Efeito in vivo e in vitro da prolina sobre a atividade da Na+, K+-ATPase de cérebro de ratos

A hiperprolinemia tipo II é um erro inato do metabolismo de aminoácido causado pela deficiência na atividade da Ä1 pirrolino-5-carboxilato desidrogenase. O bloqueio dessa reação resulta no acúmulo tecidual de prolina. A doença caracteriza-se fundamentalmente por epilepsia, convulsões e um grau variável de retardo mental, cuja etiopatogenia ainda é desconhecida. No tecido nervoso, a Na+, K+ - ATPase controla o ambiente iônico relacionado com a atividade neuronal, regulando o volume celular, o fluxo de íons e o transporte de moléculas ligadas ao transporte de Na+, tais como, aminoácidos, neurotransmissores e glicose. Evidências na literatura mostram que recém nascidos humanos com baixos níveis de Na+, K+ -ATPase cerebral apresentam epilepsia e degeneração espongiforme. Alterações na atividade desta enzima têm sido associadas a várias doenças que afetam o sistema nervoso central, como isquemia cerebral e doença de Parkinson. Considerando que a inibição da Na+, K+ - ATPase por ouabaína tem sido associada com liberação de neurotransmissores, incluindo glutamato, em uma variedade de preparações neuronais, e que alguns autores sugerem que o efeito da prolina sobre a sinapse glutamatérgica possa ser, pelo menos em parte, responsável pelos sintomas neurológicos encontrados nos pacientes com hiperprolinemia, no presente trabalho verificamos efeitos dos modelos experimentais agudo e crônico de hiperprolinemia tipo II sobre a atividade da Na+, K+ - ATPase de membrana plasmática sináptica de córtex cerebral e hipocampo de ratos. No modelo crônico, a prolina foi administrada a ratos Wistar duas vezes ao dia do 6o ao 28o dia de vida, enquanto que no modelo agudo os animais, com 15 dias de vida, receberam uma única injeção de prolina e foram sacrificados 1hora após a administração da droga. Os animais tratados crônicamente com prolina não apresentaram alterações significativas no peso corporal, do encéfalo, do hipocampo e do córtex cerebral, bem como nas quantidades de proteínas do homogenizado cerebral e da membrana plasmática sináptica de córtex cerebral e hipocampo. Nossos resultados mostraram uma diminuição significativa na atividade da Na+, K+ - ATPase de membrana plasmática sináptica de cérebro de animais tratados aguda e crônicamente com prolina. Foram também testados os efeitos in vitro da prolina e do glutamato sobre a atividade da Na+, K+- ATPase. Os resultados mostraram que os dois aminoácidos, nas concentrações de 1,0 e 2,0 mM, inibiram significativamente a atividade da enzima. O estudo da interação cinética entre prolina e glutamato, sugere a existência de um sítio único de ligação na Na+, K+ - ATPase para os dois aminoácidos. É possível que a inibição na atividade da Na+, K+- ATPase possa estar envolvida nos mecanismos pelos quais a prolina é neurotóxica. Acreditamos que nossos resultados possam contribuir, pelo menos em parte, na compreensão da disfunção neurológica encontrada em pacientes com hiperprolinemia tipo II.

Metabolismo da glutationa e atividade ATPase de S-conjugados de glutationa no câncer

Pacientes terminais de câncer apresentam um quadro de caquexia que está associado ao estado de imunossupressão que acompanha esta patologia. Nestes pacientes é possível detectar aumento das taxas de prostaglandinas ciclopentenônicas plasmáticas, as quais são reconhecidamente antiproliferativas. Na presença de câncer ocorre a superprodução destas CP-PGs, que são rapidamente captadas pelas células, tanto do sistema imune quanto do próprio tumor. Porém, esta atividade antiproliferativa é mais significativa nas células do tecido imune, enquanto as células de tecido tumoral seguem seu crescimento, aparentemente sem sofrer os distúrbios de proliferação inferidos pelas CP-PGs. É sabido que estas CP-PGs de anel ciclopentano α,β-insaturado são eletrofílicas, o que permite sua conjugação com substâncias nucleofílicas, como a glutationa (GSH). A presença da ATPase MRP/bomba GS-X, responsável pela extrusão de conjugados de glutationa para o espaço extracelular seria uma explicação razoável para o fato das células tumorais serem resistentes à ação antiproliferativa das CP-PGs. Estas ponderações foram confirmadas, anteriormente, através de estudos in vitro, porém ainda não haviam sido determinadas in vivo. Neste estudo foi investigado o papel da MRP/bomba GS-X em animais normais e portadores do tumor de Walker 256. Verificou-se que os animais com tumor, ao longo de, aproximadamente, 21 dias perderam massa corporal, que se fez acompanhar por um quadro de caquexia. Observou-se que a capacidade de exportação de S-conjugados de GSH através da MRP/bomba GS-X (um indicativo da capacidade de eliminação de CP-PG para o espaço extracelular) foi 21 vezes menor em linfócitos que nas células do tumor de Walker 256. Identificou-se que as taxas de GSH estavam diminuídas nas células do tecido imune mas esta depleção não teve caráter oxidativo, uma vez que estiveram mantidos os níveis de GSSG. Isto sugere que linfócitos devam estar sendo desafiados com alguma substância eletrofílica não oxidante que depleta GSH (por exemplo, uma CP-PG). Não houve diferença entre a atividade da glutationa-S-transferase e da γ-glutamilcisteína sintetase (enzimas responsáveis, respectivamente, pela conjugação e síntese de GSH) entre linfócitos de animais normais e portadores do tumor de Walker 256. Como dado corroborante, foi observada, em linfócitos de animais com tumor, indução da expressão de proteínas de choque térmico (HSP70), as quais são induzidas, entre outros agentes, pelas CP-PGs. Os resultados sugerem que a MRP/bomba GS-X, responsável pela extrusão de conjugados de GSH/CP-PG, tem baixa atividade nos linfócitos o que pode ser uma das causas do quadro de imunossupressão nos estágios terminais de câncer.

Efeito da insulina sobre a atividade da enzima Na+-K+ ATPase branquial, a síntese de proteínas e captação de aminoácidos no hepatopâncreas, músculo e brânquias de Chasmagnathus granulata (Dana, 1851)

Resumo não disponível

Efeito in vitro do guanidino acetato sobre as atividades da Na+, K+-ATPase e da acetilcolinesterase em cérebro de ratos jovens

A deficiência de guanidino acetato metiltransferase (GAMT) é um erro inato do metabolismo da creatina caracterizado por hipotonia muscular, movimentos extrapiramidais involuntários e epilepsia. A doença é bioquimicamente caracterizada por acúmulo de guanidino acetato e deficiência de creatina e fosfocreatina nos tecidos dos pacientes afetados. Os mecanismos de disfunção neurológica que ocorrem nessa doença ainda são desconhecidos. A Na+,K+-ATPase desempenha um papel fundamental no sistema nervoso central (SNC), sendo responsável pela manutenção dos gradientes iônicos e pela propagação do impulso nervoso, consumindo cerca de 50% do ATP formado no cérebro. A acetilcolinesterase (AChE) é uma importante enzima regulatória que controla a transmissão de impulsos nervosos através de sinapses colinérgicas pela hidrólise da acetilcolina, e apresenta um papel fundamental na cognição. Com o propósito de ampliar o conhecimento sobre os mecanismos fisiopatológicos da deficiência de GAMT, esse trabalho teve como objetivo investigar o efeito do guanidino acetato, o principal metabólito acumulado na deficiência de GAMT, sobre as atividades das enzimas Na+,K+-ATPase, Mg2+-ATPase e AChE em estriado de ratos. A cinética de inibição da Na+,K+-ATPase causada pelo guanidino acetato também foi estudada. Além disso, investigamos o efeito in vitro do guanidino acetato sobre as atividades da Na+,K+-ATPase, Mg2+-ATPase e da AChE de hipocampo de ratos. Nossos resultados mostraram que o guanidino acetato não altera as atividades da AChE e Mg2+-ATPase. No entanto, a atividade da Na+,K+-ATPase foi inibida por esse composto guanidínico (CG), e a análise cinética mostrou uma inibição do tipo acompetitiva. Também foi demonstrada uma interação entre o guanidino acetato e o ácido arginínico, sugerindo um sítio comum de ligação entre esses dois compostos na Na+,K+-ATPase. Os resultados mostraram que, o guanidino acetato inibiu a atividade da Na+,K+-ATPase in vitro mas não alterou as atividades da Mg2+-ATPase e da AChE. Considerando que o guanidino acetato e outros compostos guanidínicos (CG) induzem a formação de espécies reativas de oxigênio e que a Na+,K+-ATPase e a AChE são inibidas por radicais livres, estudamos o efeito da pré-incubação de homogeneizado de hipocampo de ratos na presença de guanidino acetato sobre a atividade dessas enzimas. Além disso, o efeito da pré-incubação de homogeneizado de ratos com guanidino acetato foi investigado na presença e ausência de antioxidantes, tais como glutationa (GSH), trolox, taurina e L-NAME. A pré-incubação de homogeneizado de hipocampos na presença de guanidino acetato inibiu a atividade da Na+,K+-ATPase, mas não alterou a atividade da Mg2+-ATPase. No entanto, L-NAME e taurina foram capazes de prevenir tal efeito. Dessa forma, propõem-se que a inibição da atividade da Na+,K+-ATPase pelo guanidino acetato seja um dos mecanismos envolvidos na disfunção neuronal observada em pacientes com deficiência de GAMT.

Efeito in vitro das substâncias acumuladas na doença de Lesch-Nyhan sobre a atividade da Na+,K+-ATPase em estriado de ratos

A doença de Lesch-Nyhan é um erro inato do metabolismo das purinas caracterizado pela deficiência na enzima hipoxantina- guanina fosforibosiltransferase. O bloqueio dessa reação resulta no acúmulo tecidual de hipoxantina, xantina e ácido úrico. A doença caracteriza-se por hiperuricemia, variado grau de retardo mental e motor, espasticidade e auto-mutilação. No sistema nervoso central, a Na+, K+ - ATPase é responsável pela manutenção da homeostase dos íons Na+ e K+, regulando o volume celular, a excitabilidade neuronal, o transporte de neurotransmissores e outras moléculas. Evidências na literatura demonstram que a redução na atividade da Na+, K+ - ATPase está relacionada com diversas doenças neurodegenerativas, tais como isquemia cerebral e doenças de Parkinson e de Alzheimer. No presente estudo, investigamos o efeito in vitro da hipoxantina, xantina e ácido úrico sobre a atividade da Na+, K+- ATPase em membrana plasmática sináptica de estriado de ratos. Estudamos, também, a cinética de inibição causada pela hipoxantina e de interação entre hipoxantina, xantina e ácido úrico. Nossos resultados demonstram que hipoxantina, xantina e ácido úrico inibem significativamente a atividade da Na+, K+- ATPase. O estudo dos mecanismos de inibição da atividade enzimática causados pela hipoxantina demonstrou um efeito inibitório não competitivo com o substrato ATP. Além disso, o estudo de interação cinética entre hipoxantina, xantina e ácido úrico sugere que esses compostos atuem em um mesmo sítio de ligação na enzima. Verificamos, também, o efeito da preincubação de homogeneizado de estriado de ratos na presença de hipoxantina (10 µM) sobre a atividade da Na+, K+- ATPase de membrana plasmática sináptica com a adição ou não de antioxidantes (glutationa e trolox), bem como alguns parâmetros de estresse oxidativo denominados TBARS (medida de lipoperoxidação) e TRAP (capacidade antioxidante tecidual não-enzimática) no intuito de verificar a participação do estresse oxidativo nos mecanismos de inibição enzimática provocados pela hipoxantina. Os resultados monstraram que a hipoxantina inibe significativamente a atividade da Na+, K+- ATPase. Adicionalmente, nossos resultados demonstraram que glutationa, mas não o trolox, na concentração de 1 mM, foi capaz de prevenir a inibição enzimática causada pela hipoxantina. Nossos resultados também mostraram que a hipoxantina, na mesma concentração, aumentou TBARS e diminuiu TRAP que essa substância induz o estresse oxidativo. É possível que a inibição na atividade da Na+, K+- ATPase possa estar envolvida nos mecanismos pelos quais as oxipurinas são neurotóxicas. Acreditamos que nossos resultados possam contribuir, pelo menos em parte, na compreensão da disfunção neurológica encontrada em pacientes portadores da doença de Lesch-Nyhan.

Efeito do ácido fólico sobre as alterações nas atividades da Na+,K+-ATPase e da butirilcolinesterase e sobre alguns parâmetros de estresse oxidativo causadas pela homocisteína em ratos

A homocistinúria é um erro inato do metabolismo caracterizado, bioquimicamente, pela deficiência da enzima cistationina-β-sintase, resultando no acúmulo tecidual de homocisteína. Os pacientes afetados apresentam sintomas neurológicos e vasculares característicos, como retardo mental e arteriosclerose, cuja fisiopatologia é desconhecida. No presente trabalho, avaliamos os efeitos in vitro e in vivo da homocisteína sobre alguns parâmetros bioquímicos. Primeiramente, observamos o efeito in vitro da exposição de homogeneizados de córtex parietal de ratos ao ácido fólico, avaliando a inibição causada pela homocisteína sobre a atividade da Na+,K+-ATPase de membranas plasmáticas. Nos estudos in vivo, investigamos o efeito do pré-tratamento com ácido fólico sobre a inibição das enzimas Na+,K+-ATPase e butirilcolinesterase em córtex parietal e em soro de ratos submetidos à hiperhomocisteinemia aguda, respectivamente. Considerando que a Na+,K+-ATPase é suscetível ao ataque de radicais livres, nós determinamos o efeito da hiperhomocisteinemia aguda sobre alguns parâmetros de estresse oxidativo, como a formação de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico e o conteúdo total de grupos tióis em córtex parietal de ratos. Finalmente, investigamos o efeito do ácido fólico sobre a redução da atividade da Na+,K+-ATPase em córtex parietal e sobre o aumento do índice de dano ao DNA em sangue total de ratos submetidos à hiperhomocisteinemia crônica. Nossos resultados mostraram que a homocisteína in vitro reduz, significativamente, a atividade da Na+,K+-ATPase e que o ácido fólico previne esse efeito. Estudos cinéticos com o substrato ATP revelaram que a homocisteína inibe de forma não-competitiva a enzima Na+,K+-ATPase. Os estudos in vivo confirmaram que a hiperhomocisteinemia aguda diminui as atividades das enzimas Na+,K+-ATPase e butirilcolinesterase e que o pré-tratamento com ácido fólico também previne os efeitos causados pela homocisteína. Por outro lado, a hiperhomocisteinemia aguda não alterou os parâmetros de estresse oxidativo analisados. A hiperhomocisteinemia crônica inibiu a Na+,K+-ATPase em córtex parietal e aumentou o índice de dano ao DNA em sangue total de ratos e, novamente, o tratamento com ácido fólico previne tais efeitos. Esses resultados, em conjunto, revelam os efeitos da homocisteína sobre alguns parâmetros bioquímicos e colaboram com o entendimento da fisiopatologia da homocistinúria. Além disso, os resultados sugerem que o ácido fólico, já utilizado por alguns pacientes homocistinúricos, poderá ser uma importante ferramenta terapêutica utilizada na prevenção dos efeitos neurológicos e vasculares da homocisteína.

Efeito da homocisteína sobre as atividades da butirilcolinesterase e da Na+, K+-ATPase em sangue de ratos

A homocistinúria é uma desordem metabólica causada pela deficiência da enzima cistationina β-sintase, resultando no acúmulo tecidual de homocisteína e de metionina. Os pacientes afetados por essa doença apresentam principalmente retardo mental, isquemia cerebral, convulsões e aterosclerose. Entretanto, os mecanismos fisiopatológicos responsáveis por essas manifestações são pouco conhecidos. O sistema colinérgico apresenta papel importante na função cognitiva do qual as colinesterases, acetilcolinesterase e butirilcolinesterase, são constituintes ubíquos. Similarmente à acetilcolinesterase, a butirilcolinesterase hidrolisa a acetilcolina e está presente no soro, coração, endotélio vascular e no sistema nervoso. Estudos têm mostrado que as colinesterases estão inibidas no córtex cerebral de pacientes com a doença de Alzheimer. Adicionalmente, há evidências na literatura mostrando que as colinesterases são inibidas por radicais livres. A Na+,K+-ATPase é uma enzima fundamental responsável pela manutenção do gradiente iônico necessário para a excitabilidade neuronal e consome de 40 a 60% do ATP formado no cérebro. Recentes estudos têm demonstrado que essa enzima é inibida por radicais livres e também que sua atividade está diminuída na isquemia cerebral, epilepsia e em doenças neurodegenerativas como a doença de Alzheimer. Além disso, nosso grupo demonstrou que a homocisteína inibe a atividade da Na+,K+-ATPase cerebral. Considerando que: a) pouco se sabe sobre os mecanismos responsáveis pelas manifestações neurológicas que ocorrem na homocistinúria, b) a administração de homocisteína prejudica a memória, c) as colinesterases são importantes para as funções cognitivas, d) a atividade da Na+,K+-ATPase está diminuída na isquemia cerebral, e) a homocisteína inibe a atividade dessa enzima in vitro e f) as atividades da butirilcolinesterase e da Na+,K+-ATPase em tecidos periféricos podem ser consideradas marcadores de alterações que ocorram no sistema nervoso central, no presente estudo determinamos o efeito in vitro da homocisteína sobre as atividades da butirilcolinesterase e da Na+,K+-ATPase em soro e plaquetas de ratos, respectivamente. Também determinamos o efeito da administração aguda e crônica de homocisteína sobre a atividade da butirilcolinesterase sérica e a influência das vitaminas E e C sobre os efeitos inibitórios causados pela homocisteína. Os resultados mostraram que a homocisteína diminuiu significativamente a atividade da butirilcolinesterase em soro de ratos de 60 dias in vitro. A homocisteína inibiu essa enzima de forma competitiva com a acetilcolina como substrato. Também foi verificado que a homocisteína reduziu significativamente as atividades da butirilcolinesterase e da Na+,K+-ATPase em soro e plaquetas de ratos de 29 dias, respectivamente. Nossos resultados também mostraram que a administração aguda de homocisteína diminuiu significativamente a atividade da butirilcolinesterase em soro de ratos de 29 dias. Adicionalmente, verificou-se que o pré-tratamento com as vitaminas E e C não alterou per se a atividade da butirilcolinesterase, mas preveniu a redução da atividade dessa enzima causada pela administração aguda de homocisteína. Por fim, determinou-se que a administração crônica desse aminoácido diminuiu significativamente a atividade da butirilcolinesterase. Os resultados obtidos em nosso trabalho sugerem que a redução das atividades da butirilcolinesterase e da Na+,K+-ATPase pode estar associada à disfunção neurológica presente em pacientes homocistinúricos, uma vez que a determinação dessas enzimas em sistemas periféricos represente um marcador para a ação neurotóxica da homocisteína.

Efeito da administração aguda de arginina sobre aspectos bioquímicos e comportamentais em ratos adultos

Os erros inatos do metabolismo (EIM) constituem um grupo de doenças genéticas causadas pela deficiência ou ausência de uma proteína, geralmente uma enzima. A hiperargininemia é um erro inato do ciclo da uréia causado pela deficiência de arginase, enzima que converte a arginina em ornitina e uréia. O bloqueio desta reação resulta no acúmulo tecidual e plasmático de arginina e seus metabólitos, os compostos guanidínicos. As manifestações clínicas desta doença diferem substancialmente das demais doenças metabólicas do ciclo da uréia. Seus principais sintomas, que manifestam-se progressivamente, são caracterizados por espasticidade, epilepsia e retardo mental. A correlação entre o metabolismo da arginina e do óxido nítrico ocorre no chamado ciclo arginina-citrulina. A arginina é o substrato para a síntese de óxido nítrico pela ação da enzima óxido nítrico sintetase (ONS). Como os pacientes hiperargininêmicos apresentam altos níveis de arginina no plasma e tecidos, é provável que, devido ao excesso deste substrato, ocorra um aumento na síntese de óxido nítrico. O óxido nítrico em concentrações elevadas está associado à produção de radicais livres, neurotoxicidade e inibição da enzima Na+,K+-ATPase. A Na+,K+-ATPase é uma enzima fundamental ao funcionamento normal do sistema nervoso central (SNC), pois regula a transmissão do impulso nervoso, o volume celular e o transporte de moléculas ligadas ao cotransporte de Na+, tais como aminoácidos, glicose e neurotransmissores. A inibição da atividade da Na+,K+-ATPase nos sítios pré-sinápticos resulta na inibição da recaptação de glutamato, bem como na estimulação de sua liberação. A inibição desta enzima também tem sido associada a diversas neuropatologias. A Na+,K+-ATPase também está envolvida na LTP (long term potentiation – potenciação de longa duração), que é um tipo de neuroplasticidade celular que provoca alterações nas cascatas bioquímicas no SNC, que são, muitas vezes, idênticas àquelas que ocorrem durante o processo de formação da memória. Assim, acredita-se que a LTP seja um dos diversos mecanismos bioquímicos importantes para a formação da memória. Neste estudo investigamos o efeito in vivo da administração aguda de arginina, L-NAME (um potente inibidor da ONS) e a co-administração de Arg + L-NAME sobre a atividade da Na+,K+-ATPase de membrana plasmática sináptica de hipocampo de ratos adultos e sobre testes 6 comportamentais utilizados para avaliar o aprendizado e memória: campo aberto e esquiva inibitória. Os resultados obtidos demonstraram que a arginina inibiu significativamente a atividade da enzima Na+,K+-ATPase de membrana plasmática sináptica de hipocampo de ratos. A administração de L-NAME não alterou a atividade da enzima, mas preveniu a diminuição da atividade da Na+,K+-ATPase causada pela arginina. Nos experimentos de comportamento foram avaliados o aprendizado, a consolidação e a evocação da memória de longa duração pela administração das soluções em três momentos diferentes. A arginina diminuiu o desempenho do teste de esquiva inibitória nos três momentos, o L-NAME isoladamente não alterou o comportamento dos animais, mas quando co-administrado com a arginina aumentou a capacidade de memorização desta tarefa. Estes resultados indicam que a administração de arginina in vivo reduz tanto a atividade da Na+,K+-ATPase como a modulação da memória em ratos, e que isso ocorreu, provavelmente, pelo aumento da síntese de óxido nítrico. Assumindo a possibilidade de que isso possa ocorrer em pacientes com hiperargininemia, os resultados obtidos podem ser relevantes para explicar, pelo menos em parte, a disfunção neurológica associada a essa doença.

Utilização de nutrientes energéticos por córtex cerebral de ratos : efeitos de diferentes concentrações de potássio

Glicose é o principal substrato energético no SNC de mamíferos adultos, contudo o cérebro também é capaz de utilizar outros substratos, incluindo manose, frutose, galactose, glicerol, corpos cetônicos e lactato. Glicose é quase totalmente oxidada a CO2 e H2O, mas ela também é precursora de neurotransmissores, tais como glutamato, GABA e glicina. O metabolismo energético do SNC varia ontogeneticamente, visto o fato de que nas primeiras 2 horas após o nascimento, lactato é o seu principal substrato, glicose e corpos cetônicos servem como substratos nos 21 dias subseqüentes e, após este período, somente glicose predomina. A utilização de nutrientes é regulada de várias maneiras, tais como o transporte através das células endoteliais capilares, transporte através da membrana plasmática, variações na atividade enzimática e variações nas concentrações de nutrientes plasmáticos. Está bem estabelecido que a atividade funcional do SNC aumenta o metabolismo energético. Tal evento pode ser dependente da atividade da bomba Na+,K+-ATPase, a qual é requerida para restabelecer a homeostase iônica. O aumento da concentração de potássio extracelular de um nível basal 8-12 mM provoca excitação neuronal fisiológica. A concentração de potássio pode atingir 50-80 mM durante convulsões, isquemia ou hipoglicemia. O potássio liberado pela atividade elétrica é captado nos astrócitos através de processos dependentes e não dependentes de ATP. Neste estudo, observamos o efeito de diferentes concentrações de potássio extracelular (2.7, 20 e 50 mM), sobre a oxidação de glicose, frutose, manose e lactato a CO2 e a conversão a lipídios em córtex cerebral de ratos jovens (10dias) e adultos (60 dias). Considerando que a captação de deoxiglicose está relacionada com a atividade glicolítica, testamos a influência do potássio extracelular sobre este parâmetro. Os efeitos da ouabaína sobre a oxidação de glicose e captação de deoxiglicose foram testados para determinar se a influência de potássio extracelular era dependente da atividade da bomba Na+,K+-ATPase. Os efeitos da monensina (ionóforo de Na+) e bumetanide (inibidor do transportador de Na+/K+/2Cl-) foram também testados. O aumento da concentração de potássio extracelular aumentou a oxidação de glicose, frutose, e manose a CO2 em córtex cerebral de ratos adultos, contudo, este fenômeno não foi observado em ratos jovens. A oxidação de lactato aumentou com o aumento da concentração de potássio extracelular em ambos ratos jovens e adultos. Não houve diferença na oxidação de glicose e sobre a captação de deoxiglicose na presença de ouabaína. Monensina aumentou a captação de deoxiglicose em 2 minutos de incubação. Contudo, esta captação diminuiu em períodos de incubação de 1 hora e 10 minutos. Além disso, não houve efeito do bumetanide sobre o aumento causado pela alta concentração de potássio extracelular na oxidação de glicose.

Efeito da administração de arginina sobre o metabolismo energético em cérebro de ratos adultos

A hiperargininemia é um erro inato do ciclo da uréia causado pela deficiência na atividade da arginase hepática. Esta doença é caracterizada bioquimicamente pelo acúmulo tecidual de arginina (Arg). Retardo mental e outras alterações neurológicas, cujos mecanismos são ainda desconhecidos, são sintomas comuns em pacientes hiperargininêmicos. O óxido nítrico (NO) é gerado em todas as células do sistema nervoso central (SNC) pela enzima óxido nítrico sintase (NOS), a qual, na presença de oxigênio molecular, tetraidrobiopterina e outros cofatores, catalisa a conversão de Arg em NO e citrulina. Em condições normais, o NO desempenha importante papel fisiológico no SNC, como por exemplo, na liberação de neurotransmissores e expressão gênica. Quando há formação excessiva, o NO torna-se um importante mediador de neurotoxicidade Trabalhos realizados em nosso laboratório mostraram que a administração aguda de Arg em ratos diminui a atividade da Na+,K+-ATPase e aumenta o estresse oxidativo cerebral. Outros estudos mostraram que a administração de Arg prejudica a memória em ratos. Estes resultados foram prevenidos pelo Nϖ-nitro-L-arginine methyl ester (L-NAME), um inibidor competitivo da NOS, sugerindo que a administração de Arg altera estes parâmetros através do NO e/ou estresse oxidativo. Considerando que a administração de Arg aumenta o estresse oxidativo e que estudos mostram que o NO inibe a cadeia de transporte de elétrons provavelmente comprometendo a produção de energia, no presente trabalho, nós investigamos o efeito da administração aguda de Arg sobre alguns parâmetros do metabolismo energético (produção de CO2, captação de glicose, produção de lactato e atividades da succinato desidrogenase, complexo II e IV da cadeia respiratória) em hipocampo de ratos. Também testamos o efeito do L-NAME sobre os efeitos produzidos pela Arg Ratos adultos de 60 dias foram tratados com uma única injeção intraperitoneal de Arg, de acordo com o protocolo estabelecido por Buchmann e colaboradores (1996). A dose de Arg (0,8 g/Kg) usada atinge níveis plasmáticos semelhantes àqueles encontrados em pacientes hiperargininêmicos (1,5 mM). Os resultados do presente trabalho mostraram que a administração de Arg aumentou significativamente a produção de lactato e diminuiu a produção de CO2 e a captação de glicose, bem como as atividades da succinato desidrogenase e do complexo II, e que a injeção simultânea de L-NAME preveniu estes efeitos, exceto a produção de CO2 e a produção de lactato. No entanto, não houve alteração na atividade da citocromo c oxidase (complexo IV). Se estes achados também ocorrerem em humanos, pode-se presumir que a Arg prejudica o metabolismo energético, possivelmente através da geração de radicais livres induzida pela formação de NO e/ou da formação de poliaminas, contribuindo assim para a disfunção cerebral observada na hiperargininemia.

Alterações bioquímicas e comportamentais em ratos submetidos ao modelo químico experimental de hiperhomocisteinemia

A homocistinúria é uma doença metabólica hereditária causada pela deficiência severa na atividade da enzima cistationina β-sintase e é bioquimicamente caracterizada pelo acúmulo tecidual de homocisteína e metionina. Retardo mental, deficiência cognitiva, isquemia, convulsões e aterosclerose são achados clínicos comuns em pacientes homocistinúricos. No entanto, os mecanismos fisiopatológicos da doença são pouco conhecidos. Modelos animais experimentais de erros inatos do metabolismo são úteis para compreender a fisiopatologia dessas doenças em humanos. No nosso laboratório, já foram criados alguns modelos animais de algumas doenças metabólicas hereditárias, como, por exemplo, fenilcetonúria e hiperprolinemia tipo II. A Na+,K+-ATPase é uma enzima fundamental responsável pela manutenção do gradiente iônico necessário para a excitabilidade neuronal e consome de 40 a 60% do ATP formado no cérebro. Essa enzima é inibida por radicais livres e sua atividade está diminuída na isquemia cerebral, epilepsia e em doenças neurodegenerativas como a doença de Alzheimer. A diminuição de energia cerebral e o estresse oxidativo têm sido associados com algumas doenças que afetam o sistema nervoso central, como as doenças de Alzheimer, Parkinson e Huntington e isquemia cerebral. Por outro lado, a homocisteína tem sido considerada um fator de risco para o aparecimento dessas doenças. No sentido de ampliar o conhecimento das alterações bioquímicas envolvidas na gênese da disfunção neurológica característica da homocistinúria, esse trabalho teve como principal objetivo desenvolver um modelo químico experimental de hiperhomocisteinemia em ratos. Utilizando esse modelo, verificamos a atividade da Na+,K+-ATPase e alguns parâmetros de metabolismo energético (produção de CO2, captação de glicose, produção de lactato e atividades das enzimas succinato desidrogenase e citocromo c oxidase) em hipocampo de ratos. A aprendizagem e a memória na tarefa do labirinto aquático de Morris foram avaliadas em ratos submetidos ao modelo químico experimental de hiperhomocisteinemia. Nesse trabalho, também estudamos o efeito in vitro dos metabólitos acumulados na homocistinúria, homocisteína e metionina, sobre a atividade da Na+,K+-ATPase e sobre alguns parâmetros de metabolismo energético (produção de CO2, captação de glicose, produção de lactato e atividade da enzima citocromo c oxidase). Além disso, o efeito in vitro da homocisteína sobre alguns parâmetros de estresse oxidativo (potencial antioxidante total (TRAP), substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS) e atividades das enzimas antioxidantes catalase, superóxido dismutase e glutationa peroxidase) em hipocampo de ratos foi investigado. O tratamento crônico foi realizado do 6o ao 28o dia de vida, através de administrações subcutâneas de homocisteína, duas vezes ao dia, com intervalos de 8 horas. As doses de homocisteína administradas foram escolhidas com o objetivo de induzir concentrações plasmáticas de 0,4 a 0,5 mM, semelhantes àquelas encontradas em pacientes homocistinúricos. Através desse tratamento, também foram induzidas concentrações elevadas de homocisteína no cérebro de ratos. Os controles receberam solução salina em volumes semelhantes. Os resultados mostram que a administração crônica de homocisteína inibiu a atividade da Na+,K+-ATPase de membrana plasmática sináptica, a produção de CO2 e a captação de glicose, assim como as atividades das enzimas succinato desidrogenase e citocromo c oxidase em hipocampo de ratos. Os animas tratados com homocisteína também apresentaram diminuição de memória na tarefa do labirinto aquático de Morris. Além disso, a homocisteína e a metionina inibiram a atividade da Na+,K+-ATPase de hipocampo de ratos in vitro. Estudos cinéticos sobre a inibição da Na+,K+-ATPase, causada pela homocisteína, também foram realizados. Os resultados mostraram que a homocisteína inibe a enzima de forma não-competitiva com o ATP como substrato. Também foi verificado que a incubação de homogeneizados de hipocampo com homocisteína diminuiu a atividade da Na+,K+-ATPase e que a incubação simultânea com alguns antioxidantes, tais como glutationa, ditiotreitol, cisteína e a enzima antioxidante superóxido dismutase preveniram esse efeito. Os metabólitos acumulados na homocistinúria também alteraram alguns parâmetros de metabolismo energético cerebral (produção de CO2 e lactato, captação de glicose e atividades das enzimas succinato desidrogenase e citocromo c oxidase) in vitro. Além disso, verificou-se que a homocisteína in vitro diminuiu o TRAP e aumentou a quantidade de TBARS, um marcador de lipoperoxidação, mas não alterou as atividades das enzimas antioxidantes catalase, superóxido dismutase e glutationa peroxidase. Os achados sugerem que a inibição da atividade da Na+,K+-ATPase, a diminuição do metabolismo energético e o aumento do estresse oxidativo podem estar relacionados com as disfunções neurológicas características dos pacientes homocistinúricos.

Efeito in vitro de quinureninas sobre parâmetros bioquímicos do metabolismo enrgético em cérebro de ratos jovens

A via das quinureninas é a principal rota de degradação do aminoácido triptofano. Os metabólitos dessa via, comumente chamados de quinureninas, estão envolvidos em vários processos fisiológicos e patológicos e, recentemente, algumas quinureninas foram relacionadas à fisiopatologia de várias doenças neurodegenerativas. Tendo em vista o pouco conhecimento a respeito do efeito das quinureninas sobre o metabolismo energético cerebral, e considerando que as concentrações de algumas quinureninas estão alteradas em várias doenças neurodegenerativas e que disfunção mitocondrial é uma importante característica dessas doenças, este trabalho teve por objetivo investigar os efeitos in vitro de alguns metabólitos da via das quinureninas, particularmente L-quinurenina, ácido quinurênico, 3-hidroxiquinurenina, ácido 3-hidroxi-antranílico, ácido antranílico e ácido quinolínico sobre alguns parâmetros do metabolismo energético em córtex cerebral de ratos jovens. Verificamos que todas as quinureninas testadas, à exceção da L-quinurenina, aumentaram a captação de glicose e inibiram a produção de CO2 a partir de glicose, acetato e citrato em córtex cerebral de ratos de 30 dias de vida. Além disso, o ácido quinurênico inibiu a atividade da enzima sucinato desidrogenase, a 3-hidroxiquinurenina inibiu a atividade dos complexos I, II e IV da cadeia respiratória, enquanto que o ácido 3-hidroxi-antranílico inibiu as atividades dos complexos I e II da cadeia respiratória e da enzima sucinato desidrogenase. Já o ácido antranílico inibiu as atividades do complexo I-III da cadeia respiratória e da enzima sucinato desidrogenase. Por outro lado, o ácido quinolínico inibiu apenas a atividade do complexo II, sem alterar as atividades dos outros complexos da cadeia transportadora de elétrons. Finalmente, observamos que nenhuma das substâncias testadas interferiu na atividade da enzima Na+,K+-ATPase. Esses resultados sugerem um bloqueio no ciclo do ácido cítrico, o qual poderia ser provocado pela inibição da cadeia respiratória ocasionada pelos metabólitos testados. Portanto nossos resultados sugerem que o metabolismo energético cerebral é inibido in vitro por algumas quinureninas. Caso esses achados se confirmem in vivo, é possível que um prejuízo no metabolismo energético possa colaborar, ao menos em parte, para o comprometimento cerebral dos pacientes afetados por doenças em que há alteração nas concentrações desses compostos.

Estudo dos efeitos do ATP extracelular e das ecto-nucleotidases no crescimento de gliomas

Glioblastomas são a forma mais comum de tumores cerebrais primários e, apesar do tratamento, os pacientes com estes tumores têm um prognóstico muito ruim. Os nucleotídeos da adenina (ATP, ADP e AMP) e também a adenosina possuem muitas funções importantes em condições fisiológicas e patológicas em vários organismos. O ATP é uma importante molécula sinalizadora no SNC, e os nucleotídeos e nucleosídeos podem induzir a proliferação de linhagens celulares de gliomas. Na invasão dos gliomas dois mecanismos podem liberar ATP: a morte excitotóxica do tecido adjacente e a lesão causada pela ressecção do tumor, que é o tratamento de primeira linha nestes casos. Neste estudo foram observados os efeitos do ATP extracelular na citotoxicidade em linhagens celulares de glioma humano U138 e na linhagem C6 de ratos, comparado com culturas organotícias de hipocampo. A citotoxicidade do ATP (0.1mM, 0.5mM, 5mM) foi medida usando os ensaios de incorporação de iodeto de propídeo e ensaio da lactato desidrogenase. O ensaio de caspases foi realizado para identificar à morte apoptótica. Os resultados mostraram que as células de gliomas apresentam resistência a morte induzida pelo ATP quando comparados com o tecido normal. Altas concentrações de ATP (5mM) induziram à morte celular após 24 h de tratamento em culturas organotípicas, mas não nas linhagens de gliomas estudados. Os nucleotídeos são hidrolisados muito lentamente pelas linhagens de gliomas, o que foi confirmado pela baixa expressão das enzimas NTPDases quando comparado com astrócitos. Portanto, para testar o papel do ATP extracelular no mecanismo de implante e crescimento dos gliomas, um milhão destas células de gliomas foram injetadas em 3µl de DMEM no estriado direito de ratos Wistar, e foi testada a co-injeção da enzima apirase no tratamento dos gliomas implantados. Após 20 dias, os ratos foram mortos e o cérebro foi seccionado e corado com hematoxilina e eosina. Nossos resultados mostraram que os ratos que sofreram co-injeção de apirase tiveram uma redução significativa no tamanho do tumor e menor índice mitótico (p<0,05), bem como menor imunodetecção para Ki67, VEGF e CD31 quando comparado com os grupos controle e controle apirase. A medida da hidrólise enzimática dos nucleotídeos no soro pode contribuir no diagnóstico de lesão celular em muitas condições patológicas. Com o objetivo de avaliar a atividade enzimática da ATPase, ADPase e AMPase in vivo, amostras de soro foram coletadas vinte dias após o implante dos gliomas em ratos. Os ratos com indução de gliomas mostraram um aumento significativo na hidrólise de ATP, ADP e AMP quando comparado com os respectivos controles. O tratamento com o fármaco temozolomida e com 10% dimetil sulfoxida diminuiu a hidrólise dos nucleotídeos. Nenhum dos animais incluídos neste trabalho apresentaram alterações significativas na atividade das enzimas alanina aminotransferase, aspartato aminotransferase e fosfatase alcalina. Nossos dados indicam que o ATP pode ter uma função importante no crescimento do glioma, pois quando liberado pode induzir a morte celular do tecido normal ao redor do tumor, abrindo espaço para o rápido crescimento e invasão do tumor. As avaliações da hidrólise dos nucleotídeos da adenina no soro podem ajudar no acompanhamento da progressão dos tumores cerebrais.

Efeito in vitro dos ácidos 2-metilacetoacético e 2-metil-3-hidroxibutírico sobre alguns parâmetros do metabolismo energético em córtex cerebral de ratos jovens

As deficiências da β-cetotiolase mitocondrial e da 2-metil-3-hidroxibutiril-CoA desidrogenase (MHBD) são erros inatos do catabolismo da isoleucina. Os pacientes afetados pela deficiência da β-cetotiolase apresentam crises agudas de cetose e acidose metabólica, podendo apresentar convulsões que podem evoluir ao coma e morte. Bioquimicamente, são caracterizados por excreção urinária aumentada de ácido 2-metilacetoacético (MAA), 2-metil-3-hidroxibutírico (MHB) e tiglilglicina (TG). Alguns indivíduos apresentam acidemia láctica durante as crises de descompensação metabólica. Por outro lado, os indivíduos afetados pela deficiência da MHBD são caracterizados por retardo mental, convulsões e acidose láctica severa, apresentando excreção urinária aumentada de MHB e TG. O aumento do ácido láctico em ambas as enfermidades sugere um comprometimento do metabolismo energético. Tendo em vista que os mecanismos fisiopatogênicos de ambas desordens são totalmente desconhecidos e que os achados bioquímicos sugerem um déficit na produção de energia dos pacientes, o presente trabalho teve por objetivo investigar os efeitos in vitro do MAA e do MHB sobre alguns parâmetros do metabolismo energético em córtex cerebral de ratos jovens. Nossos resultados demonstraram que o MAA inibiu a produção de CO2 a partir de glicose, acetato e citrato, indicando um bloqueio do ciclo do ácido cítrico. Em adição, o complexo II da cadeia respiratória bem como a enzima succinato desidrogenase foram inibidos na presença do MAA. Portanto, é possível que a inibição da cadeia respiratória tenha levado à inibição secundária do ciclo de Krebs. As enzimas Na+,K+-ATPase e creatina quinase (CK) não foram afetadas pelo MAA. O MHB inibiu a produção de CO2 a partir dos três substratos testados bem como o complexo IV da cadeia respiratória, sugerindo que a inibição da cadeia respiratória tenha levado à inibição da produção CO2 pelo ciclo de Krebs. A enzima Na+,K+- ATPase não foi afetada pelo ácido. No entanto, o MHB inibiu a atividade total da CK às custas da CK mitocondrial (mi-CK). A presença do inibidor da enzima óxido nítrico sintase L-NAME e do antioxidante glutationa reduzida (GSH) preveniram a inibição da atividade total da CK, enquanto que a GSH preveniu a inibição da mi-CK, sugerindo que os efeitos do MHB sobre a CK estejam relacionados à oxidação de grupamentos tióis essenciais à atividade enzimática. Tais resultados sugerem que o metabolismo energético cerebral é inibido in vitro pelo MAA e pelo MHB. Caso estes achados se confirmem nas deficiências da β-cetotiolase e da MHBD, é possível que um prejuízo no metabolismo energético causado pelo acúmulo destes metabólitos possa explicar, ao menos em parte, o dano neurológico encontrado nos pacientes portadores destas doenças.

Papel do estresse oxidativo na neurotoxicidade do ácido L-piroglutâmico : relevância dos distúrbios hereditários do ciclo gama-glutamil

O ácido L-piroglutâmico (PGA) é o principal intermediário do ciclo γ-glutamil, que está relacionado à síntese e degradação da glutationa. Altos níveis de PGA no líquido cefalorraquidiano, sangue e outros tecidos, juntamente com a alta excreção urinária do mesmo (acidúria piroglutâmica ou 5-oxoprolinúria), ocorrem em alguns erros inatos do metabolismo envolvendo diferentes enzimas do ciclo γ-glutamil. Essas desordens são clinicamente caracterizadas por anemia hemolítica, acidose metabólica e disfunção neurológica severa. No entanto, os mecanismos de dano cerebral permanecem ainda não esclarecidos. Várias ações neurotóxicas foram previamente atribuídas ao PGA, como excitotoxicidade, inibição da atividade da Na+,K+-ATPase e alteração do metabolismo energético cerebral. No presente estudo, investigamos o possível papel do estresse oxidativo na neurotoxicidade do PGA. O efeito in vitro do PGA nas concentrações de 0,5 – 3,0 mM foi estudado sobre o potencial antioxidante total (TRAP), a reatividade antioxidante total (TAR), quimiluminescência, susbtâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBA-RS), e atividade das enzimas antioxidantes catalase (CAT), superóxido dismutase (SOD) e glutationa peroxidase (GPx) em córtex cerebral e cerebelo de ratos de 14 dias de vida. Tanto o TRAP quanto o TAR foram significativamente reduzidos nas estruturas estudadas. Ao contrário, a quimiluminescência e o TBA-RS não foram afetados pelo PGA. As atividades da CAT, SOD e GPx também não foram alteradas. Esses resultados mostram que o PGA pode diminuir as defesas antioxidantes nãoenzimáticas em córtex cerebral e cerebelo de ratos. Outros estudos, no entanto, parecem válidos a fim de melhor caracterizar o papel dos radicais livres na neurotoxicidade do PGA.