Transformação genética de embriões somáticos de soja [Glycine max (L.) Merr.] utilizando o bombardeamento e sistema Agrobacterium de maneira integrada

O objetivo do presente trabalho foi otimizar o sistema de transformação genética de embriões somáticos de soja [Glycine max (L.) Merr.] utilizando a biolística e o sistema Agrobacterium de maneira integrada. Os antibióticos, adicionados ao meio de cultura para supressão da bactéria após a transferência do transgene, foram o alvo do estudo. Inicialmente, comparou-se o efeito de diferentes tratamentos com antibióticos sobre o tecido embriogênico de soja e sua eficiência na supressão da linhagem LBA4404 de Agrobacterium tumefaciens durante o processo de transformação. A carbenicilina (500 mg/l) apresentou efeitos diferentes sobre o tecido vegetal das duas cultivares testadas. Os tecidos embriogênicos da cv. IAS5 não apresentaram diferenças significativas em relação ao controle, enquanto que a proliferação dos embriões somáticos da cv. Bragg foi três vezes maior com a adição deste antibiótico ao meio de cultura. Contudo, a presença da carbenicilina nas duas concentrações testadas (500 e 1000 mg/l) não foi eficiente para supressão de Agrobacterium. Por outro lado, nos tratamentos com cefotaxima sozinha (350 e 500 mg/l), ou cefotaxima (250 mg/l) + vancomicina (250 mg/l) esta bactéria foi completamente suprimida da superfície dos embriões somáticos após 49 dias de tratamento. No entanto, enquanto a presença de cefotaxima, em qualquer concentração, foi prejudicial à sobrevivência do tecido embriogênico, a combinação de cefotaxima + vancomicina não afetou significativamente os embriões somáticos de soja até os 63 dias de tratamento. Portanto, os resultados indicam que o tratamento com cefotaxima + vancomicina por um período de 49 - 63 dias é o mais adequado para a transformação genética de soja, por suprimir Agrobacterium e apresentar mínimos efeitos sobre o tecido embriogênico. Por fim, conjuntos de embriões somáticos de soja foram transformados e tratados com a combinação recomendada de antibióticos para avaliação da eficiência do método na obtenção de transformantes estáveis. Foram obtidos 48 e 232 clones higromicina-resistentes para Bragg e IAS5, respectivamente. Para cv. Bragg, 26 plantas foram obtidas de um único clone, enquanto 580 plantas foram regeneradas de 105 clones da cv. IAS5. As plantas transgênicas eram férteis e morfologicamente normais. A presença do transgene no genoma destas plantas foi confirmada por análises moleculares. Portanto, a adequação dos antibióticos permitiu o desenvolvimento de um método de transformação altamente eficiente para soja. Os resultados do presente trabalho constituem o primeiro registro (1) do efeito de antibióticos sobre tecidos de soja ou de leguminosas e (2) de obtenção de transformantes estáveis de soja utilizando a biolística e o sistema Agrobacterium de maneira integrada.

Obtenção das freqüências naturais em torres estaiadas pelo método da matriz de transferência, representando o feixe de cabos por uma rigidez horizontal dinâmica

O objetivo do presente trabalho é o estudo do comportamento, em termos de freqüências naturais de estruturas de torres estaiadas, para diversas situações de serviço. Para isso criou-se uma formulação para a determinação dessas freqüências, utilizando o método da matriz de transferência. O procedimento consiste na discretização da estrutura em elementos de barras, massas discretas, molas e amortecedores viscosos, para a representação da estrutura. Com relação aos cabos da torre estaiada, desenvolveu-se uma expressão que nos fornece a rigidez completa dos mesmos, apoiados nos extremos, com amortecimento viscoso e as propriedades físicas e geométricas uniformes. Além disso, os cabos podem ser inclinados e sujeitos à excitação horizontal harmônica no apoio superior. Nesse caso, considera-se uma deformada parabólica do cabo na posição de equilíbrio estático, e por outro lado, os deslocamentos dinâmicos são considerados pequenos. A rigidez do cabo é válida para um ângulo de inclinação que varia de zero (0) a noventa (90) graus. Esse método é aplicável a microcomputadores devido a pouca memória empregada no processamento de dados. Com esse intuito, foi elaborado um programa para microcomputadores de 16 bits, que possibilita o estudo da estrutura da torre sobre o efeito de flexão pura, torção pura ou acoplamento de ambos. Exemplos numéricos de torres estaiadas e do comportamento da rigidez de cabos foram desenvolvidos para as mais diversas situações de cálculo.

Genética e mapeamento molecular da resistência parcial à ferrugem da folha da aveia (Avena sativa L.)

A ferrugem da folha é a moléstia de maior importância econômica para a cultura da aveia e a resistência qualitativa, geralmente utilizada para o seu controle, apresenta pouca durabilidade. A utilização de resistência parcial, caracterizada pelo progresso lento da moléstia, tem sido reconhecida como alternativa para obtenção de genótipos com resistência mais durável. Os objetivos deste trabalho foram determinar o progresso da ferrugem, o controle genético da resistência, e identificar marcadores moleculares associados a essa resistência, em várias gerações e anos. Populações F2, F3, F4, F5 e F6 do cruzamento UFRGS7/UFRGS910906 (sucetível/parcialmente resistente) (1998, 1999 e 2000) e F2 do cruzamento UFRGS7/UFRGS922003 (1998), foram avaliadas a campo quanto à porcentagem de área foliar infectada, para determinar a área sob a curva do progresso da doença (ASCPD). Mapeamento molecular, com marcadores AFLP (amplified fragment length polymorphism), foi realizado em F2 e F6, do primeiro cruzamento, identificando marcadores associados à resistência quantitativa (“quantitative resistance loci” ou QRLs). Resultados de três anos evidenciaram alta influência do ambiente na expressão da resistência, apresentando, entretanto, variabilidade genética para resistência parcial nas populações segregantes. A distribuição de freqüências do caráter ASCPD nas linhas recombinantes F5 e F6 foi contínua, indicando a presença de vários genes de pequeno efeito em seu controle. Estimativas de herdabilidade variaram de moderada a alta. O mapa molecular F2 foi construído com 250 marcadores, em 37 grupos de ligação, e o mapa F6 com 86 marcadores em 17 grupos de ligação. Cinco QRLs foram identificados na F2 e três na F6. O QRL identificado na F6, pelo marcador PaaMtt340 apresentou consistência em dois ambientes.

Avaliação dos parâmetros genéticos da população de arroz irrigado CNA 11 e da divergência genética entre os genitores

Os avanços nas práticas de manejo e no melhoramento das cultivares de arroz irrigado têm permitido consolidar o Rio Grande do Sul como maior produtor deste cereal no Brasil. A seleção recorrente é um método alternativo de melhoramento que permite a recombinação cíclica de genótipos selecionados em uma população geneticamente divergente. Os objetivos deste trabalho foram avaliar o potencial da população CNA 11 para fins de melhoramento para tolerância ao frio, estudar a divergência genética dos seus genitores e quantificar as alterações nas freqüências alélicas como resultado do processo de seleção. Para isso foram conduzidos dois ensaios de campo compostos de 140 famílias S0:2 derivadas da população CNA 11 e quatro cultivares testemunhas, no delineamento látice 12 x 12 e em dois locais: Cachoeirinha (RS) e Santa Vitória do Palmar (RS), onde foram avaliados dez caracteres fenotípicos. O DNA dos genitores da população CNA 11 e de 133 famílias S0:2 foi analisado com marcadores moleculares do tipo microssatélites. A população CNA 11 apresentou alto potencial para fins de melhoramento, com ampla variabilidade genética em todos os dez caracteres avaliados. Os caracteres estatura de planta, esterilidade de espiguetas e número de grãos por panícula apresentaram altas correlações genotípicas com rendimento de grãos, podendo ser usados como critérios de seleção indireta. A esterilidade de espiguetas mostrou ser um critério eficiente de seleção para identificação de genótipos de arroz com tolerância ao frio no estádio reprodutivo. Os genitores da população CNA 11 apresentaram ampla divergência genética e, de modo geral, as freqüências dos alelos de microssatélites característicos dos genótipos da subespécie índica aumentaram e as da subespécie japônica diminuíram à medida que a intensidade de seleção aumentou. As melhores famílias S0:2 mostraram maior similaridade genética com os genitores da subespécie índica.

Herança genética e mapeamento molecular da tolerância à toxidade do alumínio em aveia (Avena sativa L.)

A toxicidade do alumínio é um fator limitante para a obtenção de maior produtividade na cultura da aveia (Avena sativa L.). O desenvolvimento de genótipos tolerantes a altos níveis de toxidez ao alumínio é uma alternativa mais barata e viável para o cultivo em solos com subsolo ácidos. Os objetivos deste estudo foram avaliar genótipos de aveia quanto à reação ao alumínio tóxico em três soluções nutritivas, bem como, determinar a ação gênica, o número de genes, a herdabilidade do caráter e identificar marcadores moleculares associados a tolerância ao alumínio tóxico em genótipos de aveia. Oito genótipos foram avaliados em soluções nutritivas quanto à tolerância ao alumínio tóxico. A utilização de solução nutritiva foi eficiente para a discriminação dos genótipos de aveia quanto à tolerância ao alumínio. Os genótipos apresentaram variabilidade, sendo classificados como tolerantes, intermediários e sensíveis. A ação gênica aditiva foi a de maior importância, tanto na análise de média de gerações de oito cruzamentos, quanto na análise de um dialélico parcial envolvendo quatro genótipos. Em oito cruzamentos para determinação do número de genes envolvidos no caráter, através da análise do recrescimento da raiz principal de plantas em solução nutritiva, a segregação foi de apenas um gene com alelos múltiplos, sendo dois para tolerância (A1 e A2) e um para sensibilidade (a). A herdabilidade da característica foi alta, evidenciando que este caráter pode ser selecionado em programas de melhoramento, nas gerações iniciais. Na análise por microssatélites e AFLP, considerando as condições avaliadas, não foram identificados marcadores moleculares associados ao caráter.

Transformação genética em cevada por bombardeamento de partículas

A presente Tese de Doutorado objetivou: (1) definir um método eficiente de transformação genética, por bombardeamento de partículas, para a obtenção de plantas transgênicas de cultivares brasileiras de cevada e (2) identificar gene(s) codificante(s) de quitinase(s) potencialmente capaz(es) de conferir resistência ao fungo patogênico de cevada Bipolaris sorokiniana. Culturas de calos obtidos a partir de escutelos imaturos das cultivares Brasileiras de cevada MN-599 e MN-698 (Cia. de Bebidas das Américas, AMBEV) foram bombardeadas com partículas de tungstênio e avaliadas quanto à expressão do gene repórter gusA através de ensaios histoquímicos de GUS e quanto ao efeito dos bombardeamentos na indução estruturas embriogênicas e regeneração de plantas. As condições de biobalística analisadas incluíram a região promotora regulando a expressão de gusA, tipo e pressão de gás hélio de dois aparelhos de bombardeamento, distância de migração das partículas, número de tiros e a realização de pré e pós-tratamento osmótico dos tecidos-alvo. No presente trabalho foram obtidos um número bastante alto de pontos azuis por calo, a indução de calos embriogênicos e embriões somáticos em uma freqüência de até 58,3% e a regeneração de 60 plantas, sendo 43 de calos bombardeados. As melhores condições observadas foram o promotor e primeiro íntron do gene Adh de milho (plasmídeo pNGI), o aparelho de bombardeamento “ Particle Inflow Gun” (PIG) utilizando-se a distância de migração de partículas de 14,8 cm, dois tiros disparados por placa e a realização de tratamento osmótico dos explantes com 0,2 M de manitol e 0,2 M de sorbitol 4-5 horas antes e 17-19 horas depois dos bombardeamentos. Das 43 plantas obtidas de calos bombardeadas, 3 apresentaram atividade de GUS na base das suas folhas. A utilização de primers sintéticos definidos a partir de genes de quitinases descritos na literatura em PCRs resultou na amplificação de dois fragmentos de aproximadamente 700 e 500 pb a partir de DNA total das cvs. MN-599 e MN-698 de cevada e um fragmento, com aproximadamente 500 pb, a partir do DNA total do isolado A4c de Trichoderma sp. Estes fragmentos foram purificados dos géis de agarose e diretamente seqüenciados de forma manual e automática. Os fragmentos de 700 e 500 pb amplificados do genoma da cultivar MN-599 foram identificados como genes de quitinases de cevada e o fragmento de 500 pb do isolado A4c de Trichoderma sp. não apresentou homologia com seqüências conhecidas de quitinases depositadas no EMBL/GenBank. A utilização de novos pares de primers, representando seqüências conservadas de quitinases do fungo Metarhizium anisopliae, resultou na amplificação de 3 fragmentos a partir do DNA total do isolado A4b de Trichoderma sp., que estão sendo purificados para realização de seqüenciamento.

Variabilidade genética no Complexo Principal de Histocompatibilidade (MHC) de três espécies de mamíferos marinhos da costa do Rio grande do Sul

O MHC (Major Histocompatibility Complex) é um sistema genético importante para a manutenção de espécies ameaçadas, uma vez que baixa variabilidade para locos MHC tem sido associada a uma menor capacidade de resposta a doenças e diminuição do sucesso reprodutivo. Deste modo, pesquisas sobre a variabilidade genética do MHC têm demonstrado ser bastante informativas em estudos populacionais voltados para aspectos referentes à conservação. No presente trabalho foi investigada a variabilidade genética do MHC para três espécies de mamíferos marinhos (toninha, baleia franca austral e lobo marinho sul-americano) do sul do Brasil, com intensa mortalidade provocada por atividades humanas atuais ou passadas. As amostras foram coletadas de animais mortos encalhados na costa, de animais capturados acidentalmente por barcos pesqueiros, e também através de um sistema de biópsia. A região variável do exon 2 do gene DQB do MHC foi amplificada por PCR (Polymerase Chain Reaction) em 109 amostras de toninhas (Rio de Janeiro n=32, Rio Grande do Sul n=52, Argentina n=25), 35 amostras de lobo marinho sul-americano e 30 amostras de baleia franca austral, utilizando-se um par de primers heterólogos. O fragmento resultante de 172 pares de bases foi analisado quanto ao polimorfismo de seqüência através da técnica de SSCP (Polimorfismo de Conformação de Fita Simples) em todas as amostras de toninha e de lobo marinho sul-americano e 14 amostras de baleia franca austral. Dificuldades associadas à amplificação resultaram em padrões de SSCP pouco informativos para as amostras de lobo marinho sul-americano e baleia franca austral Todas as amostras de toninha apresentaram um padrão de pelo menos 4 bandas por indivíduo. As 4 bandas de um único indivíduo do Rio Grande do Sul foram seqüenciadas, tendo sido possível verificar que 2 seqüências relacionadas ao genes DQB estão sendo amplificadas com estes primers. Pelas análises de SSCP foi possível detectar ausência de variabilidade para as amostras de toninha provenientes do Rio de Janeiro e diferenciá-las da população da Argentina, que é polimórfica. A população do Rio Grande do Sul parece apresentar níveis intermediários de variação em relação aos extremos da distribuição da espécie. Analisando as três populações amostradas, conclui-se que a espécie apresenta baixos níveis de variabilidade para o loco DQB, a exemplo do que é reportado para os genes de MHC de outros mamíferos marinhos.

Análise dinâmica de rotores de grupos turbo e hidrogeradores com o método das matrizes de transferência

Conhecer o comportamento vibratório de rotores de máquinas rotativas, já durante a fase de projeto, é uma necessidade cada vez maior nos dias atuais, quando modificações corretivas, após o início da operação, já não são mais aceitáveis, devido aos altos custos de material e execução empregados, se comparados com os lucros que são cada vez mais reduzidos, em função das regras impostas pelo mercado, e devido também ao tempo necessário para tais modificações, que implica em manter a máquina parada, sem gerar lucros nesse penodo, acarretando em mu1tas contratuais para o fabricante. o presente trabalho visa dar subsídiosà análise dinâmicadas linhas de eixos de turbo e hidrogeradores (conjuntos formados pela turbina mais o gerador, usados respectivamentenas centraistermelétricase hidrelétricas). Inicialmente é feita uma breve explanação sobre formas construtivas de hidrogeradores e tipos de turbinas hidráu1icas utilizados atualmente. O trabalho prossegue apresentando as propriedades dos mancais com filme de óleo, os fenômenos do empuxo magnético no rotor do gerador e do efeito giroscópico, bem como a norma ISO 1940, que define os níveis admissíveis de desbalanceamentos residuais para rotores de máquinas É apresentada uma formulação matemática pelo Método das Matrizes de Transferência para as análises das vibrações livres, bem como das vibrações forçadas com carregamentos cíclicos devido aos desbalanceamentos residuais das linhas de eixos. A análise das vibrações livres é feita para a obtenção das fteqüências naturais torcionais e das fteqüências tlexionais críticas em um plano. A análise das vibrações forçadas é elaborada para fornecer as respostas dinâmicas em dois planos ortogonais, devido ao desbalanceamento residual. Para aplicação da metodologia de cálculo apresentada, são elaboradas rotinas computacionais de cálculos, utilizando como plataforma o software MATLAB. Para testar o Método das Matrizes de Transferência, bem como os programas de computador elaborados, faz-se algumas análises com soluções analíticas exatas e comparam-se resultados obtidos. Como aplicação prática, faz-se um estudo aprofundado dos comportamentos dinâmicos algumas linhas de eixos de hidrogeradores, para variações de configurações de construção dessas, bem como para as diversas condições de operação.

Epistemologia genética e pesquisa docente : estudo das ações no contexto escolar

O estudo das ações no contexto escolar, aqui apresentado, foi realizado tendo como suporte teórico a Epistemologia Genética e desencadeado pela investigação do significado das ações docentes numa abordagem construtivista. Destacando a complementaridade da teoria piagetiana em relação à teoria de Paulo Freire, na pesquisa empreendida, este estudo deixa evidente a atualidade e relevância da Epistemologia Genética à transforma-ção do fazer escolar. Nele são apresentadas situações didáticas efetivamente vivenciadas pela autora, no convívio diário e contínuo com seus alunos, na quarta série, e realizadas análises teóricas com o objetivo de demonstrar como, sob o enfoque construtivista e a adoção do Método Clínico, adaptado à coletividade da sala de aula, podem ocorrer o pla-nejamento contínuo, as intervenções e investigações docentes. A sala de aula, vista como contexto de relações, é o espaço no qual a interdependência das ações vai definindo a história dos grupos, na cotidianidade de suas interações, tecendo, assim, a construção do conhecimento.

Genética do acamamento em trigo (Triticum aestivum L.) e a identificação do caráter para seleção

O problema do acamamento em trigo tem chamado a atenção dos melhoristas devido à severidade dos danos causados as plantas com reflexo no rendimento e na qualidade dos grãos. É um caráter difícil de ser estudado diretamente, dados a múltiplas interações com o ambiente. Muitos trabalhos foram desenvolvidos procurando identificar métodos para seleção indireta. A estatura de planta foi exaustivamente estudada por ser um caráter de alta herdabilidade e fortemente correlacionado com o acamamento; entretanto, plantas com estatura abaixo de 70 cm são inadequadas para o cultivo devido a sua pouca competitividade com as ervas daninhas e por apresentarem dificuldades para a colheita mecanizada. Neste sentido, no presente trabalho foram testados os vários caracteres relacionados com o acamamento e métodos indiretos que possibilitem maiores ganhos na seleção. Foi identificado o coeficiente de resistência do colmo, método internacionalmente conhecido com cLr, como sendo a metodologia mais eficiente para seleção indireta em populações segregantes. Foi também mensurada a dissimilaridade genética entre dez cultivares de trigo recomendadas para cultivo no Rio Grande do Sul e Santa Catarina, no ano 2000, e mais os genótipos IAC 5 e TB 951. A genética do caráter cLr foi estudada através da Análise de Gerações, metodologia também conhecida como Teste de Escala Conjunta. Foram avaliadas a natureza e a magnitude dos efeitos gênicos envolvidos o que ficou determinado que a aditividade e dominância atuam de maneira similar. Não foram encontrados efeitos epistáticos e a herdabilidade no sentido restrito foi de mediana a alta. O caráter cLr parece ser controlado por dois genes independentes com dois alelos cada, sendo que o genótipo duplamente recessivo (aabb) expressou fenotipicamente os valores mais altos para resistência ao acamamento.