O mutante pso9-1 de Saccharomyces cerevisiae, sensível a psoralenos fotoativados, contém um alelo mutante do gene MEC3 envolvido em checkpoint

Análises de complementação do mutante pso9-1, sensível a psoralenos mono- e bifuncionais fotoativados, UV254nm e nitrosoguanidina, com os mutantes pso1 a pso8, confirmou que este contém uma nova mutação pso. A clonagem molecular a partir de um banco genômico de levedura sugeriu pso9-1 como alelo mutante do gene de checkpoint que responde a danos no DNA MEC3. A não-complementação de vários fenótipos de sensibilidade em diplóides pso9-1/mec3∆ confirmou o alelismo dos dois mutantes. A sensibilidade à calcofluor white e à cafeína não foi aumentada nas linhagens pso9-1 e mec3∆, em relação as suas respectivas selvagens, sugerindo que o mutante pso9-1 não porta uma mutação na região promotora. O fenótipo mutante de mec3∆ foi levemente mais pronunciado para sensibilidade à 8-MOP + UVA e UVC, e para a supressão de mutação para frente induzida por UVC, sugerindo uma função residual para a proteína produzida por este alelo mutante.

Caracterização molecular da mutação pso8-1/rad6 de Saccharomyces cerevisiae, sensível à fotoadição de psoralenos, à radiação UVC e a mutágenos químicos

Um novo mutante isolado da levedura Saccharomyces cerevisiae, sensível à fotoativação de psoralenos mono- e bi-funcionais, à UVC e ao MNNG, complementou o fenótipo de sensibilidade à fotoadição de psoralenos conferido pelas mutações pso1 a pso7 e assim foi chamado pso8-1. O duplo mutante pso8-1 rad4-4 foi altamente sensível à UVC, indicando assim uma interação sinergística dos dois mutantes alelos. A clonagem molecular pela complementação do fenótipo de sensibilidade à radiação UVC do mutante pso8-1 e estudos genéticos revelaram que pso8-1 é alelo ao gene RAD6. O produto do gene RAD6/UBC2 é uma enzima conjugada à ubiquitina envolvida em reparação de DNA, esporulação, recombinação, indução de mutagênese, degradação de proteínas, genes silenciosos, transposição Ty1. Enquanto o mutante pso8-1 apresenta um fenótipo mutador espontâneo e possui baixa mutabilidade induzida a mutágenos, a esporulação de diplóides homoalélicas mostrou eficiência próxima à da linhagem selvagem. A análise da seqüência do mutante alelo mostrou que pso8-1 contém uma nova, e até agora desconhecida, transição T→C no nucleotídeo 191, levando à substituição de uma prolina altamente conservada por uma leucina na posição 64 (Rad6-[P64L]) que pode ter severas conseqüências na estrutura terciária da proteína mutada, e conseqüente ligação a pRad18.

Caracterização molecular dos genes PSO2 e PSO4 de Saccharomyces cerevisiae envolvidos na reparação do DNA : análise funcional e identificação de interações proteína-proteína

O alelo mutante termo-condicionalmente letal pso4-1 do gene PRP19, que codifica uma proteína associada ao spliceossoma, permitiu investigar a influência deste gene no processamento de pré-mRNA, reparação do DNA e esporulação. Fenótipos relacionados a genes portadores de introns foram correlacionados à temperatura. Sistemas repórteres para processamento de pré-mRNA e RT-PCR mostraram que eficiência de processamento de mRNA no mutante pso4-1 é inversamente correlacionada com a temperatura de crescimento. Uma mutação pontual, substituindo uma leucina por uma serina foi identificada dentro da região codificadora N-terminal do alelo Pso4-1 e afeta as propriedades bioquímicas de Pso4-1p. Entre 24 clones isolados utilizando o sistema doishíbridos, 7 foram identificados como partes dos genes RAD2, RLF2 e DBR1. RAD2 codifica uma endonuclease indispensável para a via reparação por excisão de nucleotídeos (NER), RLF2 codifica a subunidade maior do fator de montagem da cromatina I, cuja deleção resulta em sinsibilidade à radiação UVC, enquanto que DBR1 codifica uma enzima que atua sobre substratos de RNA na forma lariat, degradando estruturas lariat em introns durante o processamento de mRNA. A caracterização dos fenótipos após tratamentos com mutágenos em linhagens mutantes simples e duplos de rad2∆, rlf2∆ e pso4-1 mostraram sensibilidade aumentada para para mutantes rad2∆/pso4-1 e rlf2∆/pso4-1, sugerindo uma interferência funcional destas proteínas no processo dereparação do DNA em Saccharomyces cerevisiae. O mecanismo exato de reparação de pontes inter-cadeia (ICL) em S. cerevisiae não é ainda totalmente conhecido. Identificando novos fenótipos e isolando proteínas potencialmente capazes de interagir com Pso2p através da técnica do sistema dois-híbridos, foi possível extender a caracterização deste gene específica para reparação de pontes intercadeia. Tratamentos com acetaldeído (ACA), um metabólito natural da via glicolítica, foi mais tóxico a linhagem mutante pso2 em comparação com a linhagem selvagem e também capaz de induzir a expressão da fusão contendo o promotor de PSO2 à lacZ (PSO2-lacZ) por um fator comparável à tratamentos com outros agentes indutores de ICLs, indicando que o metabólito natural ACA pode causar danos do tipo ICL em S. cerevisiae. A utilização do sistema dois-híbridos permitiu isolar partes de proteínas codificadas por nove diferentes genes, entre eles a proteína quinase Pak1p, um supressor de mutações termosensíveis da DNA Polimerase alfa. Pak1p interage com a extremidade C-terminal conservada de Pso2p, uma região da proteína recentemente nomeada β-CASP entre v ortólogos conhecidos do gene PSO2. A integridade do domínio β-CASP é essencial para a reparaçãode DNA proficiente como demonstrado em ensaios de complementação com mutantes pso2 ∆. Comparação da sobrevivência após tratamento com agentes mutagênicos de simples mutantes pso2 ∆ e pak1 ∆ assim com o dulpo mutante pso2 ∆/pak1 ∆ revelaram que o gene PAK1 é necessário para reparação do DNA proficiente como na linhagem selvagem. A interação epistática dos dois alelos mutantes na linhagem duplo mutante sugere que Pak1p atua na mesma via de reparação a qual PSO2 pertence e que PAK1 constitui um novo locus envolvido na reparação do DNA em S. cerevisiae.

Análise do polímero PHA em Saccharomyces cerevisiae recombinante : superexpressão de phaG, e a contribuição in vivo das enzimas auxiliares envolvidas na beta-oxidação de ácidos graxos insaturados em peroxissomos

Os polímeros do tipo poli-hidroxialcanoatos (PHAs) são poliésteres bacterianos que apresentam as propriedades de termoplásticos e elastômeros biodegradáveis. A síntese deste polímero em plantas de interesse agroindustrial tem sido vista como uma área promissora dentro da biotecnologia de polímeros para a produção em grande escala com baixos custos. Contudo, esta tarefa requer o aprimoramento de diferentes metodologias bioquímicas e moleculares, além de maximizar os processos de extração destes polímeros biológicos. A produção de PHAs em peroxissomos ou no citoplasma de Saccharomyces cerevisiae, por meio da expressão de uma PHA-sintase bacteriana, pode servir como indicador e modulador do fluxo de carbonos que percorre vias biossintéticas como a síntese de novo de ácidos graxos e a β-oxidação. Esta levedura tem sido usada como eucarioto modelo para manipular as rotas envolvidas na síntese de PHAs do tipo MCL (PHA com um número médio de carbonos), um polímero menos cristalino e com menor ponto de fusão quando comparado ao PHA-SCL (PHA com um número pequeno de carbonos). A enzima PhaG (3-hidroxidecanoil-ACP-CoA transacilase) é responsável pela conexão entre a síntese de ácidos graxos e a produção de PHA-MCL em bactérias do gênero Pseudomonas, em meios de cultura contendo uma fonte de carbono nãorelacionada como gliconato, etanol ou acetato. Para tentar estabelecer esta rota metabólica em S. cerevisiae, o presente trabalho avaliou a coexpressão de PhaGPa e PhaC1Pa (PHA-sintase) de P. aeruginosa para a síntese de PHA-MCL a partir de uma fonte de carbono não-relacionada em leveduras. Contudo, a presença de PhaGPa não alterou a composição ou a quantidade de PHA-MCL em relação à cepa controle contendo apenas PhaC1Pa citoplasmática ou direcionada ao peroxissomo, independentemente da fonte de carbono utilizada (rafinose ou ácido oléico). Este resultado permite sugerir que a ligação entre a síntese de ácidos graxos e a produção de PHA-MCL em S. cerevisiae não foi estabelecida, provavelmente devido à ausência de algum passo enzimático que limita o desvio de substratos da síntese de ácidos graxos para a produção de PHA-MCL em organismos que não são capazes de acumular naturalmente este polímero quando cultivados em fontes de carbono não-relacionadas.A levedura S. cerevisiae tem sido usada como um sistema modelo para estudar a β-oxidação de ácidos graxos insaturados em peroxissomos. A produção de PHA-MCL pela expressão de PhaC1Pa em peroxissomos de cepas selvagens e mutantes nulos de S. cerevisiae para as enzimas auxiliares da β-oxidação (Eci1p, Sps19p e Dci1p), multiplicadas em meio de cultivo contendo um ácido graxo insaturado como fonte de carbono, permitiu monitorar o fluxo de carbonos que percorre as vias dependente de isomerase, redutase e di-isomerase. Desta forma, o presente estudo permitiu avaliar a β- oxidação in vivo dos ácidos graxos linoléico conjugado, 9-cis,11-trans-CLA (ácido rumênico) ou 10-cis,13-cis-nonadecadienóico, para determinar a contribuição das vias alternativas na degradação destes substratos pela utilização de cepas selvagens, mutantes nulos e linhagens contendo um plasmídio multicópia para os genes ECI1 (Δ3- Δ2-enoil-CoA isomerase), SPS19 (2,4-dienoil-CoA redutase) e DCI1 (Δ3,5-Δ2,4-dienoil- CoA isomerase). As linhagens selvagens foram capazes de sintetizar PHA-MCL quando cultivadas em ácido rumênico, mas a atividade da enzima Eci1p foi essencial para a degradação deste CLA, indicando que a via dependente de isomerase é a única rota in vivo necessária para a β-oxidação do ácido rumênico em peroxissomos de S. cerevisiae. A contribuição da enzima di-isomerase (Dci1p) para a degradação do ácido 10- cis,13-cis-nonadecadienóico foi avaliada em cepas selvagens, mutantes nulos dci1Δ e linhagens de S. cerevisiae contendo os plasmídeos multicópia. De acordo com o conteúdo e a quantidade de PHA formado, a β-oxidação de ácidos graxos cisinsaturados em um carbono ímpar é, in vivo, independente da di-isomerase. Embora este resultado possa indicar o mesmo padrão de envolvimento de Dci1p na degradação de ácidos graxos cis-insaturados em um carbono ímpar em mitocôndrias de mamíferos, esta via alternativa deve ser mais bem investigada em eucariotos superiores.