Efeitos citotóxicos do teniposide, um derivado semi-sintético das epipodofilotoxinas, sobre linhagens celulares de carcinoma renal humano

O câncer renal corresponde a aproximadamente 3% dos tumores malignos do adulto, sendo a terceira malignidade urológica mais comum. Os tratamentos sistêmicos disponíveis para pacientes portadores de carcinoma renal avançado são, via de regra, pouco eficazes e sem um impacto definido na sobrevida. Portanto, torna-se imperioso que novos agentes e/ou estratégias terapêuticas para esta enfermidade sejam desenvolvidas. O derivado das epipodolofilotoxinas, etoposide, tem sido utilizado com sucesso no tratamento de vários tipos de tumores sólidos e hematológicos. Este agente exerce a sua ação antitumoral através da inibição da enzima nuclear topoisomerase II. Estudos recentes demonstraram que o efeito citotóxico in vitro deste agente é bem mais pronunciado quando as linhagens tumorais são expostas à droga por um tempo mais prolongado. Isto vem sendo confirmado em estudos clínicos, nos quais foi documentado um aumento significativo no percentual de respostas tumorais objetivas em pacientes com câncer avançado tratados com etoposide em doses repetidas diárias de forma continuada, comparativamente a pacientes que receberam pulsos de doses altas da droga a intervalos mais longos. Infelizmente, estudos iniciais com etoposide não revelaram uma atividade antitumoral significativa em pacientes com câncer renal avançado. Por esta razão, os estudos preliminares explorando o potencial terapêutico de seu análogo teniposide nesta doença também não receberam a devida atenção na literatura. Entretanto, este análogo possui potenciais vantagens terapêuticas em relação ao etoposide, uma vez que apresenta um tempo de retenção intracelular mais prolongado em linhagens de tumores sólidos in vitro. Estas observações nos estimularam a reconsiderar o estudo do potencial citotóxico do teniposide em modelos experimentais de câncer renal avançado. Nesta dissertação, foram estudados vários protocolos de administração de teniposide em linhagens de câncer renal humano, uma vez que esta neoplasia carece de drogas ativas disponíveis no armamentário terapêutico. Foram utilizadas as linhagens celulares RXF-393, A-498 e TK-10, as quais foram incubadas com teniposide em concentrações pré-determinadas e tempos de incubação variáveis. Além disto, foram feitos experimentos em que protocolos de administração de teniposide como agente único foram comparados a protocolos em que o mesmo foi combinado com agentes que bloqueiam a ação da glicoproteína P, responsável pelo efluxo ativo da droga do interior da célula tumoral. Além disso, foram também estudados protocolos incluindo a associação de teniposide com agentes que interferem com a síntese do DNA. Para os estudos de avaliação de citotoxicidade dos agentes quimioterápicos, os mesmos foram pré-incubados por 24 h na ausência ou presença do inibidor da DNA polimerase α afidicolina glicinada (0,2 µM) ou do inibidor da ribonucleotídeo redutase hidroxiuréia (200 µM) e após incubados por diferentes tempos de exposição com diluições seriadas de teniposide. Os efeitos citotóxicos foram avaliados através do método colorimétrico com sulforodamina B (SRB). Os protocolos de exposição prolongada das células ao teniposide mostraram um aumento significativo na sua citotoxicidade nas linhagens RXF-393, A-498 e TK-10, sugerindo que a citotoxicidade do teniposide é dependente de tempo de administração. Neste sentido, uma maior taxa de dano no DNA foi observada nas células expostas ao teniposide por tempos de administração mais prolongados. Curiosamente, os diferentes tempos de exposição ao teniposide não influenciaram de forma clara na formação de complexos DNA-topoisomerase II, nem nas medidas da atividade desta enzima. O uso concomitante de agentes moduladores da glicoproteína P como o verapamil, a ciclosporina A e o tamoxifeno não produziu potencialização do efeito antiproliferativo do teniposide. Por sua vez, os tratamentos com agentes que interferem na síntese de DNA, como a afidicolina glicinada ou a hidroxiuréia, potencializaram a citotoxicidade do teniposide em todas as linhagens estudadas, seguindo as características intrínsecas de cada linhagem. Em conclusão, os resultados apresentados nesta dissertação sugerem que o teniposide apresenta um maior efeito citotóxico em protocolos de administração prolongada em combinação com agentes inibidores da síntese de DNA. Frente a estes resultados iniciais, o teniposide será testado nos protocolos de administração acima mencionados em um painel contendo um maior número de linhagens tumorais in vitro. Uma vez confirmadas as observações acima descritas, serão iniciados estudos em modelos tumorais in vivo. Estes estudos servirão de base nas decisões quanto à reavaliação clínica do teniposide em ensaios de fase I em pacientes com neoplasias avançadas refratárias.

Validação de métodos analíticos e estudo preliminar de estabilidade da leflunomida

A leflunomida é um pró-fármaco anti-reumático encontrado na forma de comprimidos revestidos com nome comercial ARAVA que, in vivo, é rápida e extensamente convertida a seu metabólito ativo A77 1726. Considerando a ausência de metodologia de controle de qualidade na literatura para a leflunomida, foram desenvolvidos métodos de caracterização e quantificação da leflunomida matéria-prima e na forma de comprimido, além de estudo preliminar de sua estabilidade. As técnicas de ponto de fusão, espectroscopia no IV, RMN 1H e 13C e CLAE associada a detector de arranjo de diiodos foram utilizadas para identificação e caracterização da leflunomida. O A77 1726 foi sintetizado e caracterizado pelas técnicas de espectroscopia no IV, RMN 1H e 13C, CLAE e DSC. Foi desenvolvido e validado método analítico para quantificação da leflunomida em comprimidos por CLAE utilizando coluna C18, ACN:água (50:50) como fase móvel e detecção em 254 nm. O método apresentou parâmetros cromatográficos adequados e parâmetros de desempenho analítico satisfatórios, com limite de detecção de 10 ng/mL. Método por espectroscopia derivada no UV foi desenvolvido e validado como alternativa para quantificação da leflunomida em comprimidos. A comparação do método por UV derivada com a CLAE, para determinação da leflunomida em comprimidos, mostrou que os métodos são intercambiáveis, creditando a técnica de UV para testes de controle de qualidade de rotina. Foram realizados estudos de degradação forçada dos comprimidos de leflunomida submetendo amostras à temperatura de 80 ºC ou exposição à radiação UV a 254 nm com lâmpada germicida. O principal produto de degradação encontrado foi o A77 1726. Além disso, outro produto de degradação, com tempo de retenção de 5,5 min (CLAE), apresentou quantidades significativas no estudo de degradação térmica.

Desenvolvimento da técnica LTM-BSizer para a caracterização de bolhas e a avaliação de parâmetro no processo de flotação

Este trabalho teve como objetivo o desenvolvimento de uma nova técnica para determinação do tamanho médio e da distribuição de tamanho de bolhas de ar em meio aquoso. A nova técnica, denominada de LTM-BSizer, uma vez otimizada, foi aplicada na caracterização das bolhas geradas por diversos métodos utilizados tanto na flotação para tratamento de efluentes líquidos quanto na flotação de partículas minerais e, principalmente, na investigação de parâmetros operacionais e do efeito do tamanho de bolhas na flotação de partículas minerais (quartzo como modelo) finas (40-10 µm) e ultrafinas (<10 µm). A técnica LTM-BSizer é baseada no conceito da captura, ou seja, ao contrário das técnicas fotográficas até agora propostas, onde as imagens (fotos ou vídeos) das bolhas em movimento foram obtidas com visores verticais, este método obteve as imagens das bolhas estabilizadas em um visor disposto na horizontal. Entre as vantagens em relação aos métodos fotográficos existentes destacam-se a melhor qualidade das imagens e a capacidade de medir distribuições de tamanho de bolha com grande amplitude, desde microbolhas (<100 µm) até bolhas maiores (~ 1 a 3 mm). Os métodos de geração de bolhas pesquisados foram: microbolhas geradas por despressurização de água saturada com ar em um vaso saturador (processo de flotação por ar dissolvido-FAD) ou por uma bomba centrífuga multifase (novo equipamento para geração de microbolhas), injeção de mistura ar-líquido através de um constritor tipo venturi (destaque na flotação não convencional), injeção de ar em cilindro inox poroso (comumente aplicado para dispersão de gás) e bolhas geradas em uma célula de flotação por ar induzido (FAI), convencional de bancada Para todos os métodos citados, exceto o último, a distribuição de tamanho de bolha foi avaliada numa coluna em acrílico com 200 cm de altura e 72 mm de diâmetro, onde através de um ponto de amostragem parte do fluxo foi conduzida até o visor. Os resultados obtidos com esta técnica foram, para os diâmetros médios de bolha: 30 a 70 µm para FAD, 65 a 130 µm para bomba multifase, 200 a 1400 µm para venturi, 500 a 1300 µm para FAI e 500 a 1000 µm para o cilindro poroso. A influência de alguns parâmetros operacionais na formação das bolhas foi estudada em detalhe e os resultados obtidos mostraram uma boa correspondência com os valores encontrados na literatura e em outros casos, elucidaram efeitos considerados contraditórios na literatura técnica. Este trabalho demonstrou que, o tamanho médio e a distribuição de tamanho das microbolhas, não são influenciados pela pressão de saturação no intervalo de 294 a 588 kPa, mas sim pela quantidade de bolhas e pelo tempo de retenção Também foi constatado que a diminuição da tensão superficial da água (adição de 30 mg/L de oleato de sódio) aumenta consideravelmente (3 a 8 vezes) o número de microbolhas na FAD a baixas pressões de saturação (196 e 294 kPa). O tamanho e a distribuição de tamanho de bolhas geradas em constrições de fluxo tipo venturi variam em função dos parâmetros concentração de tensoativo, velocidade superficial de líquido (UL) e razão gás/líquido (Qr). Uma pequena diminuição da tensão superficial, de 73 para 68 mN/m, provocada pela adição de 20 mg/L do tensoativo DF 250, foi suficiente para diminuir consideravelmente o tamanho das bolhas geradas, permanecendo constante para concentrações maiores, sugerindo que esta seja a concentração crítica de coalescência (CCC) para este sistema. Um aumento de UL (mantendo Qr constante) e diminuição de Qr (com UL constante) levaram a distribuições com menor amplitude e diâmetro médio. No caso das microbolhas geradas através da bomba multifase, o tamanho de bolhas diminuiu com a pressão até atingir o limite de solubilidade teórico ar/líquido. O tamanho das bolhas gerados através de placa porosa e FAI apresentaram boa correspondência com os reportados na literatura e em ambas as técnicas foi, de novo, encontrada, para DF 250, a mesma CCC igual a 20 mg/L. O sistema de flotação de partículas finas e ultrafinas, foi estudado via recuperação de finos de quartzo (50% < 10µm) em coluna de laboratório. As variáveis estudadas foram; a distribuição de tamanho de bolhas e a concentração de coletor (amina). Os resultados obtidos mostraram que a recuperação das frações mais finas aumenta com a diminuição do tamanho de bolhas de acordo com os modelos existentes de flotação. Entretanto, foi encontrado, na captura de partículas ultrafinas pelas bolhas, um valor ótimo de tamanho de partícula. Assim, a captura diminui com o tamanho de partícula até 5-7 µm e aumenta, de novo, nas frações menores. Esses resultados são discutidos em termos de um mecanismo de difusão como fenômeno predominante nos mecanismos de adesão bolha-partícula.

Uso de acidificantes em dietas de frangos de corte : resíduos no trato digestivo e efeitos sobre o desempenho animal e morfologia intestinal

Três experimentos foram conduzidos para determinar o efeito de diferentes misturas de acidificantes no desempenho, morfologia e presença de resíduos de ácidos orgânicos no intestino delgado de frangos de corte. Nos experimentos 1 e 2 foram utilizados 2.112 frangos de corte distribuídos em 6 tratamentos (Experimento 1) e 8 tratamentos (Experimento 2). Foi observado um efeito benéfico geral das misturas de acidificantes na dieta no desempenho dos frangos de corte. Não houve diferença em relação as dietas Controle Positivo e resposta superior, em comparação as dietas Controle Negativo. Houve efeito positivo da inclusão de misturas de acidificantes na morfologia intestinal, em relação as dietas Controle Negativo. Não houve diferença entre os tratamentos para o número de vilos por quadrante. A altura das vilosidades foi significativamente inferior para as aves do Controle Negativo. A profundidade de cripta foi significativamente superior para os animais recebendo as dietas com acidificantes. O intestino delgado das aves do Controle Negativo foi mais pesado e mais comprido do que os demais tratamentos, sendo o seu peso maior em função do peso para jejuno e íleo, mas não para o do duodeno. Foi observada correlação negativa entre o nível de acidificante na dieta e a concentração de ácidos nas secções do intestino delgado. A adição de acidificantes na dieta influenciou o padrão de concentração dos ácidos no intestino delgado, no entanto este é constante nos dois períodos de tempo analisados, 7 e 21 dias de idade. A adição de misturas de ácidos orgânicos foi eficiente na manutenção do desempenho e condições morfológicas do intestino delgado de frangos de corte.