Caracterização parcial de um fragmento e detecção por RT-PCR de Rice Stripe Necrosis Virus

O enrolamento do arroz é uma doença viral emergente no Brasil causada pelo Rice stripe necrosis virus (RSNV) que é transmitido pelo protozoário Polymyxa graminis. RSNV é um membro do gênero Benyvirus com genoma dividido em 4 RNAs de fita simples no sentido positivo (ssRNA +). Em função da falta de conhecimento sobre a seqüência de nucleotídeos do seu genoma, a detecção de RSNV através de métodos moleculares não é utilizada. O objetivo deste trabalho foi identificar seqüências do genoma de RSNV que possibilitassem sua detecção em plantas de arroz através da técnica de transcrição reversa seguida da reação em cadeia da polimerase (RT-PCR). As seqüências do genoma foram identificadas a partir de clones de uma biblioteca de cDNAs obtidos de uma amostra do vírus parcialmente purificado. Os clones que hibridizaram com sondas sintetizadas a partir de RNA de plantas infectadas com RSNV foram seqüenciados e comparados às seqüências do GenBank. Um fragmento de 957 nt da extremidade 3’ da fita de um dos 4 RNAs genômicos de RSNV foi obtido. A análise da seqüência nucleotídeos desse fragmento não revelou qualquer similaridade com seqüências conhecidas, tampouco indicou uma possível função. Um par de oligonucleotídeos iniciadores foi desenhado a partir de um clone que potencialmente contém uma seqüência de RSNV. A especificidade e a sensibilidade da RT-PCR utilizando esse par de oligonucleotídeos iniciadores, bem como sua eficiência na detecção do vírus em diferentes partes da planta de arroz, foram avaliadas. Os resultados indicam que a RT-PCR é específica para RSNV e pode detectar o vírus em tecido oriundo das raízes, do colo e de folhas com distorção. Comparada ao diagnóstico da doença através da observação de sintomas e de estruturas do vetor, a RT-PCR é uma ferramenta confiável para a diagnose do enrolamento do arroz.

Caracterização da mutagênese por inserção do retrotransposon Tos17 em genótipos de arroz

O aumento do potencial produtivo da cultura de arroz via melhoramento genético está principalmente relacionado ao rendimento, a qualidade de grãos e a obtenção de plantas resistentes a doenças e pragas. Neste caso, deve ser explorada a variabilidade genética natural ou induzida através de agentes mutagênicos físicos, químicos ou biológicos. A vantagem do uso de mutagênicos biológicos, como os transposons e os retrotransposons, é que ao serem inseridos podem interrompem um gene causando uma mutação. Esta retrotransposição deixa uma marca que possibilita a identificação molecular do local de inserção. No presente trabalho, foi utilizada a estratégia de mutagênese insercional através de eventos de transposição do retrotransposon Tos17, induzido por cultura in vitro. A análise de diferentes genótipos de arroz é muito importante para avaliar se a transposição ocorre de forma similar em genótipos distintos. Foram avaliados calos embriogênicos de cultivares que têm um histórico de variabilidade genética em homozigose, linhagens obtidas através de cruzamentos com espécies silvestres e ecótipos de arroz vermelho, submetidos a 6 meses de cultura in vitro. O método escolhido para avaliar o número de cópias de Tos17 em calos embriogênicos foi a quantificação relativa por PCR em tempo real. A identificação dos genes mutados pela inserção do retrotransposon foi feita através do isolamento e amplificação das seqüências que flanqueiam os insertos de Tos17. O resultado deste experimento indica um aumento no número de cópias de Tos17 em 8 dos 21 genótipos avaliados. O seqüenciamento dos fragmentos de DNA que flanqueiam os insertos do retrotransposon Tos17, indicaram alta similaridade com seqüências genômicas não codificantes de arroz.