Alterações endócrinas do eixo hipotálamo-hipófise-gônadas em ratas manipuladas no período neonatal

A manipulação no período neonatal tem sido utilizada há algumas décadas como modelo experimental para analisar os mecanismos pelos quais variações precoces no ambiente do animal afetam o desenvolvimento de sistemas neurais, dando origem a alterações comportamentais e neuroendócrinas estáveis na vida adulta. Nos ratos, a manipulação neonatal consiste do manuseio suave dos filhotes nos primeiros dias de vida em geral, durante as duas semanas após o parto. Quando adultos, os animais submetidos a essa manipulação apresentam uma menor secreção de glicocorticóides pela adrenal quando expostos a estímulos estressores, e um retorno mais rápido à concentração plasmática basal quando comparados aos ratos não manipulados. Trabalhos prévios demonstram que além de alterar o eixo hipotálamo-hipófise-adrenal, a manipulação pode alterar o eixo hipotálamo-hipófise-gônadas, ratas manipuladas apresentam ciclos anovulatórios e uma diminuição do comportamento sexual. Com isso, o nosso objetivo nesse trabalho foi analisar o perfil de secreção de estradiol e progesterona em ratas manipuladas no período neonatal nas quatro fases do ciclo estral, como também, verificar o efeito da manipulação sobre as concentrações plasmáticas de LH e FSH em ratas ovariectomizadas e com reposição hormonal No experimento I foram estudados dois grupos de ratas adultas: não manipuladas (fêmeas que nos 10 primeiros dias de vida não foram tocadas pelo experimentador ou tratador); e manipuladas (ratas que nos 10 primeiros dias pós-parto foram diariamente manipuladas pelo experimentador por 1 minuto, retornando para a mãe logo em seguida). Quando adultas, o ciclo estral das ratas foi controlado, e aquelas com 3 a 4 ciclos regulares seguidos tiveram a veia jugular externa canulada em cada uma das fases do ciclo estral (metaestro, diestro, estro e proestro). No dia seguinte ao da cirurgia às 8 horas da manhã, iniciaram-se as coletas de sangue (800µL) de 3 em 3 horas. O sangue foi centrifugado, o plasma coletado e destinado ao radioimunoensaio para estradiol e progesterona. As ratas cujo sangue foi coletado no proestro tiveram o número de óvulos contados na manhã seguinte. No experimento II, as ratas manipuladas e não manipuladas foram ovariectomizadas e 3 semanas após receberam injeções subcutâneas de estradiol por 3 dias consecutivos às 9 horas da manhã, no quarto dia receberam progesterona às 10 horas e às 11 horas tiveram a veia jugular canulada Neste mesmo dia às 13 horas, iniciaram-se as coletas de sangue (600µL) que foram realizadas de hora em hora, até às 18 horas. O sangue foi centrifugado o plasma coletado e destinado ao radioimunoensaio para LH e FSH. Os resultados mostraram que as ratas manipuladas no período neonatal apresentam uma redução nas concentrações plasmáticas de estradiol no proestro e de progesterona no metaestro e no estro comparadas às não manipuladas. O número de óvulos encontrados na manhã do estro está reduzido nas ratas manipuladas quando comparado às não manipuladas, confirmando resultados prévios. A alteração destes esteróides gonadais pode explicar a redução do número de óvulos das fêmeas manipuladas. As concentrações plasmáticas de LH e de FSH não são diferentes entre os dois grupos, indicando que a responsividade do eixo hipotálamo-hipófise parece não ser alterada pela manipulação, no entanto é necessário realizar mais experimentos para que afirmações possam ser feitas a respeito da responsividade do eixo.

Maturação e fecundação "in vitro" de ovócitos de caninos domésticos (Canis familiaris)

Este estudo foi realizado com o objetivo de 1) determinar a eficácia de duas temperaturas (370 C e 390 C) e três intervalos de tempo (48, 72 e 96h) comumente usados na maturação in vitro (MIV) de ovócitos caninos, 2) verificar o efeito de hormônios heterólogos: hormônio folículo estimulante (FSH) 0,5µg/ml, estradiol 20µg/ml e somatotropina humana (hST) 1µg/ml; e o efeito de proteínas: 0,4 % albumina sérica bovina (BSA), 10 % de soro de vaca em estro inativado (SVE), e 10 % soro de cadela em estro inativado (SCE) na maturação nuclear de ovócitos caninos, 3) observar a influência da condição reprodutiva das doadoras de ovários (folicular, diestro, anestro, piometra, e prenhez) sobre os índices de maturação in vitro ovocitária, 4) verificar a habilidade para fecundação in vitro de ovócitos coletados de fêmeas em diferentes estágios do ciclo estral, previamente maturados in vitro e adicionalmente, examinar sua capacidade de desenvolvimento embrionário in vitro. O meio de maturação usado nos experimentos foi TCM-199 suplementado com 25 mM Hepes/l (v/v) com 10 % de soro de vaca em estro inativado (SVE), 50 µg/ml de gentamicina, 2,2 mg/ml de bicarbonato de sódio, 22 µg/ml de ácido pirúvico, 1 µg/ml de estradiol, 0,5 µg/ml de FSH e 0,03 UI/ml de hCG. O meio de maturação era modificado de acordo com a proposta experimental apresentada. Os resultados do primeiro experimento não mostraram diferença estatística no índice de meiose de ovócitos maturados à 37oC ou à 39oC em quaisquer dos intervalos testados (48, 72, 96 horas), embora a proporção de ovócitos que alcançaram metáfase II a 37oC após 72 horas da maturação in vitro, mostrasse uma tendência estatística à significância (p = 0,064), quando comparada àquela dos ovócitos maturados à 39oC. Foi concluído que temperaturas de 37oC e 39oC são similares para maturação in vitro de ovócitos de cadelas. No segundo experimento deste estudo, os índices mais elevados (p < 0,05) de retomada da meiose após 72 horas de maturação in vitro foram obtidos, quando TCM 199 era suplementado com 0,4 % de BSA. Uma influência positiva sobre a aquisição de metáfase II (MII) foi observada com a suplementação de 1µg/ml de hST no meio de maturação. Ao contrário, ovócitos maturados em TCM 199 com 10 % de soro de cadela em estro não se desenvolveram até o estádio de MII. Os resultados deste experimento mostraram que a suplementação de proteínas e de hormônios ao TCM-199 não facilitam as etapas finais da maturação in vitro de ovócitos de cadelas.No terceiro experimento, os resultados de maturação dos ovócitos não mostraram diferença estatística na progressão do material nuclear até o estádio de MII entre os ovócitos provenientes de cadelas em várias condições reprodutivas (fase folicular: 5,4 %; diestro: 4,2 %; anestro: 4,4 %; piometra: 8,1 % e prenhez: 4,7 %). A retomada da meiose mostrou índices de 24,6 % na fase folicular, 19,6 % no diestro, 16,4 % no anestro, 37,1 % na piometra e 29,2 % na prenhez. Índices positivos e mais elevados de resíduo acima do valor esperado foram observados para as condições de piometra e de prenhez nos estádios de metáfase/anáfase I (MI/AI). Nossos resultados indicam que a maturação nuclear in vitro de ovócitos caninos não é influenciada pela condição reprodutiva in vivo da fêmea no momento da coleta ovariana. No experimento de fecundação in vitro (FIV), 888 ovócitos selecionados através de sua qualidade morfológica superior foram distribuídos em 3 grupos de acordo com o estágio do ciclo estral da doadora em: a) folicular, b) anestro, c) luteal . Após período de 48 horas de maturação a 37oC em TCM 199 suplementado com 25 mM Hepes/l (v/v), com 10 % soro de vaca em estro inativado (SVE), 50 µg/ml de gentamicina, 2,2 mg/ml de bicarbonato de sódio, 22 µg/ml de ácido pirúvico, 20 µg/ml de estradiol, 0,5 µg/ml de FSH, 0,03 UI/ml hCG e 1 µg/ml de hST, os ovócitos eram fecundados in vitro (2x106 espermatozóides/ml) por um período de 24 horas. A percentagem de ovócitos nucleados desenvolvendo-se em embriões foi de 10,1 % (27/ 267). O índice de clivagem (2-8 células) após cinco dias da FIV foi similar nas fases reprodutivas (folicular, anestro, e luteal). Contudo, o índice geral de fecundação foi superior nos ovócitos oriundos de cadelas nos estágios folicular (42,4 %) e anestro do ciclo (34,3 %) comparativamente àqueles provenientes da fase luteal (18,6 %) (p < 0,001). Além disso, foi verificada influência da fase folicular sobre o desenvolvimento de pronúcleos, com os índices nesta fase (24,2 %) sendo estatisticamente diferentes daqueles observados no anestro e na fase luteal (9,6 % e 3,7 %, respectivamente) (p < 0,004). Não foi estabelecida correlação entre a proporção de espermatozóides capacitados ou com reação acrossômica e formação pronuclear e/ou percentagem de clivagem. Em resumo, conclui-se que: a) ovócitos caninos podem ser maturados in vitro de forma similar às temperaturas de 39oC e 37o. b) a adição de hormônios (FSH, estradiol, hST) e proteínas (BSA, SVE, SCE) ao meio TCM 199 não eleva os índices de maturação nuclear até o estádio de MII de ovócitos caninos maturados in vitro. c) em cães, a seleção de ovócitos com base na coleta dentro de um estágio específico do ciclo estral não deve ser usada para prever índices de meiose ou habilidade para desenvolvimento embrionário in vitro. d) ovócitos caninos maturados, fecundados e cultivados in vitro podem se desenvolver a zigotos com até 8 células.

Produção in vitro de embriões bovinos utilizando diferentes condições de maturação oocitária

O experimento avaliou o uso do meio TCM-199 suplementado com: SVE, SEE e SFB (meio indefinido); BSA (meio semi-definido) e PVA (meio definido); na presença ou ausência de hormônios (FSH e hCG) na maturação in vitro de oócitos bovinos nas condições do Laboratório de Embriologia e Biotécnicas de Reprodução da UFRGS. Complexos cumuli-oophorus (CCOs), em número total de 1458, foram aleatoriamente distribuídos em doze tratamentos, maturados por 24 h em atmosfera de 5% CO2, em ar e 100% umidade relativa em estufa a 39°C. A fecundação nos doze tratamentos foi realizada mediante exposição dos CCOs maturados aos espermatozóides (1x106/mL), previamente capacitados, durante 20 h. O cultivo foi realizado em fluído sintético de oviduto modificado (SOFaa) acrescido de 10% SVE a 39°C, 100% de umidade relativa do ar e 5% CO2, 5% O2 e 90% N2. Na presença de hormônios os meios indefinidos (SVE: 63,6%, 70/110; SEE: 53,4%, 70/131 e SFB: 56,0%, 75/134) apresentaram maior eficiência em proporcionar suporte à primeira divisão embrionária, em comparação ao meio definido (PVP: 50,6%, 45/89). Os CCOs maturados em meio indefinido suplementado com SVE e hormônios apresentaram maior competência em fecundar e suportar o desenvolvimento embrionário até o estádio de blastocisto após sete dias de cultivo (27,3%, 30/110).

Efeitos da hipertensão renovascular sobre a função reprodutiva de ratos machos Wistar

O presente estudo investiga a função reprodutiva de ratos machos com hipertensão induzida pelo modelo dois-rins, um-clipe (2R/1C), e de ratos 2R/1C normotensos devido ao tratamento com o bloqueador de canais de Ca2+ nifedipina. O aumento da AngII periférica/central é característico do modelo 2R/1C. Parâmetros de comportamento sexual (latência e freqüência de monta com intromissão, latência de ejaculação e duração do intervalo pós-ejaculatório) e de espermatogênese (quociente espermático e trânsito epidimário), e hormônios plasmáticos (LH, FSH, PRL e testosterona) foram utilizados para a avaliação da função reprodutiva dos animais. Noventa e nove ratos Wistar foram utilizados neste estudo, divididos em seis grupos: 2R/1C- ratos com hipertensão induzida pelo modelo 2R/1C; FICT- ratos com cirurgia fictícia; 2R/1C+V- ratos 2R/1C que usaram veículo; 2R/1C+N- ratos 2R/1C que foram tratados com nifedipina; FICT+V- ratos FICT que usaram veículo; FICT+N- ratos FICT que foram tratados com nifedipina. Os animais permaneceram “clipados” na artéria renal durante vinte e oito dias. O tratamento oral com nifedipina (10mg/kg/rato) foi iniciado no primeiro dia após o “clipamento” da artéria renal. O comportamento sexual foi registrado por vídeo e a pressão arterial média (PAM) foi aferida por cateter inserido na artéria femoral. Após o registro de PAM, os animais foram mortos para coleta de sangue e retirada das gônadas. Os resultados mostraram que o grupo 2R/1C exibe elevada PAM, aumento da latência de monta com intromissão e de ejaculação, aumento da duração do intervalo pós-ejaculatório, redução do número de animais que ejaculam e que apresentam período pós-ejaculatório, aumento da PRL com redução da testosterona plasmática, e redução do quociente espermático com aumento do trânsito epidimário, quando comparado ao grupo FICT. Entretanto, animais 2R/1C+N apresentaram valores de comportamento sexual e dos hormônios plasmáticos semelhantes aos animais FICT+V ou FICT+N, diferindo significativamente apenas dos ratos 2R/1C+V. Animais 2R/1C+V e 2R/1C+N mantiveram o prejuízo da espermatogênese. Os dados sugerem uma associação entre hipertensão induzida pelo modelo 2R/1C e redução da função reprodutiva; no entanto, o comportamento sexual e a PRL plasmática, ambos normais, foram coincidentes com uma PAM normal. Os efeitos da nifedipina sobre o impedimento em diminuir o comportamento sexual e em aumentar a PRL plasmática, e sobre a manutenção do prejuízo na espermatogênese acontece somente em animais “clipados” na artéria renal. A AngII elevada, característica do modelo 2R/1C, parece ter ação decisiva sobre o prejuízo na espermatogênese, o mesmo não acontecendo quanto à redução do comportamento sexual e ao aumento da PRL plasmática.

Avaliação da função reprodutiva em ratas submetidas ao clampeamento da artéria renal esquerda modelo 2 rins/1 clipe

No modelo de hipertensão renovascular, a redução do fluxo sangüíneo para o rim causada pela aplicação de um clipe na artéria renal, modelo 2 Rins/ 1 Clipe (2R/1C), leva à secreção de renina e um aumento secundário na concentração de angiotensina II (Ang II) periférica, que tem papel na elevação da pressão arterial. Além de seu efeito vasopressor a Ang II tem envolvimento na fisiologia reprodutiva. A Ang II está envolvida na regulação da secreção do hormônio liberador do hormônio luteinizante (LHRH), ovulação, e comportamento sexual em ratos machos e fêmeas. Nosso objetivo nesse trabalho foi analisar a regularidade do ciclo estral após a implantação do clipe, o comportamento sexual, peso ovariano, ovulação, como também, verificar as concentrações plasmáticas de estradiol, hormônio luteinizante (LH) e hormônio folículo estimulante (FSH) durante a tarde do proestro em ratas submetidas ao modelo 2R/1C. Dos animais clipados, em torno de 55% apresentaram pressão arterial sistólica (PAS) maior que 150 mmHg, dessa forma os animais neste estudo foram divididos em três grupos: grupo de ratas FICT (submetidas à cirurgia fictícia), grupo 2R/1C (fêmeas submetidas à laparotomia, com dissecação da artéria renal esquerda, para a implantação de um clipe de prata de 0,15mm de diâmetro, e que apresentavam PAS <125 mmHg), e 2R/1C-H (fêmeas submetidas ao modelo 2R/1C e que apresentavam PAS >150 mmHg). O sangue foi centrifugado, o plasma coletado foi destinado ao radioimunoensaio para estradiol, LH, e FSH. Ao final das coletas as ratas retornaram ao biotério, e na manhã seguinte (fase estro), tiveram os ovários coletados, pesados separadamente, e em seguida foi realizada a contagem do número de óvulos. Os resultados mostraram que ratas 2R/1C-H e 2R/1C apresentam um maior tempo, em dias, para o retorno às mudanças de fases do ciclo estral, após a cirurgia. Ratas 2R/1C-H apresentaram redução na freqüência de lordose e um menor quociente de lordose (Freqüência de lordose/Freqüência de monta). Foi verificada redução no número de óvulos nos animais 2R/1C-H e 2R/1C quando comparado ao grupo FICT. As concentrações plasmáticas de estradiol e FSH na tarde do proestro não foram diferentes entre os grupos, porém a concentração plasmática de LH no grupo hipertenso foi menor às 16:00h em relação ao demais grupos. A redução no número de óvulos em ratas 2R/1C-H e 2R/1C, na fase estro, foi confirmada no experimento II, porém esta não foi acompanhada por alteração no peso do ovário direito e esquerdo. Em conjunto nossos resultados demonstraram que ratas 2R/1C-H apresentam redução na capacidade reprodutiva, que não foi associada a alterações nas concentrações plasmáticas de estradiol e FSH, mas sim a uma modificação do perfil da curva de secreção de LH na tarde do proestro. Sugere-se que a redução na função reprodutiva verificada seja devido ao aumento de Ang II e/ou elevação da pressão arterial.