Estratégias de avaliação e herança da tolerância ao alumínio tóxico em linhagens recombinantes de aveia (Avena sativa L.)

Genótipos de aveia variam quanto à tolerância ao alumínio no solo. Uma maneira fácil, rápida e eficiente de identificar a tolerância ao alumínio é através do uso de solução nutritiva, em laboratório. Os objetivos deste estudo foram ajustar a metodologia de avaliação da tolerância ao alumínio, avaliar linhagens recombinantes quanto à tolerância ao alumínio em laboratório e a campo e estimar o número de genes que controlam o caráter, identificar marcadores morfológicos associados com a tolerância ao alumínio e avaliar os efeitos do gene de tolerância ao alumínio sobre caracteres de importância agronômica. Os ajustes na metodologia foram realizados envolvendo genótipos de aveia e trigo com resposta conhecida ao alumínio tóxico. Uma população de 333 linhagens recombinantes nas gerações F5:6 e F5:7 provenientes do cruzamento entre os genitores UFRGS 930598-6 (sensível) e UFRGS 17 (tolerante) foi avaliada em solução nutritiva. O número de genes que controlam a tolerância ao alumínio foi estimado pela distribuição de freqüência do recrescimento médio da raiz principal. Uma amostra de 22 linhagens recombinantes sensível e tolerante ao alumínio tóxico foi avaliada no campo, com alta concentração de alumínio no solo. A associação e o efeito do gene de tolerância ao alumínio com outros caracteres agronômicos foram realizados a campo em solo livre de alumínio. A técnica de avaliação da tolerância ao alumínio permitiu a discriminação mais eficiente dos genótipos após os ajustes realizados. A tolerância ao alumínio em aveia é governada por um gene de grande efeito, sendo que os genótipos tolerantes possuem os alelos AlaAla e os genótipos sensíveis os alelos alaala. A avaliação da tolerância ao alumínio em laboratório foi confirmada a campo. O caráter tolerância ao alumínio não apresenta alta associação com outros caracteres agronômicos. A presença do gene de tolerância ao alumínio não está associada a efeitos negativos em caracteres de importância agronômica.

Componentes da resistência quantitativa à ferrugem da folha em linhagens recombinantes de aveia

A ferrugem da folha da aveia, causada pelo fungo Puccinia coronata f. sp. avenae, é responsável por grandes decréscimos na produção, afetando tanto o rendimento como a qualidade de grãos. O controle através do uso de cultivares com resistência qualitativa tem se mostrado pouco efetivo em termos de durabilidade. Neste sentido, a resistência quantitativa pode ser uma alternativa de controle viável, em busca de uma resistência mais durável, já que exerce menor pressão de seleção sobre a população patogênica. A resistência quantitativa reduz a taxa de progresso da doença, pela combinação dos diversos componentes que a condicionam, como: longo período latente, curto período infeccioso, baixa eficiência de infecção e pústulas de comprimento reduzido. Não se sabe ao certo o papel individual de cada um destes componentes sobre o progresso da doença no campo, bem como, o número de genes que determinam estas características. Assim, este trabalho visou caracterizar os componentes da resistência quantitativa (período latente, período infeccioso, comprimento de pústulas e ASCPD) à ferrugem da folha da aveia, em planta adulta e plântulas, tanto em condições controladas como em condições de campo. Para tanto foram utilizadas 83 linhagens recombinantes F6:10 de aveia branca, oriundas do cruzamento de um pai suscetível (UFRGS 7) com um pai com resistência quantitativa (UFRGS 910906). As linhagens apresentaram variabilidade para as características avaliadas, exceto para comprimento de pústulas em planta adulta. Os componentes da resistência apresentaram distribuição normal, exceto o comprimento de pústulas em planta adulta e o período de latência em plântulas. Isto sugere a presença de vários genes de pequeno efeito atuando na expressão dos mesmos, não se enquadrando em nenhum modelo de poucos genes. Os resultados sugerem que a resistência quantitativa à ferrugem da folha da aveia é resultado da ação conjunta de todos os componentes que a condicionam, e não de apenas um deles. Ainda, mecanismos diferenciados parecem estar atuando em cada genótipo na expressão desta característica.

Genética e mapeamento molecular da resistência parcial à ferrugem da folha da aveia (Avena sativa L.)

A ferrugem da folha é a moléstia de maior importância econômica para a cultura da aveia e a resistência qualitativa, geralmente utilizada para o seu controle, apresenta pouca durabilidade. A utilização de resistência parcial, caracterizada pelo progresso lento da moléstia, tem sido reconhecida como alternativa para obtenção de genótipos com resistência mais durável. Os objetivos deste trabalho foram determinar o progresso da ferrugem, o controle genético da resistência, e identificar marcadores moleculares associados a essa resistência, em várias gerações e anos. Populações F2, F3, F4, F5 e F6 do cruzamento UFRGS7/UFRGS910906 (sucetível/parcialmente resistente) (1998, 1999 e 2000) e F2 do cruzamento UFRGS7/UFRGS922003 (1998), foram avaliadas a campo quanto à porcentagem de área foliar infectada, para determinar a área sob a curva do progresso da doença (ASCPD). Mapeamento molecular, com marcadores AFLP (amplified fragment length polymorphism), foi realizado em F2 e F6, do primeiro cruzamento, identificando marcadores associados à resistência quantitativa (“quantitative resistance loci” ou QRLs). Resultados de três anos evidenciaram alta influência do ambiente na expressão da resistência, apresentando, entretanto, variabilidade genética para resistência parcial nas populações segregantes. A distribuição de freqüências do caráter ASCPD nas linhas recombinantes F5 e F6 foi contínua, indicando a presença de vários genes de pequeno efeito em seu controle. Estimativas de herdabilidade variaram de moderada a alta. O mapa molecular F2 foi construído com 250 marcadores, em 37 grupos de ligação, e o mapa F6 com 86 marcadores em 17 grupos de ligação. Cinco QRLs foram identificados na F2 e três na F6. O QRL identificado na F6, pelo marcador PaaMtt340 apresentou consistência em dois ambientes.

Análise da variabilidade de Magnaporthe grisea no Estado de Santa Catarina

A rápida perda da resistência das cultivares de arroz à brusone, causada por Magnaporthe grisea (Herb.) Barr, é geralmente atribuída à variabilidade genética do patógeno ou ainda à ocorrência de escape durante a seleção de novas cultivares. Com o objetivo de caracterizar a estrutura genética de um grupo de isolados de M. grisea em Santa Catarina (SC), plantas com sintomas de brusone foram coletadas em 12 municípios e na Estação Experimental da Epagri em Itajaí (EEI), SC. Os isolados foram analisados através de rep-PCR baseado no transposon Pot-2. Para a identificação das raças, um subgrupo de isolados foi inoculado na série internacional de cultivares diferenciais de arroz. As raças identificadas tiveram seu espectro de virulência avaliado em um grupo de cultivares com genes de resistência conhecidos (isolinhas). Isolados que apresentaram características genéticas distintas, foram avaliados quanto a capacidade de recombinação parassexual. Noventa e dois isolados monoconidiais obtidos foram agrupados através de rep-PCR em 13 haplótipos e 2 linhagens. Nove haplótipos encontrados na amostragem dos municípios não foram encontrados na EEI, indicando a ocorrência de escape. Seis raças de M. grisea foram identificadas a partir da inoculação de 28 isolados, representando 12 haplótipos na série diferencial, sendo que, 5 destas, foram avirulentas à isolinha que possui os genes de resistência Pi-1 e Pi-11. Por outro lado, o isolado 25, agrupado na raça IA-65, superou 4 das 5 isolinhas testadas. A análise da capacidade de recombinação parassexual mostra a existência de compatibilidade vegetativa associado à ocorrência de anastomoses entre três haplótipos, sendo identificados três possíveis isolados recombinantes.

Clonagem, caracterização e expressão de cDNAs similares a calreticulina e paramiosina isolados de glândula salivar do carrapato Boophilus microplus (Canestrini, 1887)

O carrapato Boophilus microplus é um dos mais importantes ectoparasitas dos rebanhos bovinos, estando em todas as áreas tropicais e subtropicais entre o paralelo 32 °N e 32 °S, abrangendo regiões que se dedicam à pecuária na América, África, Ásia e Oceania. O controle do carrapato B. microplus é realizado principalmente com o uso de acaricidas, entretanto devido a crescente preocupação com os problemas criados pela poluição química do ambiente, ao alto custo e toxicidade das drogas e ao aparecimento de carrapatos resistentes aos acaricidas, alternativas para o controle do B. microplus devem ser encontradas. A sobrevivência dos carrapatos depende grandemente da sua capacidade de evadir o sistema imunológico dos hospedeiros, portanto antígenos da glândula salivar poderiam ser alvos para intervenção imunoprofilática. Neste trabalho foram isolados cDNAs não previamente descritos correspondentes a antígenos presentes na glândula salivar. cDNAs que codificam para proteínas similares a paramiosina e calreticulina foram seqüenciados, expressos em Escherichia coli e as proteínas recombinantes purificadas, tendo sido produzidos soros policlonais contra as proteínas recombinantes em coelhos. As seqüências foram caracterizadas e alinhamentos múltiplos com outras seqüências foram determinados. O gene da calreticulina mostrou ser expresso em todos os estágios e tecidos testados, tanto em experimentos de RT-PCR quanto de Western blot, tendo sido demonstrado também a sua secreção pela saliva. Análise filogenética indica o agrupamento do gene de B. microplus com seqüências de outros artrópodos. Soros de bovinos infestados não reconhecem a calreticulina recombinante, apesar dela ser reconhecida pelo soro de cães infestados pelo carrapato Rhippicephalus sanguineus. A paramiosina mostrou-se, em ensaios de Western blot, também estar presente em todos os estágios testados, porém não na saliva. A paramiosina recombinante foi capaz de ligar colágeno e IgGs. Ambas as proteínas correspondem a proteínas multi-funcionais possivelmente envolvidas na imunomodulação do hospedeiro, tendo sido sugeridas como imunógenos protetores contra outros parasitas.

Clonagem e caracterização parcial de cDNA de glândula salivar de Boophilus microplus (Acari:Ixodidae) similar a glutationa s-transferase

O carrapato Boophilus microplus é um ectoparasita hematófago de bovino que causa sérias perdas econômicas. Estudos para o desenvolvimento de formas alternativas de controle do carrapato tem sido realizados para diminuir ou substituir a aplicação de agentes químicos, que contaminam o ambiente, os derivados da carne, além dos problemas de resistência das gerações de carrapatos aos acaricidas. As vacinas são uma forma alternativa de controle do carrapato. As enzimas glutationa S-transferase (GSTs) são alvo potencial para intervenção imunológica contra alguns parasitas. Este trabalho teve como objetivo isolar e caracterizar parcialmente um cDNA de B. microplus similar a GST da classe Mu. O clone SG2 foi isolado dentre aproximadamente 8 x 103 pfu de fagos recombinantes de uma biblioteca de cDNA de glândula salivar de partenógina, sondada com anti-soro de coelho contra glândula salivar. O clone SG2 contendo um inserto de 864 pb teve sua seqüência determinada e a fase de leitura aberta corresponde a 220 amino ácidos. A análise desta seqüência indicou que o gene clonado codifica uma GST de B. microplus (BmGST) com um motivo altamente conservado entre os resíduos 60 e 68 que compreende o sítio de ligação a glutationa (GSH) e outro motivo SLAILRYL, centrado no resíduo 78 da seqüência. No alinhamento múltiplo da AgSG2 com outras GSTs foi observada uma similaridade de até 41% com GSTs da classe Mu de outros organismos e inclusive com outra GST da classe Mu isolada de larva de B. microplus (HE et al., 1999). A proteína recombinante AgSG2 purificada apresentou atividade enzimática contra o substrato cromogênico CDNB. Ensaios de atividade enzimática com extratos de tecidos, secreções e excreções foram realizados para verificar a presença de GST. Ensaios de RT-PCR com tecidos de B. microplus indicaram que os sítios de síntese de BmGST são glândulas salivares e intestino de partenógina e teleógina.

Mapeamento de QTLs para tolerância ao frio e características de importância agronômica em arroz

A temperatura baixa é um estresse comum na cultura do arroz em regiões temperadas, portanto a tolerância ao frio é uma característica altamente desejável em genótipos brasileiros de arroz cultivados no sul do país, onde as temperaturas baixas prejudicam o estabelecimento da lavoura e diminuem o redimento de grãos. O mapeamento molecular é uma estratégia promissora para o estudo e compreensão de de características com controle complexo, tais como a tolerância ao frio em arroz. Com base nisso, os objetivos deste trabalho foram estudar a herança e herdabilidade das características de tolerância ao frio e das características de importância agronômica a serem maepadas, desenvolver um mapa molecular a partir da população segregante F2 proveniente do cruzamento IRGA 417 (Índica) x Quilla 66304 (Japônica) e identificar locos de características quantitativas (QTLs) para a tolerância ao frio no período de germinação e vegetativo e características agronômicas que diferenciam estas duas subespécies. Por fim, investigar a possibilidade de obter indivíduos recombinantes com caracteristicas agronômicas desejáveis e toleância ao frio em uma população F2 do cruzamento entre IRGA 417 x Quilla 66304. As análises das distrbuições de freqüências da geração F2 evidenciaram a dificuldade de estimar o número de genes que controlam as características analisadas, sendo que todas elas apresentam distribuição contínua e segregação transgressiva em relação aos genitores. O mapa foi construído com base em oito marcadores SSR e 42 marcadores do tipo AFLP com uma densidade média de marcador a cada 38,8 cM, sendo o comprimento total do mapa de 581,6 cM. Foram identificados cinco QTLs, sendo que um deles confere tolerância ao frio no período de germinação, e explica 15,9% da variação fenotípica deste caráteer. O outros quatro QTLs identificados foram para largura do grgão (21,3%), esterilidade de espiguetas (61,6%), estatura das plantas (34, 5%) e comprimento do grão (21,9%). A detecção de um QTL associado à tolerância ao frio no período de germinação, e outros QTLs associados à demais características a viabilidade deste tipo de análise. Entretanto, um mapa de ligação enriquecido é nceessário para permitir a detecção de outros QTLs associados às características estudadas. Plantas recombinantes com alto recrescimento de coleóptilo e outrras caracteristicas agronômicas desejáveis foram encontradas, o que evidencia o potencial da população proveniente de IRGA 417 x Quilla 66304 para o melhoramento da tolerância ao frio de genótipos de arroz adaptados ao Sul do Brasil.

Desenvolvimento de ferramentas moleculares para indução de tolerância imunológica em transplante

As vacinas de DNA têm sido utilizadas para a indução de imunidade contra antígenos virais e bacterianos. A aplicação de modelos experimentais tem sido explorada visando a indução de tolerância imunológica através da expressão de genes cujos produtos podem modular o sistema imune para um estado de não responsividade. A terapia gênica oferece a possibilidade de manipulação do sistema imune do receptor, através de um sistema de administração de genes específicos sob condições pré-definidas. Sua eficácia depende dos níveis de expressão e da natureza do antígeno, da via de administração assim como de sua distribuição nos tecidos (a qual às vezes depende do promotor utilizado). Porém, sua aplicação clínica é limitada em parte devido aos baixos níveis de expressão obtidos in vivo. A VP22 é uma proteína do tegumento do vírus Herpes simples tipo 1, que tem a propriedade de fazer tráfego intercelular. Estudos recentes têm demonstrado a alta eficiência desta molécula no transporte de proteínas heterólogas como VP22-p53, VP22-β galactosidase e VP22-proteína verde fluorescente. Para a indução de tolerância imunológica, tem sido demonstrado que a persistência do antígeno, pelo menos por algum período, é muito importante. Moléculas do complexo de histocompatibilidade principal (MHC) têm sido utilizadas para induzir tolerância a nível central ou periférico, em diferentes protocolos. Dentre estas, as moléculas da classe I do camundongo, Kb, têm sido utilizadas com sucesso. O objetivo desse trabalho foi de construir duas vacinas recombinantes: pVP22::Kb e pCIneo::Kb. A primeira contém dois genes clonados na mesma pauta de leitura: a cadeia pesada de classe I Kb e VP22. O cDNA que codifica para o Kb foi obtido pela extração de RNA total de baço de um camundongo C57BL/6 (haplótipo H-2b) seguido de transcrição reversa. Este produto foi amplificado pela reação em cadeia da polimerase. Esta molécula também foi obtida pela amplificação direta do gene Kb previamente clonado no sítio EcoR I do plasmídeo pBluescriptIISK (Stratagene®). Ambos os produtos de PCR foram subclonados com extremidades cegas no plasmídeo pCRBluntII (Invitrogen®). Foram obtidos dezenove plasmídeos recombinantes, denominados pCRBluntII::Kb, e um deles foi escolhido e digerido com as enzimas de restrição Spe I e Xba I e defosforilado com a enzima fosfatase alcalina (CIAP). O fragmento digerido foi clonado nos plasmídeos pVP22-myc/His (Invitrogen®) e pCIneo (Promega®) previamente digeridos com a enzima Xba I. Os novos plasmídeos pVP22::Kb e pCIneo::Kb foram utilizados para transfectar a linhagem celular eucariótica CHO. A expressão do mRNA para o Kb foi confirmada pela transcrição reversa e PCR e a expressão da proteína por imunofluorescência e citometria de fluxo.

Obtenção e avaliação da proteína BYC (Boophilus Yolk pro-Cathepsin) recombinante em uma vacina contra o carrapato Boophilus microplus

O carrapato Boophilus microplus é um ectoparasita hematófago que infesta os rebanhos bovinos de regiões tropicais e subtropicais, causando grande prejuízo à pecuária. O principal método de controle deste parasita baseia-se no uso de acaricidas, entretanto, o uso de vacinas tem sido estudado como um método de controle promissor. A Boophilus Yolk pro-Cathepsin (BYC) é uma aspártico proteinase presente no ovo do carrapato e envolvida na embriogênese que foi anteriormente testada como imunógeno vacinal. Neste estudo, o cDNA da BYC foi amplificado por PCR e clonado em dois vetores de expressão para produção de duas formas da proteína recombinante com cauda de histidina, rBYC e rBYC-Trx (fusionada com tioredoxina). As duas formas foram expressas em Escherichia coli na forma de corpúsculos de inclusão (CI) e comparadas quanto ao nível de expressão, solubilidade e rendimento na purificacão. Três agentes desnaturantes (N-lauroil sarcosina, hidrocloreto de guanidina e uréia) foram testados para solubilização dos CIs. Sarcosina foi o agente mais eficiente, solubilizando mais de 90 % de rBYC-Trx e rBYC. As duas proteínas recombinantes foram purificadas em cromatografia de afinidade por metal (Ni2+), sob condições desnaturantes. O rendimento na purificação da proteína solúvel foi de 84 % para r-BYC-Trx e 6 % para rBYC. As duas formas foram reconhecidas por soro de coelhos, camundongos e bovinos previamente imunizados com BYC nativa, demonstrando a existência de epítopos comuns entre a BYC nativa e as formas recombinantes expressas em E. coli. Para verificar o potencial vacinal da proteína recombinante, um grupo de bovinos Hereford foi imunizado com rBYC e desafiado com 20.000 larvas de B. microplus por animal. Os soros dos bovinos imunizados reconheceram a BYC nativa em ELISA e “Western blot”, com títulos entre 500 e 4.000. Os resultados do desafio mostraram uma proteção parcial contra a infestação, com 25 % de proteção global. O perfil de expressão de citocinas (IL-2, IL-4, IL-10, IFN-γ) foi verificado por RT-PCR, porém os resultados não permitiram identificar a polarização da resposta imune em Th1 ou Th2. Os resultados de imunoproteção obtidos com a BYC recombinante foram similares aos obtidos na imunização de bovinos com BYC nativa, indicando a possibilidade de uso da forma recombinante como imunógeno vacinal.