Detecção de Escherichia coli, Listeria monocytogenes e Brucella sp. em queijos produzidos artesanalmente na Região Litorânea do Rio Grande do Sul

O queijo é o produto de maior importância entre os derivados do leite, pelo seu grande valor nutritivo e pelas suas características organolépticas. Na região litorânea do Rio Grande do Sul, Brasil, existe uma concentração elevada de comércio artesanal de queijo. Para a estimativa da qualidade microbiológica destes produtos, foram coletadas 80 amostras referentes a 29 bancas de estabelecimentos comerciais localizados nas rodovias RS 30 (Osório-Tramandai), RS 40 (Viamão-Pinhal) e RS 389 (Osório-Torres). Em 26% das amostras, a contagem de coliformes fecais estava acima da estabelecida pela legislação e em 32% das amostras foi possível o isolamento de E.coli., sugerindo considerável contaminação e a necessidade de orientar estes produtores para normas básicas de higiene. Foi confirmada a presença de Listeria sp. em 16% das amostras, sendo 4% L. monocytogenes. Não foram isoladas cepas de Brucella sp. As características do produto analisado como pH, atividade da água, estocagem, presença de altas contagens de microrganismos competidores, provavelmente, contribuíram significativamente para controle de Listeria sp. e Brucella sp. O presente estudo demonstra que este tipo de alimento pode tornar-se um problema de saúde pública, principalmente para os grupos de risco.

Purificação e caracterização da bacteriocina cereína 8A, produzida por uma linhagem de Bacillus cereus

Foi estudada uma bacteriocina produzida por uma linhagem de B. cereus 8A, isolado de solo da região Sul do Brasil. Na primeira etapa de estudo determinaram-se as condições básicas de produção de bacteriocina com amplo espectro de ação denominada de Cereína 8A. Observou-se que durante a fase estacionária ocorre o máximo da sua produção, iniciando sua síntese no final da fase exponencial. As condições de maior produção foram a 30º C, agitação e contínua e numa faixa de pH de 7,0-8,5. A bacteriocina bruta inibiu várias bactérias indicadoras, como Listeria monocytogenes, Clostridium perfringens e Bacillus cereus. O teste de termoestabilidade mostrou a perda de atividade quando submetida a uma temperatura a partir de 87º C. Verificou-se a resistência da bacteriocina bruta frente à tripsina e papaína, mas não frente à proteinase K e pronase E. B. cereus e L. monocytogenes foram utilizadas como bactérias indicadoras para a determinação do modo de ação, após a determinação da dose bactericida de 200 UA mL-1 e 400 UA mL-1 respectivamente. A Cereína 8A demonstrou uma ação inibidora em culturas de Escherichia coli e Salmonella Enteritidis, quando tratadas com EDTA. A atividade esporicida foi observada contra esporos de B. cereus após tratamento com 400 UA ml -1. A análise da biomassa de L. monocytogenes e B. cereus após tratamento com a Cereína 8A, através da espectrofotometria de infravermelho determinou alteração no perfil, correspondente à fração dos ácidos graxos da membrana celular bacteriana. A substância peptídica foi separada por meio da precipitação com sulfato de amônio, extração com 1-butanol e aplicação em coluna de cromatografia por troca iônica tipo Q-Sepharose. A Cereína 8A purificada mostrou maior sensibilidade a proteases e ao calor e um peso molecular de aproximadamente 26 kDa. O espectro ultravioleta foi típico de um polipeptídeo e o espectro de infravermelho indica presença de grupamentos NH, acil e ligações peptídicas na sua estrutura. Uma hipótese do mecanismo de ação seria a desestruturação da membrana celular pela abertura de poros.

Produção, caracterização, purificação parcial e aplicação de um peptídeo antimicrobiano produzido por Bacillus licheniformis P40

Uma bactéria identificada como Bacillus licheniformis P40 isolada de intestino de peixe (Leporinus sp.) da bacia amazônica foi estudada quanto à sua capacidade de produzir antimicrobianos. O sobrenadante da cultura obtido em caldo de cérebro e coração (BHI) foi caracterizado, sendo ativo contra importantes bactérias patogênicas e deteriorantes como L. monocytogenes, B. cereus, E. carotovora e isolados clínicos de Streptococcus. Este foi parcialmente purificado através de precipitação com sulfato de amônio e cromatografia de gel filtração e de troca iônica. Foram assim isoladas duas substâncias com atividade antimicrobiana, sendo uma delas de natureza protéica. Esta foi estável a altas temperaturas (100o C), numa ampla faixa de pH e mostrou propriedades de biosurfactante. O sobrenadante parcialmente purificado foi utilizado para o combate a um importante fitopatógeno: Erwinia carotovora. Uma dose de 6400 UA/mL foi bactericida para uma concentração de 107 UFC/mL em 20 minutos in vitro. A substância foi capaz de evitar a formação da podridão mole em batatas (in vivo). Foi estudada a produção da atividade antimicrobiana em resíduos e sub-produtos da indústria de alimentos, sendo escolhido o soro de queijo para otimizar a produção através de um experimento fatorial 23 variando as condições de temperatura, pH e concentração de soro de queijo em pó. As melhores condições foram para temperaturas entre 26 e 37o C e pH entre 6,5 e 7,5 para uma concentração de soro de 7%, sendo que aumentos na concentração levaram a aumentos na produção.

Padronização da técnica de imunoistoquímica para identificação de Listéria monocytogenes em placentas humanas e tecido nervoso central de ruminantes.

Este projeto foi desenvolvido no Laboratório de Patologia Experimental do Hospital de Clínicas de Porto Alegre (HCPA), com a aprovação da Comitê de Ética em Pesquisa do HCPA e com apoio financeiro parcial do Fundo de Incentivo à Pesquisa e Eventos do HCPA (FIPE). O experimento 1, chamado de projeto piloto, teve como objetivo implementar a técnica de IHQ para identificar a Listeria monocytogenes (L.m.), utilizando anticorpo policlonal antilisteria monocytogenes (Biodesig ). Vários testes foram realizados para acertar a diluição (1:1000) que foi diferente da preconizada pelo fabricante. Os blocos de parafina, de dez placentas provenientes de parto prematuro ou aborto foram utilizados para os cortes histológicos e a preparação das lâminas para a coloração Hematoxilina e Eosina (HE) e imunoistoquímica (IHQ). As lâminas foram identificadas por números para resguardar a identidade das pacientes. O resultado do HE mostrou alterações inflamatórias em oito placentas e L. m. foi identificada pelo IHQ em cinco dessas placentas. O objetivo do 2º experimento foi identificar a L. m. em tecido nervoso cerebral de ruminantes, utilizando a técnica implementada no projeto piloto. O material utilizado neste trabalho foi cedido pelo Setor de Patologia Veterinária do Departamento de Patologia da Universidade Federal de Santa Maria. Os casos estudados (2 ovinos, 1 caprino e 2 bovinos) tinham suspeitas clínicas diversas e as necropsias dos animais evidenciaram aspectos sugestivos da doença. Os cinco casos foram confirmados pelo IHQ, comprovando a importância da utilização desta técnica para o diagnóstico da listeriose no SNC de ruminantes. O 3º experimento objetivou identificar a L. m. em placentas encaminhadas ao Serviço de Patologia do HCPA no ano 2000. Da mesma forma que no experimento 1, as lâminas foram identificadas por números. Após o levantamento realizado nos registros dos exames anatomopatológicos (AP) deste setor, observou-se que 714 AP eram de placentas provenientes de aborto, parto prematuro e nascimento a termo examinados naquele período. Foram sorteados 254 AP para análise através de HE, revelando que 148 desses AP apresentavam alterações inflamatórias (corioamnionite, vilite e deciduite). Os blocos destas placentas foram utilizados para fazer as lâminas e realizar IHQ. A consulta aos prontuários dos casos com alterações inflamatórias permitiu observar que um deles tinha a confirmação bacteriológica de L. m. na placenta, tornando-se este o controle positivo. O controle negativo foi selecionado entre aqueles sorteados que não apresentavam alterações inflamatórias. A presença de L. m. foi identificada em 33,78% das placentas analisadas pela técnica IHQ. Corioamnionite e vilite foram as alterações inflamatórias que mostraram diferença estatística significativa nas placentas positivas. L. m. estava presente nas placentas de 1º, 2º e 3º trimestres gestacionais. A idade das gestantes, casos de aborto e/ou parto prematuro não mostraram diferença estatística significativa com a presença ou ausência de L. m. nas placentas. Abortos habituais ocorreram em pacientes com ou sem L. m. no tecido placentário. Conclusão: a técnica de imunohistoquímica pode ser utilizada para confirmar o diagnóstico histopatológico de listeriose em placentas e tecido nervoso central de ruminantes.