Expressão de uma quitinase de Metarhizium anisopliae em Nicotiana tabacum : obtenção de plantas transgênicas resistentes a doenças fúngicas

A resistência a doenças em plantas transgênicas tem sido obtida por meio da expressão de genes isolados de bactérias, fungos micoparasitas e plantas. Neste trabalho, relatamos a utilização de um gene do fungo entomopatogênico Metarhizium anisopliae como modo de gerar resistência a doenças fúngicas em plantas. O gene chit1 codifica a quitinase CHIT42 (EC 3.2.1.14), pertencente a uma classe de glicosil-hidrolases capazes de converter quitina em oligômeros de N-acetil-glicosamina (NAcGlc). Quando presentes em tecidos vegetais, supõese que as quitinases ataquem especificamente a parede celular de fungos invasores, provocando danos às hifas e causando a morte por lise das células fúngicas. Deste modo, dois diferentes grupos de plantas transgênicas de Nicotiana tabacum foram produzidos: no primeiro deles, denominado chitplus, os indivíduos possuem o gene chit1 sob o controle do promotor CaMV 35S. O segundo grupo, demoninado chitless, consiste de plantas transformadas com um T-DNA não contendo o gene do fungo. Trinta e quatro plantas transgênicas resistentes à canamicina (17 de cada grupo) foram regeneradas a partir de discos de folhas infectados por Agrobacterium tumefaciens. A produção da quitinase em extratos protéicos de folhas foi analisada por zimogramas em SDS-PAGE contendo glicol-quitina e corados por calcoflúor branco, na forma de um screening dos transgênicos primários. As plantas transgênicas foram testadas, ainda, por meio de ensaios colorimétricos empregando oligômeros sintéticos de NAcGlc como substratos específicos, além de immunoblot e Western blot com soro anti-quitinase. A quantidade de enzima recombinante nas plantas chitplus variou desde nenhuma atividade detectável a elevados níveis de expressão da enzima. A hibridização de Southern blot demonstrou que o número de cópias do gene chit1 integradas no genoma vegetal foi estimado entre uma e quatro. A primeira geração de plantas transgênicas geradas por autofecundação de parentais portadores de duas cópias do transgene foi testada com relação à estabilidade da herança do transgene e em 43 de um total de 67 descendentes, originados de quatro cruzamentos independentes, o padrão de segregação não diferiu das proporções Mendelianas esperadas. Ensaios de resistência, desafiando as plantas transgênicas com o basidiomiceto Rhizoctonia solani foram realizados e uma evidente diminuição da área foliar contendo lesões fúngicas foi observada entre as linhagens transgênicas, embora variações na atividade quitinolítica tenham influenciado o nível de resistência. Nossos resultados sugerem uma relação direta entre a atividade específica de quitinase e ao aumento nos níveis de resistência às lesões causadas pela infecção por R. solani.

Desenvolvimento de uma estratégia de fusão gênica visando à localização de proteínas em plantas

Uma significativa quantidade de proteínas vegetais apresenta-se compartimentalizada nas diversas estruturas celulares. A sua localização pode conduzir à elucidação do funcionamento dos processos biossintéticos e catabólicos e auxiliar na identificação de genes importantes. A fim de localizar produtos gênicos relacionados à resistência, foi utilizada a fusão de cDNAs de arroz (Oryza sativa L.) ao gene da proteína verde fluorescente (GFP). Os cDNAs foram obtidos a partir de uma biblioteca supressiva subtrativa de genes de arroz durante uma interação incompatível com o fungo Magnaporthe grisea. Estes cDNAs foram fusionados a uma versão intensificada de gfp e usados para transformar 500 plantas de Arabidopsis thaliana. Outras 50 plantas foram transformadas com o mesmo vetor, porém sem a fusão (vetor vazio). Foram obtidas aproximadamente 25.500 sementes oriundas das plantas transformadas com as fusões EGFP::cDNAs e 35.000 sementes das transformadas com o vetor vazio, produzindo, respectivamente, 750 e 800 plantas tolerantes ao herbicida glufosinato de amônio. Após a seleção, segmentos foliares das plantas foram analisados por microscopia de fluorescência, visando o estabelecimento do padrão de localização de EGFP. Foram observadas 18 plantas transformadas com a fusão EGFP::cDNAs e 16 plantas transformadas com o vetor vazio apresentando expressão detectável de GFP. Uma planta transformada com uma fusão EGFP::cDNA apresentou localização diferenciada da fluorescência, notadamente nas células guarda dos estômatos e nos tricomas. Após seqüenciamento do cDNA fusionado, foi verificado que esta planta apresentava uma inserção similar a uma seqüência codificante de uma quinase, uma classe de enzimas envolvidas na transdução de sinais em resposta à infecção por patógenos.