico possui um efeito inibitório específico sobre a isoforma mitocondrial da creatina quinase do cérebro, ou seja, sobre a CKmi a, não afetando a isoenzima citosólica cerebral ou as isoenzimas citosólicas e mitocondrial presentes no músculo esquelético e no músculo cardíaco. Além disso, o efeito da glutationa, que atua como um agente redutor de grupos tióis, indica que a ação inibitória do ácido etilmalônico sobre a creatina quinase pode estar relaciona à oxidação de grupos sulfidrila essenciais à atividade da enzima. Já a prevenção do efeito inibitório do ácido etilmalônico causada pelo ácido ascórbico sugere que o ácido pode estar envolvido com a formação dos radicais superóxido e hidroxila, uma vez que este agente antioxidante atua sobre esses radicais livres. Essas observações em seu conjunto indicam que os ácidos etilmalônico e metilsucínico comprometem o metabolismo energético cerebral através da inibição de atividades enzimáticas essenciais para a produção e transporte de energia pela célula. É, portanto, possível que esse possa ser um dos mecanismos envolvidos com o dano cerebral que ocorre nos pacientes afetados por deficiência de SCAD.

Variabilidade de isolados de estirpes de Bradyrhizobium ssp recomendadas para a cultura da soja

A produção da soja em escala comercial tem sido viabilizada técnica e economicamente, entre outros fatores, devido a fixação biológica do N2 por estirpes de Bradyrhizobium que podem suprir a demanda de nitrogênio desta leguminosa. No entanto, a variabilidade existente nas estirpes de Bradyrhizobium spp recomendadas para inoculação da soja tem comprometido o processo simbiótico. Variantes espontâneos isolados a partir das estirpes de B. japonicum (SEMIA 5079 e SEMIA 5080) e B. elkanii (SEMIA 587 e SEMIA 5019) foram avaliados quanto ao desempenho simbiótico (eficiência, nodulação em diferentes hospedeiros e competitividade), indução de clorose foliar em diferentes hospedeiros, morfologia colonial, habilidade de metabolização de carboidratos e tolerância à salinidade em diferentes temperaturas de incubação. Nas etapas de eficiência simbiótica e competitividade foi usada a cultivar de soja BR-16 e na avaliação da nodulação e indução de clorose foliar foram usados os seguintes hospedeiros: soja (Glycine max) (cultivares Clark e Peking), caupi (Vigna unguiculata) e guandu (Cajanus cajan). A caracterização genotípica foi realizada através da reação em cadeia da polimerase (PCR), com os oligonucleotídeos iniciadores BOX A 1-R, ERIC e RP01 Os resultados obtidos demonstraram que variantes e estirpes originais diferem quanto a características fenotípicas, e que diferenças nos perfis eletroforéticos de DNA analisados através da amplificação com os oligonucleotídeos iniciadores testados, evidenciaram a variabilidade genética presente entre as estirpes originais e os variantes selecionados. A cultivar de soja Clark, assim como caupi e guandu foram susceptíveis à rizobiotoxina produzida por estirpes e variantes de B. elkanii. Embora não se tenha verificado diferenças na nodulação em diferentes hospedeiros quando variantes ou estirpes de B. japonicum e B. elkanii foram inoculados em soja, caupi e guandu, foi observado uma simbiose eficiente para a soja (cultivares BR 16, Clark e Peking). A partir da variabilidade existente nas estirpes SEMIA 587, SEMIA 5019, SEMIA 5079 e SEMIA 5080 foram selecionados variantes eficientes e competitivos quanto à fixação de N2 em soja.

Determinação da mutagenicidade e atividade citotóxica de sedimentos em área sujeita à contaminação petroquímica

O acúmulo de mutações, alterações incorporadas ao patrimônio genético de células somáticas e germinais, pode causar redução de populações naturais que são críticas para a cadeia alimentar, pondo em risco a sobrevivência de determinadas espécies. Embora o dano causado pela contaminação química ocorra em nível molecular, existem efeitos emergentes nas populações, tais como perda da diversidade genética, que não é previsível com base somente no conhecimento dos mecanismos de toxicidade não genéticos. Alguns compostos de origem antrópica tendem a adsorver no material orgânico do sedimento, sendo concentrados ao longo do tempo. Contaminantes ambientais podem ser mais associados com a porção fina dos sedimentos (silte ou argila) do que com a grosseira (areia ou cascalho). O presente estudo avaliou a atividade mutagênica e citotóxica de extratos moderadamente polares de sedimento em três pontos durante 5 coletas realizadas nos anos de 1999 e 2000 no arroio Bom Jardim, que drena a região do Complexo Petroquímico, localizado no município de Triunfo, Rio Grande do Sul. Foi utilizado na avaliação da mutagenicidade e citotoxicidade o ensaio Salmonella/microssoma, método de microssuspensão. A análise de granulometria mostrou um conteúdo de partículas finas em média menor no ponto em frente ao complexo, sendo este também o ponto amostral com menor percentual de material orgânico extraído. Observou-se baixa atividade mutagênica nos diferentes locais estudados, variando de 3,3% até 8,3%, sendo a citototoxicidade o mais importante efeito biológico observado na região, variando de 20% até 40%, somados os resultados dos ensaios em presença e ausência de metabolização externa. Os pontos com maior contaminação estão localizados em frente e a jusante da área industrial, havendo uma distribuição gradativa e sazonal das respostas à medida que o local se aproxima da foz do arroio. Em ensaios com ausência de fração de metabolização hepática, as respostas para mutagênese e citotoxicidade foram mais freqüentes, sendo os danos do tipo erro no quadro de leitura os mais presentes. A determinação da atividade mutagênica e citotóxica em amostras de sedimento mostrou-se importante na determinação da qualidade ambiental, apesar da composição química desta matriz ser bastante complexa. O ensaio Salmonella/microssoma monitorando danos moleculares e, principalmente citotoxicidade, foi uma ferramenta importante no diagnóstico da presença de poluentes. A possibilidade de avaliar danos precoces, através deste ensaio, promove a melhoria da qualidade ambiental e motiva ações de preservação do patrimônio genético da fauna e flora atingidas pela atividade antrópica.

Ação extra nuclear do ácido retinóico via espécies reativas do oxigênio em células de sertoli

Durante a respiração celular, cerca de 1 a 3% do oxigênio metabolizado produz espécies reativas de oxigênio (ERO). Entretanto, para defender o organismo do efeito dessas espécies, existem vários sistemas antioxidantes, dependendo do organismo, da célula ou do tecido em questão. A Vitamina A (retinol) e seu derivados exercem uma infinidade de efeitos em diversos processos biológicos, destacando-se a embriogênese, visão, regulação de processos inflamatórios, crescimento, proliferação e diferenciação de células normais e neoplásicas. Embora o potencial antioxidante da vitamina A e carotenóides tenha sido descrito primeiramente, sabe-se hoje que, sob diferentes condições, essas moléculas podem se comportar de uma maneira pró-oxidante. Por isso, atualmente são melhores descritas como moléculas redox ativas. Apesar dos nossos trabalhos anteriores demonstrarem um efeito pró-oxidante do retinol em culturas de células de Sertoli, o mecanismo exato pelo qual esse efeito é verificado permanece a ser elucidado. Uma vez que o ácido retinóico (AR) é o metabólito mais ativo do retinol, foram verificados os efeitos da suplementação de AR em culturas de células de Sertoli, com o objetivo de verificar se os efeitos anteriormente observados com o retinol devem-se à metabolização do mesmo a AR. Nossos resultados mostraram que o AR em baixas doses não aumentou os níveis de TBARS. Além disso, na concentração de 1 nM o AR foi capaz de diminuir os níveis de TBARS. Entretanto, quando as células foram tratadas com altas doses de AR foi observado um aumento destes níveis, além de uma diminuição da viabilidade celular. Uma vez que altas doses de AR induziram um aumento na lipoperoxidação e diminuíram a viabilidade celular, nós decidimos investigar somente os efeitos de doses fisiológicas (nM) de AR. Foram dosadas as atividades da SOD, CAT e GPx em células de Sertoli tratadas com AR. A atividade da SOD encontrou-se aumentada em todas as doses testadas. A atividade da GPx mostrou-se aumentada nas células tratadas com 0,1 nM, 1 nM e 10 nM e a atividade da CAT aumentou somente com 1 nM de AR. Esses resultados sugerem que o AR em doses fisiológicas aumenta a atividade das enzimas antioxidantes, protegendo, assim, as células do estresse oxidativo, como pode ser observado nos índices de lipoperoxidação e viabilidade celular. Todavia, o mecanismo pelo qual o AR induz a geração de ERO é desconhecido. Então nós decidimos verificar a ação anti ou pró-oxidante in vitro do AR. Na concentração suprafisiológica de 10 M, AR foi capaz de degradar a 2-deoxiribose, um substrato específico do radical hidroxil, sugerindo que a auto-oxidação do mesmo é capaz de gerar radicais livres. Além disso, o potencial antioxidante total do AR foi avaliado: altas concentrações de AR (1–10 M) aumentaram a geração de radicais livres. Esses resultados demonstram, pela primeira vez, que o ácido retinóico é capaz de gerar radicais livres e sugerem, pelo menos em parte, que alguns efeitos induzidos por AR podem ser mediados por ERO geradas a partir da degradação espontânea do ácido retinóico. Classicamente, os efeitos biológicos dos retinóides estão relacionados à sua conversão em ácido retinóico através da modulação da expressão de genes. Entretanto, recentes trabalhos têm demonstrado que os retinóides possuem ações biológicas que não envolvem sua interação com receptores nucleares. Assim, alguns autores sugerem que o mecanismo de regulação dos retinóides também seja por modificação do estado redox celular. As concentrações de AR utilizadas nesse trabalho variaram de faixa do fisiológico até a do farmacológico. Sabe-se que as células de Sertoli sintetizam AR a partir do retinol circulante; isso pode ser uma das explicações dos efeitos observados em células de Sertoli tratadas com altas doses de retinol, uma vez que a metabolização de grandes concentrações de retinol poderia acarretar uma grande formação de ácido retinóico.

Desenvolvimento de uma estratégia de fusão gênica visando à localização de proteínas em plantas

Uma significativa quantidade de proteínas vegetais apresenta-se compartimentalizada nas diversas estruturas celulares. A sua localização pode conduzir à elucidação do funcionamento dos processos biossintéticos e catabólicos e auxiliar na identificação de genes importantes. A fim de localizar produtos gênicos relacionados à resistência, foi utilizada a fusão de cDNAs de arroz (Oryza sativa L.) ao gene da proteína verde fluorescente (GFP). Os cDNAs foram obtidos a partir de uma biblioteca supressiva subtrativa de genes de arroz durante uma interação incompatível com o fungo Magnaporthe grisea. Estes cDNAs foram fusionados a uma versão intensificada de gfp e usados para transformar 500 plantas de Arabidopsis thaliana. Outras 50 plantas foram transformadas com o mesmo vetor, porém sem a fusão (vetor vazio). Foram obtidas aproximadamente 25.500 sementes oriundas das plantas transformadas com as fusões EGFP::cDNAs e 35.000 sementes das transformadas com o vetor vazio, produzindo, respectivamente, 750 e 800 plantas tolerantes ao herbicida glufosinato de amônio. Após a seleção, segmentos foliares das plantas foram analisados por microscopia de fluorescência, visando o estabelecimento do padrão de localização de EGFP. Foram observadas 18 plantas transformadas com a fusão EGFP::cDNAs e 16 plantas transformadas com o vetor vazio apresentando expressão detectável de GFP. Uma planta transformada com uma fusão EGFP::cDNA apresentou localização diferenciada da fluorescência, notadamente nas células guarda dos estômatos e nos tricomas. Após seqüenciamento do cDNA fusionado, foi verificado que esta planta apresentava uma inserção similar a uma seqüência codificante de uma quinase, uma classe de enzimas envolvidas na transdução de sinais em resposta à infecção por patógenos.