Expressão de uma quitinase de Metarhizium anisopliae em Nicotiana tabacum : obtenção de plantas transgênicas resistentes a doenças fúngicas

A resistência a doenças em plantas transgênicas tem sido obtida por meio da expressão de genes isolados de bactérias, fungos micoparasitas e plantas. Neste trabalho, relatamos a utilização de um gene do fungo entomopatogênico Metarhizium anisopliae como modo de gerar resistência a doenças fúngicas em plantas. O gene chit1 codifica a quitinase CHIT42 (EC 3.2.1.14), pertencente a uma classe de glicosil-hidrolases capazes de converter quitina em oligômeros de N-acetil-glicosamina (NAcGlc). Quando presentes em tecidos vegetais, supõese que as quitinases ataquem especificamente a parede celular de fungos invasores, provocando danos às hifas e causando a morte por lise das células fúngicas. Deste modo, dois diferentes grupos de plantas transgênicas de Nicotiana tabacum foram produzidos: no primeiro deles, denominado chitplus, os indivíduos possuem o gene chit1 sob o controle do promotor CaMV 35S. O segundo grupo, demoninado chitless, consiste de plantas transformadas com um T-DNA não contendo o gene do fungo. Trinta e quatro plantas transgênicas resistentes à canamicina (17 de cada grupo) foram regeneradas a partir de discos de folhas infectados por Agrobacterium tumefaciens. A produção da quitinase em extratos protéicos de folhas foi analisada por zimogramas em SDS-PAGE contendo glicol-quitina e corados por calcoflúor branco, na forma de um screening dos transgênicos primários. As plantas transgênicas foram testadas, ainda, por meio de ensaios colorimétricos empregando oligômeros sintéticos de NAcGlc como substratos específicos, além de immunoblot e Western blot com soro anti-quitinase. A quantidade de enzima recombinante nas plantas chitplus variou desde nenhuma atividade detectável a elevados níveis de expressão da enzima. A hibridização de Southern blot demonstrou que o número de cópias do gene chit1 integradas no genoma vegetal foi estimado entre uma e quatro. A primeira geração de plantas transgênicas geradas por autofecundação de parentais portadores de duas cópias do transgene foi testada com relação à estabilidade da herança do transgene e em 43 de um total de 67 descendentes, originados de quatro cruzamentos independentes, o padrão de segregação não diferiu das proporções Mendelianas esperadas. Ensaios de resistência, desafiando as plantas transgênicas com o basidiomiceto Rhizoctonia solani foram realizados e uma evidente diminuição da área foliar contendo lesões fúngicas foi observada entre as linhagens transgênicas, embora variações na atividade quitinolítica tenham influenciado o nível de resistência. Nossos resultados sugerem uma relação direta entre a atividade específica de quitinase e ao aumento nos níveis de resistência às lesões causadas pela infecção por R. solani.

Testemunha da tuberculose : antígeno liparabinomannan

O estudo pretendeu abordar a imunidade humoral na Tuberculose. Foi um estudo de teste diagnóstico que avaliou um antígeno específico, constituinte da parede celular da micobactéria, denominado LIPOARABINOMANNAN (LAM), proveniente de Cambridge, MA, USA da Companhia Dyna-Gen. O objetivo principal do estudo foi a detecção de anticorpos IgG anti-LAM em casos de tuberculose pulmonar, extrapulmonar e formas combinadas da doença. A casuística total compreendeu 173 pacientes portadores de tuberculose, sendo a mesma confirmada por métodos bacteriológicos e/ou anatomopatológicos de biópsias de diversos órgãos em 114 casos (65,8%). Em 46 casos (26,5%) a doença se confirmou por rigorosos critérios clínicos, radiológicos e de seguimento após tratamento adequado. Cento e quinze pacientes eram do sexo masculino (66,5%) e 58 do sexo feminino (33,5%). Cento e trinta e um eram brancos (75,7%), 24 negros (13,9%) e 18 mistos (10,4%). O total de formas pulmonares foi de 88 casos (51%), sendo 81 (46,8%) formas bacilíferas e 7 casos (4,0%) não-bacilíferas. Dos casos com baciloscopia direta negativa, 3 apresentaram culturas positivas, 2 culturas negativas e em 2 casos a mesma não foi realizada. Formas extrapulmonares compreenderam 71 casos (41%) com predomínio de forma miliar, ganglionar, pleural e do SNC. A combinação de ambas as formas ocorreu em 14 casos (8,1%). Radiologicamente, houve predomínio de lesões escavadas (30,1%), consolidação (13,9%), padrão miliar (11%) e exame radiológico normal (11%), além de outros achados. Da série, 118 pacientes eram HIV negativos (68,2%) e 55 eram HIV positivos (31,8%). As principais comorbidades associadas foram Diabetes Melittus (DM), Alcoolismo, Cardiopatia e Neoplasia, entre outras. Exames culturais foram realizados em 145 pacientes, sendo que em 72 casos a cultura foi positiva (41,6%) e foi negativa em 10 casos (5,8%). Dos 72 exames culturais positivos, o teste do MycoDot foi positivo em 47 casos (65,2%) e negativo em 25 (34,7%). Em 10 exames culturais negativos, o mesmo foi positivo em 6 casos (60%) e negativo em 4 casos (40%). Em 63 exames culturais não realizados, o teste do MycoDot foi positivo em 46 casos e negativos em 17. Os resultados do teste MycoDot na série total foram: positivos em 120 pacientes (69,4%) e negativos em 53 pacientes (30,6%). As formas pulmonares bacilíferas, não bacilíferas, extrapulmonares e combinadas apresentaram sensibilidade de 74,1%, 85,7%, 63,4% e 64,3% respectivamente. O grupo controle foi de 77 indivíduos assim distribuídos: 41 sadios, 16 portadores de lesões residuais de tuberculose, 6 sadios com BCG prévia, 6 sadios sem BCG prévia e 8 com outras comorbidades. O resultado do teste MycoDot foi negativo em 73 casos (94,8%) e positivo em 4 casos (5,2%). A sensibilidade da casuística total foi de 69,4%, a especificidade foi de 94,8%, o valor preditivo positivo (VPP) foi de 96,8% e o valor preditivo negativo (VPN) foi de 57,9%. Dos pacientes HIV positivos a sensibilidade foi de 61,8% e a especificidade foi de 100%. Nos pacientes HIV negativos a sensibilidade foi de 72,9% e a especificidade foi de 94,7%. Concluiu-se que o Teste MycoDot é de fácil realização, baixo custo, podendo ser útil como uma ferramenta adicional para o diagnóstico da tuberculose.