Padronização da técnica de imunoistoquímica para identificação de Listéria monocytogenes em placentas humanas e tecido nervoso central de ruminantes.

Este projeto foi desenvolvido no Laboratório de Patologia Experimental do Hospital de Clínicas de Porto Alegre (HCPA), com a aprovação da Comitê de Ética em Pesquisa do HCPA e com apoio financeiro parcial do Fundo de Incentivo à Pesquisa e Eventos do HCPA (FIPE). O experimento 1, chamado de projeto piloto, teve como objetivo implementar a técnica de IHQ para identificar a Listeria monocytogenes (L.m.), utilizando anticorpo policlonal antilisteria monocytogenes (Biodesig ). Vários testes foram realizados para acertar a diluição (1:1000) que foi diferente da preconizada pelo fabricante. Os blocos de parafina, de dez placentas provenientes de parto prematuro ou aborto foram utilizados para os cortes histológicos e a preparação das lâminas para a coloração Hematoxilina e Eosina (HE) e imunoistoquímica (IHQ). As lâminas foram identificadas por números para resguardar a identidade das pacientes. O resultado do HE mostrou alterações inflamatórias em oito placentas e L. m. foi identificada pelo IHQ em cinco dessas placentas. O objetivo do 2º experimento foi identificar a L. m. em tecido nervoso cerebral de ruminantes, utilizando a técnica implementada no projeto piloto. O material utilizado neste trabalho foi cedido pelo Setor de Patologia Veterinária do Departamento de Patologia da Universidade Federal de Santa Maria. Os casos estudados (2 ovinos, 1 caprino e 2 bovinos) tinham suspeitas clínicas diversas e as necropsias dos animais evidenciaram aspectos sugestivos da doença. Os cinco casos foram confirmados pelo IHQ, comprovando a importância da utilização desta técnica para o diagnóstico da listeriose no SNC de ruminantes. O 3º experimento objetivou identificar a L. m. em placentas encaminhadas ao Serviço de Patologia do HCPA no ano 2000. Da mesma forma que no experimento 1, as lâminas foram identificadas por números. Após o levantamento realizado nos registros dos exames anatomopatológicos (AP) deste setor, observou-se que 714 AP eram de placentas provenientes de aborto, parto prematuro e nascimento a termo examinados naquele período. Foram sorteados 254 AP para análise através de HE, revelando que 148 desses AP apresentavam alterações inflamatórias (corioamnionite, vilite e deciduite). Os blocos destas placentas foram utilizados para fazer as lâminas e realizar IHQ. A consulta aos prontuários dos casos com alterações inflamatórias permitiu observar que um deles tinha a confirmação bacteriológica de L. m. na placenta, tornando-se este o controle positivo. O controle negativo foi selecionado entre aqueles sorteados que não apresentavam alterações inflamatórias. A presença de L. m. foi identificada em 33,78% das placentas analisadas pela técnica IHQ. Corioamnionite e vilite foram as alterações inflamatórias que mostraram diferença estatística significativa nas placentas positivas. L. m. estava presente nas placentas de 1º, 2º e 3º trimestres gestacionais. A idade das gestantes, casos de aborto e/ou parto prematuro não mostraram diferença estatística significativa com a presença ou ausência de L. m. nas placentas. Abortos habituais ocorreram em pacientes com ou sem L. m. no tecido placentário. Conclusão: a técnica de imunohistoquímica pode ser utilizada para confirmar o diagnóstico histopatológico de listeriose em placentas e tecido nervoso central de ruminantes.

Mastocitose na infância : estudo anátomo-patológico e imuno-histoquímico

Introdução A mastocitose abrange um grupo heterogêneo de condições crônicas caracterizado pela proliferação excessiva de mastócitos nos tecidos. Os sinais e sintomas clínicos são decorrentes da distribuição anatômica dos mastócitos e do efeito funcional dos mediadores produzidos e liberados por estas células. Na infância, a doença é considerada uma condição benigna na maioria dos casos, cujo comprometimento característico é o cutâneo. As mais freqüentes manifestações na pele são os mastocitomas e a urticária pigmentosa. Lesões cutâneas bolhosas podem manifestar-se e acompanhar todas as formas de mastocitose e quando esta apresentação é a predominante, é denominada de mastocitose bolhosa. O diagnóstico de mastocitose é suspeitado clinicamente e confirmado pela histologia. A demonstração do aumento do número de mastócitos nas lesões cutâneas características se constitui no principal critério diagnóstico. Contudo, este método tem dificuldades técnicas que impedem a adequada reprodutibilidade dos achados, dificultando a elucidação de casos duvidosos e retardando seu tratamento. Considerando as propriedades imunológicas e a importância clínica dos mastócitos reveste-se de maior importância compreender o papel destas células nas doenças, sendo indispensável identificá-las e enumerá-las com acurácia nos tecidos. Objetivos Quantificar o número de mastócitos marcados com anticorpo monoclonal antitriptase, através de técnica imuno-histoquímica e análise de imagem, em biópsias cutâneas de crianças, com diagnóstico clínico de mastocitose. Descrever os achados histológicos; quantificar o número de mastócitos marcados com o anticorpo antitriptase entre as diferentes expressões clínicas da mastocitose cutânea; comparar o número de mastócitos entre os casos de mastocitose cutânea e mastocitose associada à sintomas sistêmicos e correlacionar as contagens de mastócitos entre os dois diferentes métodos (coloração por Giemsa com contagem manual e marcação com anticorpo antitriptase e análise digital). Material e Método Foram incluídas no estudo biópsias cutâneas de crianças de 0 a 14 anos, com diagnóstico clínico e histológico de mastocitose. Os casos foram classificados de acordo com a apresentação clínica cutânea em mastocitoma, urticária pigmentosa ou mastocitose bolhosa e assinalada a presença de sintomas sistêmicos associados. Os fragmentos de pele fixados em formalina e emblocados em parafina foram cortados e utilizados para diagnóstico histopatológico convencional, corados com hematoxilina-eosina e Giemsa, e para análise imuno-histoquímica com estreptavidina peroxidase marcados com anticorpo antitriptase. A densidade de mastócitos (número de células por área) foi realizada por um único observador na técnica histológica e através de um sistema de análise de imagem de vídeo no método imuno-histoquímico. Resultados Foram avaliados 33 casos de mastocitose, sendo 21 do sexo masculino. Dez casos (30,3%) apresentavam mastocitoma, 21 (63,6%) urticária pigmentosa e 2 (6,1%) mastocitose bolhosa. Todos os casos da amostra foram classificados como tendo mastocitose incipiente e em 6 (18,8%) pacientes pôde ser identificada a associação com sintomas sistêmicos. Prurido foi o sintoma mais freqüente, sendo relatado em 21 casos. Em 21 dos 33 casos foi identificada a infiltração de mastócitos na derme havendo predominância pela região perivascular (p=0,001, teste exato de Fisher). Não houve diferenças significativas entre a presença de infiltrado mastocitário e as várias formas cutâneas de mastocitose ou a mastocitose sistêmica. A presença de eosinófilos foi identificada em 15 casos (45,5%) e em 10 casos associadamente ao infiltrado perivascular de mastócitos. A densidade de mastócitos na técnica histológica, incluindo-se todos os casos, foi 50,00 células/mm2. Não houve diferença significativa das contagens entre os pacientes com mastocitoma e aqueles com urticária pigmentosa, assim como entre os pacientes com e sem sintomas sistêmicos associados aos cutâneos. A densidade de mastócitos encontrada com a técnica imuno-histoquímica e contagem por análise de imagem foi 158,85 células/mm2. Não houve diferença significativa das contagens entre os pacientes com mastocitoma e aqueles com urticária pigmentosa, assim como entre aqueles com e sem sintomas sistêmicos. Comparando-se a contagem dos mastócitos por área (densidade) entre a histologia e a imuno-histoquímica houve uma diferença significativa (p=0,0001 teste não-paramétrico de Wilcoxon). A média da diferença entre as contagens foi 199,98 células/mm2 (±365,31 DP). Também não houve semelhança, entre os dois métodos, nos grupos mastocitoma e urticária pigmentosa (p=0,005 e p=0,01, respectivamente, teste não-paramétrico de Wilcoxon). Puderam ser identificados 518% a mais de mastócitos com a técnica imunohistoquímica quando comparada com a histológica. Conclusões O presente estudo permite concluir que: 1) a localização preferencial da infiltração de mastócitos é dérmica e perivascular, não sendo possível identificar diferenças histológicas entre casos de urticária pigmentosa e mastocitoma; 2) o número de mastócitos marcados com o anticorpo monoclonal antitriptase e contados com análise digital de imagem, em biópsia de pele de crianças com diagnóstico clínico de mastocitose, foi 159 células por milímetro quadrado; 3) a densidade de mastócitos, foi semelhante entre os casos de urticária pigmentosa e mastocitoma e entre os casos com e sem sintomas sistêmicos associados nas duas diferentes técnicas empregadas; 4) o número de mastócitos por milímetro quadrado com a técnica imuno-histoquímica e a contagem através de análise de imagem foi significativamente maior quando comparada com a coloração através de Giemsa e a contagem manual, com uma diferença média entre os dois métodos de 200 células por milímetro quadrado; 5) a densidade de mastócitos com a técnica imunohistoquímica foi significativamente maior tanto nos casos com urticária pigmentosa quanto nos com mastocitoma, quando comparada com a técnica empregada rotineiramente e 6) com a técnica imuno-histoquímica e a contagem através de análise de imagem foi possível identificar 518% a mais de mastócitos quando comparada com a técnica histológica.

Infecção por HELICOBACTER PYLORI em crianças com dor abdominal crônica e sua associação com a gastrite endoscópica nodular

A infecção por Helicobacter pylori (Hp) é uma das infecções bacterianas mais comuns em todo o mundo. As maiores prevalências da infecção foram encontradas nos países em desenvolvimento, onde, em geral são altas já na infância. O método diagnóstico considerado mais acurado para a infecção por Hp, em crianças, é o exame endoscópico com biópsias gástricas. Alguns autores referem que o único aspecto macroscópico que pode predizer a infecção é o da presença de nodosidades na mucosa gástrica. Este aspecto é denominado de gastrite endoscópica nodular. A especificidade da gastrite endoscópica nodular para a infecção por Hp, entretanto, recentemente foi questionada por outros autores. Realizamos um estudo transversal em uma amostra de crianças (um a 12 anos) com dor abdominal crônica, que preenchiam os critérios para a realização de endoscopia digestiva alta, no Hospital da Criança Conceição e no Hospital de Clínicas de Porto Alegre, de setembro de 1997 a setembro de 1999. O objetivo principal foi verificar a associação entre a infecção por Hp e a gastrite endoscópica nodular nessas crianças. A amostra foi constituída de 185 crianças de ambos os sexos, com baixa renda familiar, cujos pais apresentavam baixo nível de escolaridade. Foi realizado estudo histológico das lâminas de biópsia gástrica (no mínimo cinco fragmentos, corados com H-E ou Giemsa), conforme o Sistema Sydney modificado. A infecção por Hp foi caracterizada pela presença de Hp na lâminas de biópsias gástricas dos pacientes e a gastrite folicular, pela presença de folículos linfóides bem formados, em mucosa gástrica inflamada. A prevalência da infecção por Hp nas crianças com dor abdominal crônica foi de 27% (IC 95%: 20,8-34,0). Foi demonstrada uma associação muito forte entre a infecção por Hp e a gastrite endoscópica nodular nessas crianças (P<0,001; RP = 29,7). Houve um aumento da prevalência tanto da infecção por Hp como da gastrite endoscópica nodular com a idade dos pacientes. A gastrite endoscópica nodular , embora tenha demostrado uma baixa sensibilidade (44,0%), apresentou um valor preditivo positivo de 91,7% para a infecção por Hp. Tanto o teste de urease, como a gastrite endoscópica nodular mostraram-se muito específicas, 94,5% e 98,5%, respectivamente, para o diagnóstico da infecção. Quando se combinou o teste de urease com o aspecto de gastrite endoscópica nodular, encontrou-se, uma sensibilidade muito baixa (34,7%), mas uma especificidade de 100% para a infecção por Hp. A sensibilidade do teste de urease, isolado, para a infecção foi de 60,4% e o seu valor preditivo positivo de 80,5%. O aspecto endoscópico (gastrite endoscópica nodular) teve associação com o microscópico (gastrite folicular) (P<0,001). Houve uma forte e significativa associação entre a infecção por Hp e a gastrite crônica ativa ( P<0,001; RP = 10,8). O mesmo foi demonstrado entre a gastrite nodular e a gastrite crônica ativa (P<0,001; RP = 8,6). Também foi verificado um nítido aumento das razões de prevalência da gastrite crônica ativa e da gastrite endoscópica nodular, com a acentuação dos graus de densidade de Hp. Finalmente, foi demonstrada a importante correlação entre o grau de intensidade da gastrite, verificado no exame histológico, e a gastrite endoscópica nodular (r = 0,97; P<0,001). A prevalência da infecção por Hp encontrada em Porto Alegre, nas crianças, foi menor do que a de outras cidades brasileiras e similar àquela registrada em algumas cidades do primeiro mundo. A presença de nodosidade na mucosa gástrica foi a alteração, à endoscopia, mais freqüentemente verificada nas crianças com infecção por Hp. Considerando a baixa prevalência da infecção encontrada na nossa amostra, a presença de gastrite endoscópica nodular significa uma elevada probabilidade de infecção por Hp, dado o alto valor preditivo verificado. O achado negativo para a gastrite endoscópica nodular, entretanto, não exclui a possibilidade da presença de infecção por Hp. Uma maior colonização bacteriana da mucosa gástrica estaria associada ao aparecimento da gastrite endoscópica nodular, já que a sua prevalência aumentou com os graus de densidade de Hp, assim como ocorreu com a gastrite crônica ativa. E quando ocorre, nas crianças, há maior probabilidade de se tratar de uma gastrite mais ativa e mais intensa.

Análise morfométrica digital na parede aórtica de suínos após implante de stents não revestidos versus stents revestidos com dacron

Os stents são dispositivos intravasculares implantados com o objetivo de dilatar ou fixar a placa de colesterol contra a parede arterial. O objetivo avaliar dois tipos de stents de aço inoxidável, um recoberto com poliéster (dacron) e outro não recoberto, implantados na aorta infra-renal de suínos jovens, foram avaliados por morfometria digital para medir o espessamento intimal. Foi realizado um estudo experimental randomizado, separados em dois grupos(stents não revestidos e revestidos com dacron) e duas fases (I e II). Oito stents recobertos com dacron e oito stents de aço inoxidável (30mm de extensão e 8 mm de diâmetro), não revestidos, foram implantados através de abordagem retroperitoneal na aorta infrarenal normal de 16 suínos normolipêmicos. Para a passagem do sistema de implante, foi necessário uma pequena arteriotomia na aorta distal (fase I). Após quatro semanas, a aorta com os stents foram removidas em monoblocos (fase II). Os valores de hematimetria e do lipidograma foram coletados nas duas fases e não apresentaram alterações que pudessem influenciar o estudo. Amostras de tecido dos sítios de fixação (proximal e distal) dos stents foram retiradas, confeccionadas lâminas, que foram coradas pelas técnicas de hematoxilina e eosina de Verhoeff e enviadas para análise morfométrica digital. A camada intima distal não apresentou diferença estatística significativa. A camada média proximal das porções proximal e da porção distal não apresentaram diferença entre os grupos. Os dois tipos de stents apresentaram 100% de perviedade, boa biocompatibilidade e boa incorporação a parede aórtica de suínos normolipêmicos. A camada íntima proximal do grupo de stents revestidos com dacron apresentou espessura maior do que os stents não revestidos, mas com significância estatísitica limítrofe.

Modelo experimental de lesões intra-epiteliais e de adenocarcinoma ductal pancreático induzidos por 7,12-dimetilbenzantraceno em camundongos

INTRODUÇÃO: O adenocarcinoma de pâncreas apresenta um mau prognóstico. A utilização de modelos experimentais é necessária para a compreensão do comportamento biológico tumoral, principalmente das lesões precoces (neoplasias intra-epiteliais pancreáticas - NIPan) e para o desenvolvimento de opções terapêuticas. OBJETIVO: Avaliar a carcinogênese pancreática induzida por 7,12-dimetilbenzantraceno (DMBA), em camundongos, aplicando a classificação das neoplasias intra-epiteliais pancreáticas. MÉTODOS: 90 camundongos machos, mus musculus, da cepa CF1, foram submetidos à laparotomia mediana e 1 mg de DMBA foi implantado na porção cefálica do pâncreas. Os animais foram divididos em dois grupos, com eutanásia em 30 e 60 dias. Em seguida, o pâncreas foi retirado, fixado em formalina e foram confeccionadas lâminas coradas com hematoxilina eosina. Os cortes histológicos foram avaliados por dois patologistas de acordo com os seguintes critérios: pâncreas normal, hiperplasia reacional, NIPan 1A, NIPan 1B, NIPan 2, NIPan 3 e carcinoma. As alterações inflamatórias também foram analisadas. RESULTADOS: A avaliação patológica evidenciou, no grupo de 30 dias: 4 (16,7%) animais com hiperplasia reativa, 16 (66,6%) com NIPan e 4 (16,7%) com adenocarcinoma. No grupo de 60 dias: 10 (27,1%) animais com hiperplasia reativa, 13 (35,1%) com NIPan e 14 (37,8%) com adenocarcinoma. A diferença entre os grupos apresentou significância estatistística (P < 0,05 – teste exato de Fisher). A prevalência de alterações inflamatórias em 30 dias foi: pancreatite aguda (n=11), pancreatite crônica (n=5) e inflamação dependente da bolsa (n=8). No grupo de 60 dias 11 espécimes apresentavam pancreatite aguda e 26 pancreatite crônica. CONCLUSÕES: O modelo experimental com DMBA em camundongos, induz neoplasia intra-epitelial pancreática e adenocarcinoma ductal histologicamente semelhantes ao carcinoma pancreático em humanos. Este modelo pode ser utilizado na investigação da carcinogênese com enfoque na progressão molecular das lesões precursoras até o adenocarcinoma.