Expressão gênica de bcl2, receptor de estradiol e receptores de progesterona A e B em endométrio eutópico e ectópico de pacientes inférteis sem e com endometriose

A endometriose caracteriza-se pela presença de tecido endometriótico – glândulas e estroma – fora da cavidade uterina. A doença acomete superfícies peritoniais da pélvis, ovários e septo rectovaginal, sendo mais comum a endometriose pélvica. Embora os dados sobre a prevalência exata de endometriose sejam incertos, as evidências indicam uma prevalência em torno de 5 a 10% das mulheres em idade reprodutiva. Dor, dismenorréia, dispareunia e infertilidade são sintomas freqüentes da doença. Além de apresentar dependência aos hormônios sexuais, a endometriose está associada a um conjunto de desordens de diferentes etiologias, sendo considerada uma doença multifatorial de caráter genético e imune. Neste sentido, a carência de respostas imunológicas adequadas, aliada a um provável desequilíbrio entre os processos de proliferação e apoptose celular, pode ter um papel importante na instalação e manutenção das lesões endometrióticas. O objetivo deste trabalho foi caracterizar a expressão de genes relacionados aos processos de proliferação e diferenciação celular em implantes endometrióticos e endométrio eutópico de mulheres inférteis sem e com endometriose, através da análise semiquantitativa por RT-PCR. Foram estudadas 34 pacientes consultando por infertilidade e submetidas à laparoscopia diagnóstica. Quinze pacientes (31,7 ± 1,5 anos) apresentavam endometriose e 19 (32,9 ± 0,9 anos) foram consideradas controles inférteis sem endometriose. Os dois grupos apresentaram IMC e SHBG similares. As biópsias de endométrio foram realizadas, em fase folicular, nas pacientes do grupo controle (C) e nas pacientes com endometriose (endométrio eutópico (EUT) e ectópico (ECT)). A presença do mRNA para os receptores de estrogênio e progesterona detectada nos 3 grupos estudados, sustenta a existência de sensibilidade tecidual local aos hormônios sexuais. Nas condições experimentais do presente estudo não foi observada diferença estatística na expressão gênica de bcl2 entre os grupos. A expressão do gene do ER endometrial também foi similar entre os grupos controle, eutópico e ectópico. Contudo, o endométrio ectópico apresentou níveis de mRNA mais elevados para PR-A (0,84  0,02 UA) em relação aos grupos controle e eutópico (0,60  0,04 UA e 0,63  0,04 UA; p < 0,05). A expressão gênica do PR-B não foi estatisticamente diferente entre os grupos do presente trabalho. Porém, houve forte correlação negativa entre a expressão dos genes bcl2 e PR-B nas amostras de endométrio sem e com endometriose (r = - 0,795 e p = 0,018), sugerindo que um papel anti-proliferativo do PR-B possa ser operativo neste modelo de estudo.

O polimorfismo T102C do receptor serotonérgico 5-HT2A participa na manutenção do tabagismo e dos mecanismos de preferência alimentar

A serotonina tem sido relacionada aos comportamentos apetitivo, emocional, motor, cognitivo e autonômico. Os neurônios serotonérgicos estão localizados nos núcleos da rafe, projetam-se para todas as regiões do sistema nervoso central e atuam através de sete tipos de receptores diferentes (5-HT1-7). Os receptores do tipo 2 são categorizados em 3 sub-tipos (A, B e C). Os receptores 5-HT2A são receptores pós sinápticos que promovem a ativação da fosfolipase C, responsável pela hidrólise de fosfolipídios da membrana neuronal, dando origem aos segundos mensageiros diacilglicerol e trifosfato de inositol. O gene do receptor 5-HT2A apresenta alguns polimorfismos, entre os quais o T102C, onde na posição 102 pode estar ou uma timina (T) ou uma citosina (C). Este polimorfismo, apesar de não determinar uma alteração na seqüência de amionoácidos que compõem o receptor determina sua expressão em quantidade diferente. Nesta tese, o polimorfismo T102C do gene do receptor 5-HT2A foi empregado como uma ferramenta para o estudo da neuroquímica do tabagismo e do comportamento alimentar. No estudo acerca do tabagismo, um grupo de 625 sujeitos foi genotipado e classificado de acordo com seu comportamento em relação ao fumo (fumantes atuais, exfumantes ou não fumantes). Foram encontradas diferenças na distribuição dos genótipos quando fumantes atuais foram comparados com ex-fumantes e não fumantes, sugerindo que o polimorfismo T102C está associado com a manutenção, e não o início, do hábito de fumar. O genótipo CC era mais freqüente nos fumantes atuais do que nos ex-fumantes e não fumantes. No estudo sobre o comportamento alimentar, um grupo de 240 sujeitos idosos foi genotipado e sua dieta espontânea foi avaliada tanto quanto ao conteúdo de macro quanto de micro-nutrientes. Foram encontradas diferenças na dieta relacionadas ao polimorfismo T102C. Os indivíduos TT comem uma maior quantidade e proporção de proteínas, apesar de não alterar a quantidade de calorias ingeridas. Eles ingerem mais carne vermelha todos os aminoácidos essenciais. Concluindo, através de um instrumento da genética molecular que identifica sujeitos com suscetibilidade para terem uma menor ou maior quantidade de receptores 5-HT2A, para o qual não há agonistas específicos, é possível sugerir o provável envolvimento deste receptor tanto nos mecanismos de manutenção da adição ao tabaco quanto nos de preferência alimentar.

Efeitos do estresse hipo e hiperosmótico sobre as características do receptor à insulina e sobre a captação de glicose em branquias do caranguejo Chasmagnathus granulata

Neste trabalho investigou-se as características do receptor à insulina e a capacidade de captação de glicose nas brânquias do caranguejo Chasmagnathus granulata aclimatado a diferentes tempos (24, 72 e 144 horas) de estresse hiper e hiposmótico. Primeiramente, o cDNA do receptor para insulina foi parcialmente clonado e seqüenciado em brânquias posteriores de Chasmagnathus granulata. A seqüência peptídica mostrou a presença de 39 aminoácidos e foi designada CGIRLTK (C. granulata insulina receptor-like tyrosine kinase). Esta seqüência apresentou significativa homologia com o domínio tirosina quinase da subunidade b dos receptores para insulina de mamíferos (69%) e de Drosophila (74%). Sítios de ligação à insulina foram caracterizados nas membranas plasmáticas das brânquias através do estudo de ligação com 125I-insulina. A atividade tirosina quinase foi determinada pela capacidade do CGIRLTK de fosforilar o substrato sintético poly (Glu; Tyr 4:1). A captação de glicose foi avaliada pela captação de [14C] 2-deoxi-D-glicose pelo tecido branquial. Nas brânquias posteriores a insulina bovina estimulou significativamente a fosforilação do CGIRLTK nos animais aclimatados a 20‰ de salinidade (controle), já nas brânquias anteriores este estímulo não foi observado. O estresse hiperosmótico (34 ‰ de salinidade) levou a uma diminuição do número e da afinidade dos receptores à insulina nas brânquias posteriores, bem como a uma redução na atividade tirosina quinase. A captação de glicose não mudou durante os tempos de estresse osmótico estudados Esses resultados mostram que o estresse hiperosmótico modifica a sinalização da insulina, causando um estado de resistência à insulina nas brânquias posteriores. Nenhuma mudança foi observada na concentração dos receptores à insulina nas brânquias posteriores de caranguejos aclimatados durante 24 horas ao estresse hiposmótico (0‰). Contudo, foi observada uma redução na afinidade dos receptores pela insulina bovina. A fosforilação do CGIRLTK diminui às 24 horas de estresse e retornou aos valores basais às 144horas. A captação de glicose não foi alterada significativamente. Os resultados sugerem que o estresse hiposmótico modifica as características do CGIRLTK nas brânquias posteriores de C. granulata de forma tempo-dependente. Essas mudanças são parte dos ajustes necessários à sobrevivência à baixa salinidade. Nas brânquias anteriores, durante aclimatação ao estresse hiperosmótico, foi observada redução da concentração e da capacidade de fosforilação dos receptores insulínicos. Contudo, a insulina bovina não estimulou a fosforilação nas brânquias anteriores durante o estresse Nenhuma alteração foi observada na concentração e na afinidade de receptores à insulina nas brânquias anteriores após 24 horas de estresse hiposmótico. A fosforilação do receptor à insulina diminuiu após 24 horas de estresse e voltou aos valores basais após 72 horas. A capacidade de captação de glicose, por sua vez, não foi modificada em função de mudanças na osmoliridade do ambiente. Assim como no estresse hiperosmótico, a insulina bovina não estimulou a fosforilação nas brânquias anteriores no estresse hiposmótico. Os resultados deste trabalho demonstram que o estresse osmótico modifica as características do CGILRTK e conseqüentemente a transdução do sinal insulínico nas brânquias. As respostas às alterações de salinidade dependem do tipo de estresse ao qual o animal é submetido e da brânquia estudada (anterior ou posterior). As mudanças observadas no sinal insulínico fazem parte dos ajustes necessários para a regulação osmótica frente às mudanças ambientais de salinidade.

Efeito das prostaglandinas ciclopentenônicas sobre a expressão gênica do fator nuclear PPAR-γ, do receptor de scavenger CD36 e proteínas de apoptose em macrófagos : implicações para a fisiopatologia da aterosclerose

Considerando que as doenças cardiovasculares representam a maior causa de mortalidade e morbidade em países ocidentais, a aterosclerose se destaca pelo fato de predispor os pacientes ao infarto do miocárdio, a acidentes vasculares cerebrais e a doenças vasculares periféricas. Neste contexto, a oxidação de lipoproteínas do plasma, particularmente LDL, é um dos fatores de risco para eventos cardiovasculares, pois é reconhecida e internalizada por macrófagos, ocasionando a sua diferenciação em foam cells. Diversos fatores participam deste processo de diferenciação, como a expressão de receptores de scavenger CD 36, proporcionando aumento na captação de LDL oxidada, aumento na síntese endógena de colesterol e ativação de fatores nucleares que iniciam a transcrição de proteínas específicas e fatores de crescimento que disparam a aterogênese. Os fenômenos celulares relacionados à apoptose também são de especial importância, tanto no desenvolvimento da lesão aterosclerótica como na estabilidade da placa e formação de trombos. As prostaglandinas (PGs) ciclopentenônicas (CP-PGs), em particular a PGA2 e a 15-desóxi-∆12,14-PGJ2 são uma classe especial de PGs que, em diminutas concentrações, disparam a expressão das proteínas de choque térmico (hsp), que são citoprotetoras. Além disso, CP-PGs bloqueiam a ativação do fator nuclear pró-inflamatório NF-κB tornando-as potentes agentes antiinflamatórios. Embora as PGs das famílias A e J guardem uma série de características em comum, a 15-desóxi-∆12,14- PGJ2 é o ligante fisiológico do fator nuclear pró-aterogênico PPAR-γ, enquanto as PGs da família A ativam apenas a via citoprotetora das hsp. Este trabalho teve como objetivo avaliar os efeitos das CP-PGs sobre a expressão gênica de fatores relacionados à diferenciação de macrófagos em foam cells, bem como proteínas reguladoras do processo de apoptose, em células da linhagem pró-monocítica humana U937. Para tal, as células foram tratadas com CPPGs em presença e/ou ausência de LDL nat e LDL ox, o RNA foi extraído para a realização de RT-PCR para PPAR-γ, CD 36, HMG-CoA redutase e proteínas de apoptose Caspase 3, p53 e Bcl-xL. O tratamento estatístico utilizado foi análise de variância (ANOVA one-way) e teste “t” de student, com resultados expressos como médias + desvios-padrão da média, com P<0,05. Os resultados obtidos demontraram que as CP-PGs PGA2 (20µM-24h) e PGJ2 (1,5µM-24h) inibiram a expressão gênica do fator nuclear PPAR- γ (64 % (PGA2), 88 % (15- d-PGJ2)) nas células U937, em presença de LDL oxidada, quando comparado ao controle. PGA2 inibiu a expressão de HMG-CoA redutase (33 %), enzima chave da síntese de colesterol intracelular, e o tratamento com as CP-PGs também inibiu a apoptose nas células tratadas em presença de LDL oxidada. Os dados sugerem que as CP-PGs apresentam grande potencial para o tratamento da aterosclerose, já que, além de apresentarem efeito antiinflamatório, inibem a expressão do fator nuclear pró-aterogênico PPAR-γ, do receptor de scavenger CD36 (apenas a 15-desóxi-∆12,14-PGJ2) e da enzima HMG-CoA redutase. O bloqueio da apoptose nas células estudadas pode estar relacionado à citoproteção oferecida por estas PGs. Embora investigações in vivo deste laboratório tenham mostrado a eficácia do tratamento com CP-PGs em camundongos portadores de aterosclerose, estudos adicionais são necessários para esclarecer-se o efeito antiaterogênico das mesmas.

Papel pró-inflamatório do receptor CD40 em ilhotas pancreáticas

O transplante de ilhotas humanas, utilizado como reposição das células produtoras de insulina em pacientes portadores de diabetes mellitus tipo 1, está se tornando uma importante prática clínica. Entretanto, eventos inflamatórios não específicos presente nas ilhotas, são responsáveis pela vulnerabilidade das mesmas, e contribuem à diminuição do número celular durante o processo de isolamento e posterior transplante. CD40 é um membro da família do receptor de necrose tumoral, descrito em uma variedade de células. Em condições fisiológicas, o CD40 presente nas células apresentadoras de antígenos participa como molécula co-estimulatória na ativação dos linfócitos T. Porém, o CD40 também foi descrito em condições patológicas, como psoríase, aterosclerose e fibrose cística, onde sua expressão está envolvida em eventos crônicos inflamatórios. É interessante ressaltar que, o CD40 também tem sido descrito em neurônios, células que apresentam uma variedade de moléculas similares às expressas nas células M pancreáticas. Em vista desses achados, tentou-se determinar se a células M também poderiam expressar o receptor de CD40, e se presente, determinar possíveis conseqüências próinflamatórias após a sua ativação. Utilizaram-se diversas técnicas como RT-PCR, western blot, citometria de fluxo, imuno-histoquímica assim como imunofluorescência, para detectar a expressão de CD40 em ilhotas de camundongo, macaco e humano, e também na linhagem de células M NIT-1. Determinaram-se as vias de transdução de sinais de CD40 por western blot e ensaios com gene repórter. Foi determinada por tecnologia luminex, a secreção de citocinas e quimiocinas dependente de CD40 em ilhotas humanas, estimuladascom a proteína recombinante CD40L e em alguns casos confirmada por RT-PCR e imunofluorescência. Os resultados demonstram a expressão de CD40 nas células M, que pode ser aumentada pela ação de citocinas pró-inflamatórias, cuja ativação induz a secreção de mais citocinas e quimiocinas (IL-6, IL-8, MCP-1 e MIP-1M) dependentes das vias de transdução de sinais Raf/MEK/ERK e NF-VB. A interação CD40-CD40L aumentou a expressão de ICAM-1 e a induziu morte celular nas células M pancreáticas. Nesse sentido, a ativação de CD40 induz a secreção de mediadores solúveis próinflamatórios que podem comprometer a viabilidade das células M. O cenário próinflamatório sustentando pela ação de CD40 sugere que o mesmo poderia ter um papel ativo orquestrando um processo inflamatório