Identificação e avaliação do potencial biotecnológico de leveduras e fungos semelhantes a leveduras isolados de filoplano do Hibiscus rosa-sinensis

O filoplano do Hibiscus rosa-sinensis abriga uma enorme biodiversidade de leveduras e fungos semelhantes a leveduras cujo potencial biotecnológico ainda é desconhecido. Foram isoladas 84 cepas de leveduras de filoplano desta planta, sendo identificadas pela metodologia clássica. Do total de isolados 37% são de afinidade ascomicética, 36% de afinidade basidiomicética e 27% de fungos semelhantes a leveduras.

Biodiversidade e potencial biotecnológico de leveduras e fungos leveduriformes associados ao filoplano de bromélias do Parque de Itapuã-Viamão/RS

As bromélias abrigam uma grande diversidade de organismos. O objetivo do presente trabalho foi analisar a biodiversidade de leveduras e fungos leveduriformes presentes no filoplano de bromélias e avaliar seu potencial biotecnológico. Foram coletadas 50 amostras de folhas de bromélias no Parque Estadual de Itapuã/RS (Praia da Pedreira e Praia de Fora). Fragmentos das folhas foram submetidos a lavagens sucessivas com 0,5%Tween 20. Diluições decimais seriadas da última lavagem, amostras de água dos tanques de bromélias e de flores foram inoculadas em meio YM modificado e incubadas a 25°C por 5-7 dias. Representantes dos diferentes morfotipos foram purificados e identificados pela metodologia convencional. A análise da biodiversidade foi realizada através do índice de Shannon-Weaver. Dos 191 isolados obtidos, 182 foram identificados, sendo 11% leveduras de afinidade ascomicética, 67,6% de afinidade basidiomicética, 19,8% de fungos leveduriformes e 1,6% de algas. Doze isolados de leveduras tiveram as regiões ITS e D1/D2 do 26SrDNA sequenciadas e pertencem a uma espécie ainda não descrita do gênero Rhodotorula. A diversidade e a riqueza de leveduras foram maiores na Praia da Pedreira (H=3,225 e S=34) que na Praia de Fora (H=2,820 e S=26). Cento e noventa e um isolados tiveram sua capacidade para produzir enzimas testada. Desses, 40,2% foram positivos para amilase, 49,2% para caseinase, 14,8% para gelatinase, 58,0% para celobiase, 36,0% para lactase e 61,3% para esterase. O filoplano das bromélias apresentou uma grande biodiversidade de leveduras e fungos leveduriformes,.demonstrando ser um bom substrato para o isolamento de leveduras produtoras de enzimas de interesse industrial.

O duplo enfoque contábil e administrativo no sistema de custos da indústria de óleos vegetais

Visa a presente dissertação de mestrado estabelecer um sistema de contabilidade de custos integrado e coordenado com a contabilidade financeira para a Industria de Oleos Vegetais e que, encarando este sistema sob um duplo enfoque, contabil e administrativo, permita a conciliação destes dois enfoques ate certo ponto contrastantes. A construção de um sistema de custo requer um completo entendimento: (1) dos processos de produção; (2) dos objetivos perseguidos pelo sistema de custos e (3) da estrutura organizacional da empresa. Quanto às caracteristicas especiais da industria de óleos de soja, no Rio Grande do Sul, no que se refere a seu processo de estas são, basicamente: (1) produção continua em massa; (2) obteção de co-produtos e de subprodutos e (3) industrialização subdividida em fases. Destarte, o custo de industrialização de sementes oleaginosas divide-se basicamente em duas fases importantes: (1) uma, de custos conjuntos, comuns a todos os produtos resultantes - o circuito do grão - que abrange a ensilagem, a preparação dos grãos e a extração. (2) outra, de custos isolados - que abrange os circuitos óleo (miscela) e do farelo (polpa), bem como o refino e a embalagem. Quanto aos objetivos perseguidos com a introdução de um sistema de custos na Industria de Óleos Vegetais, requerem-se dados de custos basicamente para três finalidades: (1) custos para estoques: avaliação de estoques para fins de inventário; (2) custos para controle: avaliação da eficiência para fins de controle; (3) custos para decisões: estabelecimento de parâmetros fins de tomada de decisões. Quanto à estrutura organizacional, deverá, na elaboração de um sistema de custeio, ser observada a constituição da empresa em termos de departamentos e/ou de centros de custos, caracterizando-os como sendo auxiliares, de produção, de vendas, distribuição, ou ainda de administração. Dadas as caracteristicas da industria, os objetivos perseguidos e a estrutura organizacional básica constatada, concebeu-se um sistema de custo, integrado e coordenado com o restante da escrituração, com as se guintes caracteristicas: (1) Quanto à concepção formal do sistema: Sistema Dualista com escrituração em Partidas dobradas mediante Registros Globais; (2) Quanto à concepção essencial do sistema: Custeio Parcial de Absorção, com emprego de custos gerais indiretos setorialmente diferenciados, absorvidos com base na capacidade normal; (3) Quanto ao metodo de alocação dos custos conjuntos aos coprodutos: Abordagem do Valor Relativo de Vendas (calculado) no Ponto de Separação, estabelecido com base em cálculo retroativo partindo dos valores relativos de vendas dos co-produtos no ponto de vendas e trabalhando de trás para frente em direção aos valores relativos de vendas aproximados (calculados) no ponto de separação e deste ainda subtraindo o credito total conjunto e o custo administrativo que foi atribuido aos co-produtos por rateio; (4) Quanto ao método de alocação das receitas com subprodutos: subtração da receita obtida com a venda dos subprodutos dos custos da fase em que os mesmos são obtidos. É sistema dualista, porque propõe a existência de "duas" contabilidades - a contabilidade externa ou financeira e a contabilidade interna ou de custos, sendo, todavia, complementares entre si. Sua escrituração se faz em partidas dobradas, mediante registros globais, porque é contabilidade de custos é conduzida atraves de fichas, mapas, planilhas e somente o resumo final do movimento de valores e contabilizado mensalmente mediante lançamentos globais. É um sistema de custeio parcial de absorção, porque: (1) atende ao que estabelece o Cecreto-Lei n9 1398, de 26/12/77, em seu art. 139 , a respeito da avaliaçâo dos estoques, para fins de inventários; (2) permite o uso de orçamentos flexiveis para fins de controle e com isso a adaptação do sistema de custeio ao nivel de produção (ou de atividade) esperado durante o periodo de produção; (3) permite tanto determinar o custo dos produtos (para fins de inventário), como tambem a contribuição que os mesmos trazem ao lucro empresarial e à receita total (para fins decisoriais) ; e ainda (4) permite, se separados os custos indiretos em fixos e variáveis, no Mapa de Localização de Custos, o cálculo do ponto de equilibrio de alternativas de resultado a diversos niveis de produção, bem como ainda de alternativas de limites inferiores de preço de venda a diversos niveis de produção, para fins decisoriais. Para fins contábeis e para a integração custo - contabilidade são usados valores histéricos, para fins de controle, valores orçados, estimados e para fins de decisão, valores de reposição ou estimados (projetados). o sistema de custos baseia-se, ainda, para sua elaboração, em duas peças-chave, que são: (1) - O Mapa de Lqcalização de Custos, no qual todos os custos indiretos são alocados por especies de custos e por centros de custos; (2) - O Boletim de Apropriação de Custos, no qual e realizado o cálculo do custo unitário dos co-produtos, para fins de inventário. Para que aconteça a total integração da contabilidade de custo com a contabilidade financeira, esta mantém contas de produção e de estoques, fase por fase, nas quais são lançados, por intermedio de registros globais, os resultados do cálculo de custos.

Estudo sobre a biodegradação do herbicida trufluralina por bactérias isoladas de solo agrícola e proposta metodológica para o ensino de biodegradação

Trifluralina (a, a, a,trifluoro-2,6-dinitro-N, N-dipropil-p-toluidina) (TFL) é um herbicida pré-emergente, incorporado ao solo que tem sido usado na agricultura desde a década de sessenta; ele é moderadamente persistente em vários tipos de solos do Brasil. O objetivo deste estudo foi isolar - de um solo agrícola contaminado por quatro décadas - e caracterizar bactérias resistentes a TFL, determinar suas habilidades em degradar a TFL, investigar a presença de gens degardadores que possam estar envolvidos na degradação da TFL e propor um método de ensino teórico prático sobre a biodegradação, para cursos de graduação. Oito bactérias foram isoladas, pela técnica de subculturas repetidas em meio contendo TFL como única fonte de carbono, e identificadas, pelo método bioquímico e seqüenciamento do rDNA 16S como Klebsiella oxytoca, Herbaspirillum seropedicae, 3 strains of Bacillus simplex, 2 de Pseudomonas montelli e uma outra Pseudomonas sp. Uma terceira bactéria (iaolado #9), não identificada, que crescia ao redor de cristais de TFL em meio sólido, foi isolada; esta é uma técnica nova que poderá ser útil no isolamento de bactérias que são resistentes a outros compostos pouco solúveis em água. Todas as bactérias isoladas foram submetidas ao teste de biodegradação, em um meio contendo sais minerais, 0,1% succinato, 0,1 % de extrato de leveduras e 50 mg. L-1 de TFL Cinco bactérias reduziram a concentração de TFL no meio, após trinta dias de incubação: Klebsiella oxytoca (24,6 %), Herbaspirillum seropedicae (16,4 %), Bacillus simplex 2 (25.0 %), Bacillus simplex 3 (16.0 %) e isolado 9 (21.0 %). Uma bactéria conhecida como degradadora da TFL, Brevundimonas diminuta (NCIMB 10329) degradou a TFL, neste meio, de maneira semelhantes ao das bactérias isoladas. Os DNAs extraídos das quatro bactérias identificadas degradadoras da TFL, foram sondados para os gens catbólicos ndoB, todC, xylX, catA e xylE, os quais codificam as enzimas naftaleno 1,2-dioxigenase, toluene dioxigenase, toluate 1,2-dioxigenase, catecol 1,2-dioxigenase e catecol 2,3-dioxigenase, respectivamente. Técnicas de PCR e hibridização demonstraram que os DNAs de todas estas quatro bactérias foram fortemente hibridizadas para o gen ndoB, contudo, usando a técnica de ¨zonas claras¨, observou-se que nenhuma delas degradou naftaleno. Estes resultados indicam a presença de gens dioxigenases, nestas bactérias degradadoras da TFL, que poderiam estar transformando a TFL como substrato principal, ou como cometabolismo. O conhecimento sobre processos de biodegradação é necessário para os graduados dos cursos de agronomia, química, biologia, tecnologia de alimentos, etc. Neste trabalho, também, propomos o estudo teórico e prático da compostagem o qual estimula o interesse dos estudantes em aprender sobre o metabolismo envolvido neste, e em outros, processos biotecnológicos.

Avaliação micológica de rações comerciais para cães e gatos e potencial micotoxinogênico de espécies selecionadas

A eficácia dos meios ágar batata acidificado, ágar dicloram rosa de bengala e cloranfenicol e ágar dicloram glicerol 18% foi comparada para isolamento e quantificação de fungos a partir da análise de 54 amostras de rações comerciais secas para cães e gatos (34 para cães e 20 para gatos), produzidas por 9 empresas. A atividade de água das amostras foi quantificada, apresentando valores entre 0,45 e 0,82. Em 74% das amostras foi detectada a presença fúngica, onde, além de fungos com micélio estéril e leveduras, 23 gêneros de fungos foram identificados. As 40 amostras positivas apresentaram níveis de contaminação, com contagens variando entre 101 e 103 UFC/g. Não se verificou correlação entre atividade de água e contaminação fúngica e não se observou diferença significativa entre o número de colônias isoladas e os diferentes meios de cultivo utilizados. Apesar disto, o DG18 foi o meio que apresentou melhores resultados tanto na quantidade quanto na variedade de fungos isolados. Comparando-se os resultados obtidos com diferentes meios observa-se que os microrganismos isolados dependem dos meios de cultivo empregados. O gênero Aspergillus e a espécie Aspergillus niger foram os mais freqüentemente isolados. Isolados pertencentes a espécies potencialmente produtoras de aflatoxinas e ocratoxina A foram avaliados através do método de ágar plug-TLC. Vinte por cento dos A. flavus isolados produziram aflatoxina B1, todos os isolados de A. ochraceus produziram ocratoxina A e nenhum isolado de A. niger foi detectado como produtor de ocratoxina através do método de screening utilizado. A avaliação fúngica realizada com o emprego de 3 meios de cultura tornou claro que a detecção de fungos é dependente do meio de cultura utilizado. A Aw do alimento e do meio também devem ser consideradas para que as análises microbiológicas possam detectar ou valorar a micobiota que, efetivamente, está contaminando o alimento.

Estudo da influência de manejos pós-colheita na incidência de fungos e micotoxinas no arroz (Oryza sativa L.)

Cerca de 15% da safra de arroz é perdida anualmente, principalmente em práticas inadequadas de pós-colheita. Nesse contexto, a avaliação de técnicas de secagem e armazenamento é necessária em função das perdas quali e quantitativas de grãos, resultantes do desenvolvimento de fungos. O objetivo desse trabalho foi analisar a contaminação fúngica e por micotoxinas do arroz submetido aos sistemas de secagem intermitente e estacionário, com armazenamento em sacaria e em silo-secador, avaliando o comportamento das principais variáveis de influência no processo. O trabalho foi realizado entre os meses de maio de 2003 a maio de 2004. As amostras de arroz com casca foram coletadas a cada dois meses, em duplicatas. Foram, ainda, analisadas amostras de arroz branco polido e parboilizado de ambos sistemas. O número de colônias de bolores e leveduras foi determinado e a capacidade produtora de micotoxinas dos isolados do gênero Aspergillus foi investigada. A detecção de aflatoxinas, ocratoxina A, zearalenona e citrinina foi realizada por cromatografia em camada delgada. Os grãos secados no sistema estacionário apresentaram maior contagem de colônias fúngicas. Enquanto no sistema intermitente, a contaminação foi mais uniforme ao longo do armazenamento. Predominaram representantes do gênero Penicillium nos dois sistemas, principalmente P. commune e P. islandicum. Entre os isolados do gênero Aspergillus, destacou-se A. flavus. Foram encontrados 7 (13, 20%) isolados de A.flavus produtores de aflatoxina B1, mas não foram detectadas micotoxinas nas amostras. A umidade dos grãos afetou significativamente a contaminação fúngica no manejo intermitente e no terço superior (altura 2) do silo-secador. A temperatura no interior do silo influenciou a contaminação no terço inferior (altura 1).

Análise do polímero PHA em Saccharomyces cerevisiae recombinante : superexpressão de phaG, e a contribuição in vivo das enzimas auxiliares envolvidas na beta-oxidação de ácidos graxos insaturados em peroxissomos

Os polímeros do tipo poli-hidroxialcanoatos (PHAs) são poliésteres bacterianos que apresentam as propriedades de termoplásticos e elastômeros biodegradáveis. A síntese deste polímero em plantas de interesse agroindustrial tem sido vista como uma área promissora dentro da biotecnologia de polímeros para a produção em grande escala com baixos custos. Contudo, esta tarefa requer o aprimoramento de diferentes metodologias bioquímicas e moleculares, além de maximizar os processos de extração destes polímeros biológicos. A produção de PHAs em peroxissomos ou no citoplasma de Saccharomyces cerevisiae, por meio da expressão de uma PHA-sintase bacteriana, pode servir como indicador e modulador do fluxo de carbonos que percorre vias biossintéticas como a síntese de novo de ácidos graxos e a β-oxidação. Esta levedura tem sido usada como eucarioto modelo para manipular as rotas envolvidas na síntese de PHAs do tipo MCL (PHA com um número médio de carbonos), um polímero menos cristalino e com menor ponto de fusão quando comparado ao PHA-SCL (PHA com um número pequeno de carbonos). A enzima PhaG (3-hidroxidecanoil-ACP-CoA transacilase) é responsável pela conexão entre a síntese de ácidos graxos e a produção de PHA-MCL em bactérias do gênero Pseudomonas, em meios de cultura contendo uma fonte de carbono nãorelacionada como gliconato, etanol ou acetato. Para tentar estabelecer esta rota metabólica em S. cerevisiae, o presente trabalho avaliou a coexpressão de PhaGPa e PhaC1Pa (PHA-sintase) de P. aeruginosa para a síntese de PHA-MCL a partir de uma fonte de carbono não-relacionada em leveduras. Contudo, a presença de PhaGPa não alterou a composição ou a quantidade de PHA-MCL em relação à cepa controle contendo apenas PhaC1Pa citoplasmática ou direcionada ao peroxissomo, independentemente da fonte de carbono utilizada (rafinose ou ácido oléico). Este resultado permite sugerir que a ligação entre a síntese de ácidos graxos e a produção de PHA-MCL em S. cerevisiae não foi estabelecida, provavelmente devido à ausência de algum passo enzimático que limita o desvio de substratos da síntese de ácidos graxos para a produção de PHA-MCL em organismos que não são capazes de acumular naturalmente este polímero quando cultivados em fontes de carbono não-relacionadas.A levedura S. cerevisiae tem sido usada como um sistema modelo para estudar a β-oxidação de ácidos graxos insaturados em peroxissomos. A produção de PHA-MCL pela expressão de PhaC1Pa em peroxissomos de cepas selvagens e mutantes nulos de S. cerevisiae para as enzimas auxiliares da β-oxidação (Eci1p, Sps19p e Dci1p), multiplicadas em meio de cultivo contendo um ácido graxo insaturado como fonte de carbono, permitiu monitorar o fluxo de carbonos que percorre as vias dependente de isomerase, redutase e di-isomerase. Desta forma, o presente estudo permitiu avaliar a β- oxidação in vivo dos ácidos graxos linoléico conjugado, 9-cis,11-trans-CLA (ácido rumênico) ou 10-cis,13-cis-nonadecadienóico, para determinar a contribuição das vias alternativas na degradação destes substratos pela utilização de cepas selvagens, mutantes nulos e linhagens contendo um plasmídio multicópia para os genes ECI1 (Δ3- Δ2-enoil-CoA isomerase), SPS19 (2,4-dienoil-CoA redutase) e DCI1 (Δ3,5-Δ2,4-dienoil- CoA isomerase). As linhagens selvagens foram capazes de sintetizar PHA-MCL quando cultivadas em ácido rumênico, mas a atividade da enzima Eci1p foi essencial para a degradação deste CLA, indicando que a via dependente de isomerase é a única rota in vivo necessária para a β-oxidação do ácido rumênico em peroxissomos de S. cerevisiae. A contribuição da enzima di-isomerase (Dci1p) para a degradação do ácido 10- cis,13-cis-nonadecadienóico foi avaliada em cepas selvagens, mutantes nulos dci1Δ e linhagens de S. cerevisiae contendo os plasmídeos multicópia. De acordo com o conteúdo e a quantidade de PHA formado, a β-oxidação de ácidos graxos cisinsaturados em um carbono ímpar é, in vivo, independente da di-isomerase. Embora este resultado possa indicar o mesmo padrão de envolvimento de Dci1p na degradação de ácidos graxos cis-insaturados em um carbono ímpar em mitocôndrias de mamíferos, esta via alternativa deve ser mais bem investigada em eucariotos superiores.