A concentração, a composição e a qualidade do plasma seminal na preservação do sêmen eqüino a +4ºC.

O presente trabalho constou de três experimentos. O primeiro objetivou verificar a influência de diferentes concentrações de plasma seminal e de dois diluentes na motilidade e na integridade e funcionalidade da membrana plasmática de espermatozóides eqüinos resfriados. Para tanto, foram utilizados 4 garanhões, comprovadamente férteis e em atividade sexual. Imediatamente após a coleta, o sêmen foi avaliado, diluído 1:2 com EDTA-glicose, dividido em oito alíquotas e centrifugado a 600g, por 10 minutos, para remoção do plasma seminal. O pellet de cada alíquota foi ressuspendido com um determinado volume do plasma seminal, previamente removido e acrescido de um determinado volume de um dos dois diluente (leite desnatado UHT ou leite desnatado-glicose) até atingir uma concentração final entre 40 e 50x106 espermatozóides/ml, contendo as seguintes concentrações finais de plasma seminal: 0%, 2,5%, 5% e 10%. Imediatamente após a diluição, o sêmen foi avaliado quanto à motilidade progressiva e total e funcionalidade e integridade da membrana plasmática. A seguir, os oito frascos contendo o sêmen, com um volume aproximado de 12 ml cada, foram resfriados em câmara a +4ºC a uma taxa de resfriamento de 0,3º C/min, sendo o sêmen novamente avaliado às 24, 48 e 72 horas.

Percoll e plasma seminal na preservação do sêmen eqüino a +4º C

O presente estudo visou verificar o efeito sobre alguns parâmetros da seleção por gradiente de Percoll® e da adição de plasma seminal do sêmen eqüino preservado a +4oC. O primeiro experimento avaliou a taxa de recuperação de espermatozóides após seleção por Percoll® em diferentes protocolos de centrifugação. Foram realizadas 5 coletas de sêmen de um garanhão. Imediatamente após a coleta, o sêmen foi avaliado quanto à motilidade, vigor e concentração. Foram retiradas duas amostras de 4 mL, diluídas em leite desnatado UHT com concentrações de 50 e 100 x 106 espermatozóides por mL cada. Cada uma destas amostras foi dividida em 4 alíquotas de 1 mL, que foram então colocadas sobre Percoll® e submetidas a diferentes tempos e velocidades de centrifugação. V1 - 200 g (5 min) + 800 g (10 min); V2 - 800 g (10 min); V3 - 800 g (15 min); V4 - 800 g (20 min). Após esse processo, o sobrenadante foi desprezado e o pellet de cada alíquota ressuspendido com 0,5 mL de leite UHT. As 8 amostras foram novamente avaliadas para concentração, motilidade e vigor. O segundo experimento estudou o efeito da adição de plasma seminal de diferentes qualidades ao sêmen eqüino selecionado por gradiente de Percoll® e resfriado a +4°C por até 72 horas. Foram utilizados 40 ejaculados de 4 garanhões, sendo dois com boa qualidade de sêmen e dois com baixa qualidade de sêmen. Imediatamente após a coleta, o sêmen foi avaliado quanto à motilidade, vigor e concentração e preparadas cinco frações de 100x106 espermatozóides, diluídas 1:1 (v/v) em EDTA-Glicose. Quatro delas, constituídas por 1mL a 2mL, foram depositadas sobre Percoll®. A fração restante foi centrifugada em tubo de vidro de 10 mL, sob as mesmas condições de tempo e velocidade das demais amostras. Foi realizada centrifugação por 5 minutos em 200 g, seguida de 10 minutos em 800 g. O sobrenadante foi descartado e o pellet ressuspendido com leite UHT desnatado compondo os seguintes tratamentos: Sp: 1,5 mL de leite UHT desnatado sem adição de plasma seminal; Hp: 1,425 mL de leite UHT desnatado acrescido de 75 L de plasma seminal homólogo; Ap: 1,425 mL de leite UHT desnatado acrescido de 75 L de plasma seminal do pool de alta qualidade; Bp: 1,425mL de leite UHT desnatado acrescido de 75 L plasma seminal do pool de baixa qualidade; Cc: foi centrifugada sem seleção por Percoll®, teve seu sobrenadante descartado e ressuspendida com 2 mL de leite UHT; C : uma amostra de sêmen diluído em leite UHT foi mantida como controle no processo de armazenamento. As amostras foram resfriadas a +4°C e examinadas a cada 24h até as 72 horas em relação à motilidade, funcionalidade de membrana (teste hiposmótico) e integridade de membrana (CFDA/PI). A seleção por gradiente descontínuo de Percoll® 90/45% mostrou-se efetiva na recuperação de espermatozóides com motilidades progressiva e total. A adição de 5% de plasma seminal ou a ausência de plasma não influenciaram os valores da motilidade das amostras selecionadas por gradiente de Percoll®. A seleção por Percoll não influenciou na percentagem de células com membrana plasmática funcional. Concentrações superiores a 2% de plasma seminal resultaram em decréscimo do número de células com membrana funcional, enquanto que as amostras sem plasma seminal apresentaram os melhores resultados e o grupo controle, que apresentava a maior percentagem de plasma, os piores. A utilização de Percoll® não separou células com alteração de membrana. A percentagem de células com membrana completamente íntegra foi significativamente maior nas amostras que sofreram processo de centrifugação, independentemente da seleção. O processo de seleção por Percoll® foi efetivo na recuperação de espermatozóides de eqüino com motilidade progressiva, mas não selecionou espermatozóides quanto à funcionalidade nem à integridade de membrana. Concentrações inferiores a 2% de plasma seminal melhoraram a funcionalidade de membrana. A ausência de plasma seminal melhorou os resultados de integridade das membranas plasmática e acrossomal; e a adição de plasma de alta qualidade não melhorou a motilidade de espermatozóides selecionados por Percoll®.

Morfologia do cromossomo Y, função gonadal e extragonadal em touros de raças sintéticas com alterações na qualidade do sêmen

O motivo deste estudo foi o percentual elevado de descarte de touros por alterações reprodutivas, precisamente qualidade de sêmen, que se apresenta em determinados sistemas produtivos nos quais estão inseridas as raças sintéticas. Através de cinco experimentos foi permitido observar o comportamento da espermatogênese de touros de raças sintéticas do nível cromossômico ao funcional do epitélio seminífero. O experimento I, avaliou por seis meses as características seminais de 12 touros, seis de uma raça pura e seis de uma sintética, contendo em cada grupo touros aptos e inaptos a reprodução classificados por qualidade de sêmen. Os animais do grupo sintético não apresentaram recuperação das características seminais durante o período de avaliação, como os puros, indicando um quadro degenerativo permanente neste conjunto de indivíduos. O experimento II buscou identificar uma relação entre a morfologia do cromossomo Y e tipos de cruzamentos, com a qualidade seminal de touros de duas raças sintéticas, Braford e Brangus-Ibagé. A relação da morfologia do Y com a condição reprodutiva não foi comprovada, no entanto considerando os tipos de cruzamentos para obtenção de touros 3/8, os cruzamentos que utilizam fêmea ¼ com macho ½ sangue filho de Nelore proporcionam um maior percentual de animais considerados inaptos ao exame de sêmen. Este experimento sugere medidas práticas para evitar o cruzamento que traz maiores prejuízos econômicos. O experimento III foi proposto para a avaliar a intensidade de redução de células espermáticas anômalas ao longo do epidídimo em touros de uma raça sintética. A redução da freqüência de gota citoplasmática proximal foi distinta entre os grupos de touros classificados quanto a morfologia espermática e entre as regiões do epidídimo, sendo portanto um indicador sensível da qualidade espermática e classificação da fertilidade potencial de animais de raças híbridas. O experimento IV avaliou a freqüência dos túbulos seminíferos nos diferentes estádios do ciclo espermatogênico em touros de duas raças sintéticas. Nas fases iniciais do ciclo espermatogênico, todos os touros apresentam gametogênese semelhante. Nas fases em que ocorrem as divisões meióticas, os touros inaptos apresentaram maior freqüência e a na fase de maturação das espermátides os touros aptos apresentaram maior freqüência. Estes resultados indicam que nos touros inaptos ocorre um bloqueio na fase das meioses, diminuindo a freqüência dos estádios de maturação das espermátides. O experimento V identificou a expressão diferencial de um fator de crescimento (transforming growth factor alpha- TGFα) no epitélio seminífero de touros Braford e Brangus-Ibagé, aptos e inaptos à reprodução, e também avaliou a freqüência de células de Sertoli nestes animais, como um estudo inicial do controle parácrino da espermatogênese. A maior freqüência da expressão de TGFα foi observada nos estádios I e III, e também na raça Brangus-Ibagé. O número médio das células de Sertoli foi semelhante entre estádios e raças dos touros. Em todos experimentos em que as raças Braford e Brangus-Ibagé foram confrontadas, os resultados obtidos foram diferentes. As maiores freqüências de alterações na qualidade seminal não podem ser extrapoladas para todas as raças sintéticas, cabendo a prerrogativa para cada raça de um estudo específico e ajustado às suas condições de criação.

Transporte espermático e resposta inflamatória na égua após a inseminação com diferentes concentrações de espermatozóides.

Normalmente, após a cobertura ou a inseminação artificial de éguas, ocorre uma endometrite aguda transitória em resposta ao sêmen e bactérias no útero. O objetivo deste estudo foi verificar se o transporte espermático e a intensidade da reação inflamatória uterina, 2h, 4h ou 24h após a inseminação com sêmen resfriado, são influenciados pela concentração espermática na dose inseminante. Para tal, foram utilizadas 192 éguas em cio, com folículo dominante ≥35 mm, sem crescimento bacteriano e livres de PMNs aos exames uterinos complementares. As éguas foram distribuídas aleatoriamente em grupos e inseminadas com 20 ml contendo 100x106 (n=30), 500x106 (n=27) ou 1000x106 (n=31) espermatozóides diluídos em solução de 3 ml de plasma seminal e 17 ml de leite desnatado, refrigerado e armazenado por 18 a 22 horas, ou infundidas com 20 ml de plasma seminal (n=33), ou com 20 ml de leite desnatado (n=38). As éguas foram abatidas duas, quatro ou 24h após as inseminações ou infusões. O grupo controle (n=33) não recebeu nenhum tratamento. Os ovidutos foram separados do útero, sendo útero e ovidutos lavados separadamente com PBS. Uma amostra do lavado de cada oviduto foi examinada para contagem de espermatozóides e uma amostra de cada lavado uterino foi utilizada para contagem de leucócitos. Após as lavagens, foi retirada uma amostra de endométrio para exame histopatológico. As éguas inseminadas e infundidas apresentaram reação inflamatória significativamente maior que as éguas do grupo controle, no decorrer das 24 horas. A reação inflamatória foi significativamente maior nas éguas inseminadas que nas infundidas. A reação inflamatória apresentou correlação com a concentração espermática (r=0,389). O número de éguas apresentando espermatozóides nos ovidutos não foi diferente nos grupos inseminados. Concluiu-se que componentes da dose inseminante provocam uma resposta inflamatória, sendo esta tanto mais severa e de resolução mais rápida, quanto maior for a concentração espermática. Por outro lado, até as quatro horas pós-inseminação, o transporte espermático independe da concentração espermática utilizada.

Avaliação de machos suínos: sensibilidade ao resfriamento e capacidade de ligação espermática a um substrato sintético

O presente trabalho constou de três estudos. No primeiro estudo, cinco ejaculados de 30 machos foram analisados conforme a manutenção da MOT a 17ºC, sendo classificados em três tipos: MOT <60% nas 72h (EI); MOT ≥60% nas 72h e <60% nas 144h (EII) e MOT ≥60% nas 144h (EIII). Doze machos foram selecionados e distribuídos em três grupos: MAIOR, MÉDIA e MENOR sensibilidade espermática ao resfriamento. Em seguida, foram coletados cinco ejaculados de cada macho, sendo a MOT avaliada a cada 24h, e a integridade da membrana espermática (IM) e de acrossomas normais (NAR) nas 24, 72, 120 e 168h. Machos menos sensíveis ao resfriamento apresentaram menor variação na MOT do período pré- para o pós-seleção. Diferenças entre os machos foram observadas desde as 24 até 168h para MOT, nas 120 e 168h para MI e nas 72 e 168h para NAR. A MOT foi mais afetada que MI e NAR durante o armazenamento do sêmen in vitro. No estudo 2 foi avaliada a possibilidade de reverter a sensibilidade espermática ao resfriamento pela troca de plasma seminal (PS) entre machos com diferente manutenção da MOT a 17ºC. Foram utilizados ejaculados de cinco cachaços selecionados e classificados como: menor (MES) e maior sensibilidade ao resfriamento (MAS). Foram utilizados seis tratamentos, com cinco repetições cada. Nos tratamentos T1 e T3, o sêmen dos machos MES e MAS, respectivamente, foram processados de acordo com o protocolo convencional. Foi efetuada centrifugação (800g por 10 min) e adição do PS (10mL) homólogo para os espermatozóides MES e MAS, respectivamente, nos T2 e T4. Após a centrifugação, foi realizada a troca do PS, sendo que espermatozóides dos machos MES foram expostos ao PS dos machos MAS (T5) e o PS dos machos MES foi adicionado aos espermatozóides dos machos MAS (T6). A MOT foi avaliada a cada 24h, durante sete dias de conservação. NAR e de IM foram avaliados nas 24, 72, 120 e 168h. Diferenças na MOT, entre os machos MES (T1) e MAS (T3), foram observadas após armazenamento de 48h. Não foram observadas alterações em MOT e IM, quando foi efetuada a troca de PS entre os machos MES e MAS. Não foi possível reverter a maior sensibilidade ao resfriamento de espermatozóides suínos, após a ejaculação, com a adição de 10% do PS de machos com sêmen de menor sensibilidade. No terceiro estudo, foi avaliada a fertilidade de sêmen suíno pelo teste de ligação de espermatozóides a um substrato sintético. A MOT e o percentual de espermatozóides ligados (PEL) foram avaliados nas 5, 24, 48 e 72 horas de armazenamento a 17ºC. O PEL foi determinado em soluções contendo 6,25 ou 12,5 milhões de espermatozóides/mL, com ou sem albumina sérica bovina (BSA), preparadas a partir de dois a cinco ejaculados de cada um dos quatro machos. Houve correlação positiva (r=0,33) entre a MOT e o PEL. Os machos diferem quanto à capacidade de ligação de seus espermatozóides ao substrato sintético, a partir de 24 horas de armazenamento do sêmen. Maior percentual de espermatozóides ligados ao substrato sintético é verificado com a inclusão de BSA e com o aumento da concentração espermática.

Valores hematológicos e bioquímicos séricos, efeitos de doses sub-letais da cipermetrina e características físico-químicas do sêmen do Jundiá Rhamdia quelen

Este trabalho teve três objetivos principais: a) Estabelecer valores de referência para os parâmetros bioquímicos e hematológicos do jundiá cultivado em açude; b) Determinar a CL50 da cipermetrina ao jundiá, bem como verificar o efeito nos parâmetros sangüíneos; c) Determinar as características físicas e químicas do sêmen do jundiá. Os animais foram obtidos de açudes de um Produtor de Peixes em Rolante, RS e conduzidos ao Laboratório do ICBS, UFRGS, onde permaneceram em tanques de 500l. O sangue era obtido por punção do vaso caudal através de seringa descartável, transferidos a tubos com e sem EDTA 10%, e os testes bioquímicos e hematológicos realizados no HCPA. Para a avaliação da CL50 da cipermetrina no jundiá grupos (n ≥10) de animais foram tratados com a exposição a 8 diferentes concentrações de cipermetrina (ppm) (0:controle; 0,08; 0.1; 0,12; 0,16; 0,2; 0,24; 0,36). Os peixes foram observados após 24, 48, 72 e 96h do início do tratamento para avaliar o percentual de mortalidade. No estudo do estresse metabólico, grupos (n ≥6) receberam os tratamentos: ausência de exposição ao pesticida (controle) e duas doses (0.08 e 0.12 ppm) de cipermetrina. Foram feitas coletas de sangue antes, após 2, 4 e 8 dias da aplicação do pesticida para análise no HCPA. Para o estudo do sêmen, este foi obtido em diferentes períodos durante as 4 estações. A densidade espermática foi medida pela técnica do espermatócrito e pela contagem microscópica. A duração da motilidade espermática foi observada num microscópio, usando para interpretação uma escala arbitrária variando de 0 a 5. Parte do sêmen foi centrifugado para a obtenção do fluido seminal, o qual foi imediatamente congelado a –200C até análise no HCPA Com a concentração 0,12 ppm as variações bioquímicas foram incrementadas e já se observaram alterações nos movimentos e no equilíbrio. Em estações de aqüicultura, produtores podem realizar avaliação periódica em uma pequena população de seus peixes, quantificando o grau de estresse metabólico. Esses indicadores de estresse podem ser precocemente detectados apesar da aparência exterior e comportamentos normais dos peixes. A técnica para a medida da densidade espermática através do espermatócrito apresentou correlação com a contagem celular por microscópio, com a vantagem de ser mais simples, rápida e econômica. As características que foram encontradas no sêmen parecem ser bons indicadores da qualidade espermática e podem auxiliar na seleção de machos doadores de gametas de alta qualidade em sistemas de cultivo deste peixe.

Análises morfológicas e moleculares dos gêneros Galium L.e Relbunium (Endl.)Hook.f. (RUbieae-Rubiaceae)no estado do Rio Grande do Sul-Brasil

Desde o início da história taxonômica de Relbunium, muitos foram os trabalhos que enfatizaram sua autonomia e posição taxonômica. Atualmente, alguns estudos sugerem que as espécies pertencentes a Relbunium devam ser incluídas em uma seção do gênero Galium. Porém, recentes estudos moleculares na tribo Rubieae, destacam Galium como um grupo parafilético, e Relbunium como um gênero independente e monofilético. O problema taxonômico referente a Galium e Relbunium é de difícil solução, devido à ausência de estudos que integrem caracteres morfológicos, ecológicos e moleculares. No presente trabalho objetivou-se adicionar informações para o conhecimento básico das espécies de Relbunium e Galium para o sul do Brasil, a partir de caracteres morfológicos e moleculares, buscando responder a seguinte questão: “Relbunium pode ser considerado um gênero ou apenas uma seção dentro de Galium?”. Para atingir os objetivos, foi analisada a morfologia das espécies, com ênfase nas folhas, flores e frutos para duas espécies de Galium e treze de Relbunium: G. latoramosum, G. uruguayense, R. equisetoides, R. gracillimum, R. hirtum, R. humile, R. humilioides, R. hypocarpium, R. longipedunculatum, R. mazocarpum, R. megapotamicum, R. nigro-ramosum, R. ostenianum, R. richardianum e R. valantioides. Chaves de identificação foram geradas a partir dos resultados das análises morfológicas. As folhas foram analisadas quanto à forma, ápice, padrão de venação, tricomas, estômatos, distribuição de idioblastos secretores e vascularização do hidatódio. Esses caracteres não evidenciaram a separação entre os gêneros, auxiliando apenas na individualização das espécies. A morfologia das flores e frutos auxiliou na diferenciação dos gêneros e espécies estudadas. As flores são comumente bispóricas, a exceção de G. latoramosum. Brácteas involucrais, ausentes em Galium, estão presentes nas espécies de Relbunium, de duas a quatro; nesse gênero há presença de antopódio, ausente em Galium. A corola possui tricomas glandulares unicelulares na face adaxial, e na face abaxial os tricomas, quando presentes, são simples e idioblastos secretores estão presentes apenas em R. gracillimum. O androceu tem quatro estames alternipétalos e exsertos, com anteras dorsifixas e tetrasporangiadas, de deiscência longitudinal. O ovário é ínfero, bicarpelar, bilocular, com um rudimento seminal anátropo e unitegumentado por lóculo. O desenvolvimento dos frutos, a estrutura do pericarpo e da testa foram descritos. Os frutos são do tipo baga, em R. gracillimum e R. hypocarpium, ou esquizocarpo, nas demais espécies. A consistência do pericarpo pode variar de carnosa, nos frutos do tipo baga, a levemente seca, nos frutos esquizocarpos. Entre as espécies, observou-se uma variação com relação ao exocarpo, que pode ser liso, piloso ou com idioblastos secretores. A testa é constituída por apenas uma camada de células, que em R. hypocarpium mostra-se descontínua. Além das descrições morfológicas, foram realizados estudos moleculares das espécies, através do seqüenciamento de fragmentos do DNA nuclear (ITS) e plastidial (trnL-F). A partir dos resultados obtidos formam elaborados cladogramas com base nos dados morfológicos e moleculares. O cladograma construído a partir dos dados morfológicos (vegetativos e reprodutivos) evidenciou a distinção dos dois gêneros, ou seja, sustenta Relbunium como táxon independente. Nesse cladograma observa-se que a VI presença ou ausência de brácteas foi determinante, e proporcionou a separação dos gêneros. A uniformidade dos caracteres morfológicos vegetativos entre as espécies auxiliou apenas na distinção das espécies de Relbunium. Com relação aos dados moleculares, os fragmentos de DNA utilizados mostraram-se pouco informativos. A análise do fragmento ITS, em especial, contribuiu para confirmação da relação entre algumas espécies (R. hirtum e R. ostenianum, e R. humile e R. mazocarpum). A análise combinada dos dados morfológicos e moleculares não caracterizou Relbunium como um clado monofilético, sendo sua manutenção não sustentada, isso, principalmente, devido à falta de diferenças moleculares entre as espécies. Conclui-se que para o grupo em questão as análises morfológicas, das folhas, flores e frutos, foram suficientes para destacar Relbunium como um gênero autônomo e monofilético na tribo Rubieae.