Cariometria digital em adenocarcinoma de pâncreas

O adenocarcinoma de pâncreas continua sendo uma doença com alta mortalidade apesar dos avanços na ciência e na tecnologia. O diagnóstico é tardio, na maior parte dos casos, impossibilitando uma abordagem com fins curativos. Os estudos em busca de um método para o diagnóstico precoce ou mesmo um tratamento eficaz, até o momento, não revelaram mudanças significativas. Atualmente, pesquisas em biologia molecular apontando alterações em determinados genes nos tumores de pâncreas parecem ser promissoras. Neste sentido, porém seguindo uma outra linha de pesquisa, o estudo atual que objetiva a determinação das características nucleares das células neoplásicas através da cariometria por análise digital, constitui um passo inicial para futuras especulações. Recentemente, estudos em outros tecidos como o prostático, o mamário e o endométrio vêm demonstrando existir eficácia na diferenciação entre seus tecidos normais e neoplásicos e também uma forte relação entre as alterações encontradas na cromatina de seus núcleos celulares e a agressividade de seus respectivos tumores. Utilizando-se tecido pancreático estocado em parafina por até onze anos no laboratório de Patologia do Hospital de Clínicas de Porto Alegre (HCPA), foram determinadas as características nucleares em mil e trezentos núcleos de células ductais de adenocarcinoma de pâncreas e de tecido pancreático normal. Noventa e três características da cromatina foram estudadas por análise digital. Onze características apresentaram valores diferentes entre os dois grupos e estas diferenças foram estatisticamente significativas. A média para o valor da ÁREA nuclear nos tumores foi de 977.78 e de 336.60, no tecido normal; a da RLM278 foi de 353.23 e 97.07; a da RLM266 de 99.32 e 28.06; a do PERIM de 125.58 e 65.05; a do ROUND de 1.37 e 1.04; a da IOD de 123.49 e 107.97; a da FRACDIM de 1.22 e 1.05; a da DENSMIN de 0.01 e 0.14; a da DENSMAX de 0.53 e 0.62; a da DENSSD 0.25 e 0.10 e a da DENS20P de 0.49 e 0.33, respectivamente para os núcleos dos tumores e para os do tecido normal. Sete destas características serviram como marcadores ideais de neoplasia. Estes achados permitiram a criação de uma assinatura digital específica para cada um dos dois tipos de tecido estudado.

O polimorfismo T102C do receptor serotonérgico 5-HT2A participa na manutenção do tabagismo e dos mecanismos de preferência alimentar

A serotonina tem sido relacionada aos comportamentos apetitivo, emocional, motor, cognitivo e autonômico. Os neurônios serotonérgicos estão localizados nos núcleos da rafe, projetam-se para todas as regiões do sistema nervoso central e atuam através de sete tipos de receptores diferentes (5-HT1-7). Os receptores do tipo 2 são categorizados em 3 sub-tipos (A, B e C). Os receptores 5-HT2A são receptores pós sinápticos que promovem a ativação da fosfolipase C, responsável pela hidrólise de fosfolipídios da membrana neuronal, dando origem aos segundos mensageiros diacilglicerol e trifosfato de inositol. O gene do receptor 5-HT2A apresenta alguns polimorfismos, entre os quais o T102C, onde na posição 102 pode estar ou uma timina (T) ou uma citosina (C). Este polimorfismo, apesar de não determinar uma alteração na seqüência de amionoácidos que compõem o receptor determina sua expressão em quantidade diferente. Nesta tese, o polimorfismo T102C do gene do receptor 5-HT2A foi empregado como uma ferramenta para o estudo da neuroquímica do tabagismo e do comportamento alimentar. No estudo acerca do tabagismo, um grupo de 625 sujeitos foi genotipado e classificado de acordo com seu comportamento em relação ao fumo (fumantes atuais, exfumantes ou não fumantes). Foram encontradas diferenças na distribuição dos genótipos quando fumantes atuais foram comparados com ex-fumantes e não fumantes, sugerindo que o polimorfismo T102C está associado com a manutenção, e não o início, do hábito de fumar. O genótipo CC era mais freqüente nos fumantes atuais do que nos ex-fumantes e não fumantes. No estudo sobre o comportamento alimentar, um grupo de 240 sujeitos idosos foi genotipado e sua dieta espontânea foi avaliada tanto quanto ao conteúdo de macro quanto de micro-nutrientes. Foram encontradas diferenças na dieta relacionadas ao polimorfismo T102C. Os indivíduos TT comem uma maior quantidade e proporção de proteínas, apesar de não alterar a quantidade de calorias ingeridas. Eles ingerem mais carne vermelha todos os aminoácidos essenciais. Concluindo, através de um instrumento da genética molecular que identifica sujeitos com suscetibilidade para terem uma menor ou maior quantidade de receptores 5-HT2A, para o qual não há agonistas específicos, é possível sugerir o provável envolvimento deste receptor tanto nos mecanismos de manutenção da adição ao tabaco quanto nos de preferência alimentar.

Genética e mapeamento molecular da resistência parcial à ferrugem da folha da aveia (Avena sativa L.)

A ferrugem da folha é a moléstia de maior importância econômica para a cultura da aveia e a resistência qualitativa, geralmente utilizada para o seu controle, apresenta pouca durabilidade. A utilização de resistência parcial, caracterizada pelo progresso lento da moléstia, tem sido reconhecida como alternativa para obtenção de genótipos com resistência mais durável. Os objetivos deste trabalho foram determinar o progresso da ferrugem, o controle genético da resistência, e identificar marcadores moleculares associados a essa resistência, em várias gerações e anos. Populações F2, F3, F4, F5 e F6 do cruzamento UFRGS7/UFRGS910906 (sucetível/parcialmente resistente) (1998, 1999 e 2000) e F2 do cruzamento UFRGS7/UFRGS922003 (1998), foram avaliadas a campo quanto à porcentagem de área foliar infectada, para determinar a área sob a curva do progresso da doença (ASCPD). Mapeamento molecular, com marcadores AFLP (amplified fragment length polymorphism), foi realizado em F2 e F6, do primeiro cruzamento, identificando marcadores associados à resistência quantitativa (“quantitative resistance loci” ou QRLs). Resultados de três anos evidenciaram alta influência do ambiente na expressão da resistência, apresentando, entretanto, variabilidade genética para resistência parcial nas populações segregantes. A distribuição de freqüências do caráter ASCPD nas linhas recombinantes F5 e F6 foi contínua, indicando a presença de vários genes de pequeno efeito em seu controle. Estimativas de herdabilidade variaram de moderada a alta. O mapa molecular F2 foi construído com 250 marcadores, em 37 grupos de ligação, e o mapa F6 com 86 marcadores em 17 grupos de ligação. Cinco QRLs foram identificados na F2 e três na F6. O QRL identificado na F6, pelo marcador PaaMtt340 apresentou consistência em dois ambientes.

Herança genética e mapeamento molecular da tolerância à toxidade do alumínio em aveia (Avena sativa L.)

A toxicidade do alumínio é um fator limitante para a obtenção de maior produtividade na cultura da aveia (Avena sativa L.). O desenvolvimento de genótipos tolerantes a altos níveis de toxidez ao alumínio é uma alternativa mais barata e viável para o cultivo em solos com subsolo ácidos. Os objetivos deste estudo foram avaliar genótipos de aveia quanto à reação ao alumínio tóxico em três soluções nutritivas, bem como, determinar a ação gênica, o número de genes, a herdabilidade do caráter e identificar marcadores moleculares associados a tolerância ao alumínio tóxico em genótipos de aveia. Oito genótipos foram avaliados em soluções nutritivas quanto à tolerância ao alumínio tóxico. A utilização de solução nutritiva foi eficiente para a discriminação dos genótipos de aveia quanto à tolerância ao alumínio. Os genótipos apresentaram variabilidade, sendo classificados como tolerantes, intermediários e sensíveis. A ação gênica aditiva foi a de maior importância, tanto na análise de média de gerações de oito cruzamentos, quanto na análise de um dialélico parcial envolvendo quatro genótipos. Em oito cruzamentos para determinação do número de genes envolvidos no caráter, através da análise do recrescimento da raiz principal de plantas em solução nutritiva, a segregação foi de apenas um gene com alelos múltiplos, sendo dois para tolerância (A1 e A2) e um para sensibilidade (a). A herdabilidade da característica foi alta, evidenciando que este caráter pode ser selecionado em programas de melhoramento, nas gerações iniciais. Na análise por microssatélites e AFLP, considerando as condições avaliadas, não foram identificados marcadores moleculares associados ao caráter.

Evolução molecular Darwiniana nas proteínas relacionadas à patogênese (PRs) em plantas

Um total de 201 seqüências de DNA, de 50 espécies pertencentes a 32 gêneros e 12 famílias, foi investigado através do método da máxima verossimilhança para identificar, nas proteínas respectivas, possíveis códons nos quais estivesse ocorrendo seleção positiva. Foram considerados 15 tipos de proteínas relacionadas à patogênese (PR1-PR15), quanto a 14 modelos diferentes de seleção. Tanto quanto se possa avaliar, não há qualquer estudo disponível na literatura que tenha examinado de maneira homogênea tal número de seqüências de forma tão abrangente.

Caracterização molecular e isoenzimática de acessos de Bromus auleticus Trinius (ex-Nees)

Resumo não disponível

Caracterização fenotípica e molecular de genótipos de arroz irrigado

O presente trabalho teve como objetivo geral caracterizar a variabilidade genética existente em um grupo de genótipos de arroz irrigado do banco de germoplasma disponível no programa de melhoramento do Instituto Rio Grandense do Arroz (IRGA) e como objetivos específicos identificar marcadores morfológicos que separem os dois grupos de arroz índica e japônica, avaliar a amplitude da base genética desse germoplasma e comparar o padrão de agrupamento obtido pelos marcadores morfológicos e moleculares.

Caracterização fenotípica e molecular de genótipos de fumo utilizados no sul do Brasil

O conhecimento do germoplasma disponível permite ao melhorista de fumo planejar estrategicamente o uso de genitores visando à ampliação da variância genética nas populações segregantes. Apesar de acreditar-se que a base genética do fumo é estreita, nenhum estudo foi feito com os genótipos utilizados pelos programas de melhoramento de fumo no Sul do Brasil. Os objetivos deste trabalho foram investigar a base genética e caracterizar genótipos de fumo utilizados em programas de melhoramento no Sul do Brasil através de caracteres fenotípicos e marcadores moleculares, comparando diferentes métodos quanto à capacidade de distinção de genótipos individuais. Trinta e dois genótipos de fumo foram avaliados para 32 características fenotípicas, 271 marcadores RAPD, 86 microssatélites e 484 marcadores AFLP. Características fenotípicas e marcadores moleculares RAPD e AFLP foram eficientes para distinguir os genótipos estudados, permitindo evidenciar moderada similaridade e estreita base genética. Apesar disso, foi encontrada variabilidade para as características fenotípicas de maior importância econômica em fumo, sendo possível caracterizar individualmente os 32 genótipos através de 23 das 32 características fenotípicas avaliadas. Os genótipos K-326 LF e BY-64 divergiram dos demais e se destacaram para características de importância econômica, como rendimento, índice qualitativo de folhas, teor de nicotina e percentual de talo, sendo de grande potencial como genitores em cruzamentos elite. Foram identificados marcadores RAPD e AFLP específicos, capazes de distinguir, individualmente, os genótipos estudados. Os resultados deste estudo permitem concluir que os diferentes métodos utilizados se complementam na distinguibilidade dos genótipos e devem ser utilizados conjuntamente para o desenvolvimento de germoplasma e linhagens superiores de fumo.

Caracterização morfológica e molecular da coleção básica de trevo-branco (Trifolium repens L.)

O objetivo deste trabalhofoi avaliarcaracterísticas moleculares e morfológicasde 79 acessos pertencentes à coleção básica de trevo-branco obtida do Departamento de Agricultura dos Estados Unidos(USDA), a fim de caracterizar a variabilidade genética existente.

Variabilidade molecular na região 3'UTR do gene do receptor da lipoproteína de baixa densidade - diversidade intra e intercontinental

As origens das populações e o processo de povoamento das Américas são questões bastante controversas e, por isso, têm sido amplamente estudadas. O gene LDLR (low density lipoprotein receptor), que está localizado no braço curto do cromossomo 19 (p13.1-p13.3) e possui 18 éxons, bem como uma porção 3’UTR onde ocorrem dois elementos Alu completos (chamados de U e D) e um parcial, foi escolhido para esclarecer esses e outros problemas de evolução e variação genética humana. O objetivo geral deste trabalho foi verificar o que esta região hipervariável, especificamente na sua porção U, nos indicaria sobre a história evolutiva das populações ameríndias. Para este trabalho foram analisadas amostras de DNA de indivíduos nativos da Mongólia (n=24), da Sibéria (n=26), das Américas do Norte (n=11), Central (n=26) e do Sul (n=16), totalizando 14 populações e 103 indivíduos. Essas amostras foram amplificadas pela técnica de PCR (polymerase chain reaction), utilizando-se primers específicos para o segmento hipervariável U e, posteriormente, foram elas seqüenciadas automaticamente. Quatorze sítios polimórficos foram encontrados, classificáveis em sete haplótipos, sendo que o sítio 3809 apresentou uma transversão de C para G não descrita na literatura. A estimativa geral de diversidade nucleotídica (π) foi de 0.62%, considerada alta para um marcador autossômico. Verificou-se uma certa uniformidade haplotípica entre a Ásia e a América, mas com a diferenciação maior ocorrendo entre a Mongólia e a América+Sibéria. Não foi detectada diferenciação significativa entre nativos sul e centro-americanos. De um modo geral, o estudo desse marcador confirmou uma provável origem asiática para as populações ameríndias e apoiou a hipótese de uma única onda de migração no processo de povoamento pré-histórico das Américas.

Análise molecular de indivíduos com doença de Machado-Joseph

As ataxias espinocerebelares (SCAs) constituem um grupo de doenças neurodegenerativas fatais que apresentam uma grande heterogeneidade clínica. A doença de Machado-Joseph (DMJ), ou ataxia espinocerebelar tipo 3 (SCA3), é causada por uma expansão de uma seqüência repetitiva CAG em um gene, denominado MJD1, localizado no braço longo do cromossomo 14, expansão codificadora de uma seqüência poliglutamínica constituinte da proteína ataxina 3. Indivíduos normais apresentam entre 12 a 41 repetições, enquanto indivíduos afetados apresentam 61 a 84 repetições CAGs neste gene. Este trabalho teve como objetivos principais a padronização de metodologias moleculares para o identificação e a quantificação do número de repetições CAG no gene responsável pela da DMJ. Um grupo de 112 pacientes, pertencentes a 77 famílias, com suspeita clínica de algum tipo de ataxia espinocerebelar foi avaliado no Hospital de Clínicas de Porto Alegre. Após a extração de DNA destes pacientes, este material foi amplificado por PCR utilizando oligonucleotídeos iniciadores específicos para a região de interesse e posterior transferência destes fragmentos (1) para uma membrana de nylon pelo método de Southern blot, visando ao estabelecimento de um protocolo não-radioativo para detectar a presença do alelo normal e/ou mutante; e (2) análise em gel de poliacrilamida para quantificação do número de repetições presentes no alelo mutante. As análises laboratoriais identificaram um total de 77 pacientes com uma expansão CAG no gene da MJD1. Considerando-se apenas indivíduos não relacionados, a freqüência encontrada foi de 61% (47 indivíduos). Os protocolos estabelecidos demonstraram-se bastante eficazes e sensíveis para o diagnóstico da DMJ e quantificação do alelo expandido da respectiva doença.

Análise citogenética e molecular em milho (Zea mays subsp. mays), teosinto (Zea mays susp. mexicana) e em seus híbridos

O milho é um planta anual cultivada em quase todo o mundo, consumida como ração para animais e na alimentação humana através de produtos industrializados e in natura. Existem diversos programas de melhoramento de milho no Brasil, mas no Sul são poucos os grupos que trabalham com este cereal. O desenvolvimento de populações tem sido efetuado por instituições de pesquisas, enquanto híbridos têm sido feito por companhias privadas. A variabilidade genética num programa de melhoramento assume uma grande importância, já que é o ponto de partida para o progresso genético. Em Algumas espécies, a variabilidade genética torna-se estreita a cada ciclo de seleção, diminuindo futuros progressos genéticos. Uma alternativa de ampliar a variabilidade é através de cruzamentos amplos com espécies silvestres. Estudos indicam que as espécies de teosinto são uma potencial fonte de variabilidade para importantes características agronômicas. Porém, o desenvolvimento de variedades de milho bem adaptadas, com boas características agronômicas e de rendimento, oriundas de cruzamentos com espécies silvestres necessita de um amplo estudo genético, molecular e citogenético. O objetivo deste trabalho foi caracterizar a variabilidade genética em genótipos de milho e teosinto através de marcadores moleculares e analisar a nível citogenético as populações de milho, teosinto e seus híbridos. Foi detectada variabilidade genética nas populações de milho e teosinto, sendo a população de teosinto a que apresentou maior variabilidade. Os genótipos de milho e teosinto apresentaram uma alta estabilidade meiótica, enquanto os híbridos entre milho e teosinto tiveram associações de univalentes, aderência de cromossomos, pontes e menor freqüência de quiasmas. Os resultados foram suficientes para indicar que é possível utilizar o teosinto como fonte genética em programas de melhoramento de milho.

Variabilidade genética em populações ameríndias e asiáticas : região 16p13.3 e inserções Alu

Um estudo envolvendo populações asiáticas e ameríndias foi realizado para avaliar os relacionamentos históricos e genéticos entre eles através de polimorfismos moleculares autossômicos. Um deles é uma seqüência polimórfica localizada na região 16p13.3. Um total de 1558 pares de base foram investigados em 98 indivíduos da Mongólia, Beringia e das Américas. Estes resultados foram comparados com aqueles obtidos em uma prévia investigação por outros autores. Cinqüenta e cinco sítios polimórficos foram classificados em trinta e cinco haplótipos. Uma árvore de haplótipos (median joining network) baseada neles, revelou dois grupos distintos, um mais compacto com haplótipos derivados das cinco categorias etno-geográficas estabelecidas; enquanto o outro, com haplótipos mais divergentes, era composto principalmente por africanos e ameríndios. Quase todos os parâmetro de neutralidade apresentaram valores negativos. Simulações realizadas para interpretar estes resultados foram executadas com dois conjuntos de dados: um composto exclusivamente de ameríndios e outro com populações mundiais. O primeiro, sugerindo crescimento e declínio populacional, rejeitou os cenários com crescimento abaixo de cinco vezes e anteriores a ~18 mil anos atrás; enquanto que o segundo, sugerindo crescimento populacional, não rejeitou cenários nos quais a magnitude de crescimento foi maior que dez vezes e anteriores a ~21 mil anos atrás, provavelmente refletindo um crescimento antigo fora da África. Doze polimorfismos de inserções Alu foram também estudados em 170 indivíduos pertencentes a 7 grupos nativos sul-americanos, 60 a dois siberianos, e 91 a dois mongóis. Estes dados foram integrados com aqueles de 488 indivíduos associados a outros 13 grupos, para determinar as relações entre asiáticos, Beringianos e ameríndios. Nestes três grupos, foi observado um decréscimo da heterozigosidade e da quantidade de fluxo gênico, na mesma ordem indicada acima. A solidez destas subdivisões foi demonstrada nas distâncias genéticas, nas análises de componentes principais, de variância molecular, no teste de Mantel, e numa abordagem Bayesiana de atribuição genética. Entretanto, não pode ser observada uma clara estrutura entre os nativos Sul-americanos, indicando a importância dos fatores dispersivos (deriva genética, efeito fundador) na sua diferenciação. A congruência dos resultados obtidos com os dois marcadores são: (a) não foi confirmada uma história de declínio populacional forte associado com a chegada do homem pré-histórico nas Américas; (b) os ameríndios não apresentaram estruturação clara dentro do continente e não se diferenciaram dos asiáticos do nordeste da Ásia (beringianos); e (c) o povo Aché foi o grupo mais divergente.

Um estudo clínico, bioquímico, histoquímico e genético-molecular de pacientes com doenças do DNA mitocondrial

Introdução: As doenças mitocondriais apresentam características heterogêneas devido à própria natureza e função da mitocôndria, que possui o seu próprio DNA (mtDNA). A disfunção mitocondrial pode afetar um único órgão ou ser uma doença multissistêmica, de manifestação na infância ou na vida adulta, podendo ter um padrão de herança materna ou mendeliana. O diagnóstico é complexo e requer uma investigação criteriosa, passo-a-passo, com atenção a história clínica, exames laboratoriais, neuroimagem e, muitas vezes, a biópsia muscular para análise histoquímica, bioquímica e genética. A análise molecular é fundamental na definição do diagnóstico e os protocolos propostos até o momento são, geralmente, direcionados para um grupo de pacientes com características clínicas homogêneas. Objetivos: os objetivos deste trabalho foram: a) propor um protocolo combinando dados clínicos e laboratoriais para indicar a melhor forma de investigação molecular de pacientes com suspeita clínica de doença do DNA mitocondrial, b) Comparar os achados clínicos e laboratoriais nos pacientes com e sem mutação no mtDNA, c) avaliar quais são os fatores clínicos preditivos de mutação no mtDNA que podem ser utilizados como sinalizadores para o médico decidir quando deve ser realizado um procedimento diagnóstico invasivo e de alto custo, c) estimar a proporção de mtDNA mutado, através da técnica PCR em tempo real em um grupo de pacientes com deleção, correlacionando com a idade de início dos sintomas e gravidade de manifestações clínicas, d) relatar achados de RNM com espectroscopia por emissão de prótons em pacientes com deleção no mtDNA. Pacientes, material e métodos: Foram selecionados, no ambulatório de doenças mitocondriais do HCPA, 43 pacientes com suspeita clínica de doença mitocondrial. Esse pacientes foram submetidos à análise, por etapas, de 5 mutações de ponto no mtDNA de leucócitos, de deleção no mtDNA de músculo e ao sequenciamento do tRNAleu e tRNAlys. Os pacientes com resultados positivos e negativos para mutações do mtDNA foram então comparados em relação às suas características clínicas e laboratoriais. Foram selecionados 11 pacientes para a determinação da percentagem relativa de deleção do mtDNA no tecido muscular e 3 pacientes para a descrição da RNM com espectroscopia. Resultados – Foram encontradas mutações no mtDNA em 17 pacientes (39.9%) distribuídas da seguinte forma: 4 pacientes com MELAS (A3243G), 1 paciente com síndrome de Leigh (T8993C) e 12 pacientes com deleções no mtDNA. As características significativamente mais freqüentes no grupo de pacientes com mutação no mtDNA comparados com os demais foram: miopatia (p=0,032), retinopatia pigmentar (p=0,007), oftalmoplegia e ptose (p=0,002), baixa estatura (p=0,04), hipotrofismo (p=0,033) e acidose lática (p=0,006). A quantificação do mtDNA pela técnica de PCR em tempo real foi realizada em 11 amostras de músculo de pacientes com deleção no mtDNA e com diferentes manifestações clínicas. Não houve correlação entre a percentagem relativa de deleção no mtDNA com os fenótipos clínicos (PEO, KSS e encefalomiopatia associado à doença multissistêmica), bem como com a idade de início das manifestações clínicas. A RNM com espectroscopia por emissão de prótons realizada em três pacientes com deleção no mtDNA associada a um quadro clínico não clássico mostrou achados distintos para cada paciente, sendo comum a todos as lesões cerebrais e a presença do pico invertido de lactato. Conclusões - A criteriosa seleção clínica e laboratorial se mostrou apropriada e o protocolo empregado se mostrou eficiente, uma vez que a mutação no mtDNA pode ser detectada em 17 dos 43 pacientes com suspeita de doença mitocondrial. Os pacientes positivos para deleção no mtDNA apresentaram algumas características clínicas preditivas para doença do mtDNA, o que pode ser importante na indicação de um procedimento invasivo (biópsia muscular) e de alto custo. A técnica e PCR em tempo real pode ser utilizado para quantificar a percentagem relativa de mtDNA deletado, porém para o diagnóstico das deleções, essa técnica deve ser realizada de forma complementar à técnica tradicional (Southern blot). O número amostral ainda é pequeno para correlacionar a quantidade relativa de mtDNA deletado com as síndromes mitocondriais clássicas e não clássicas. A RNM com espectroscopia por emissão de prótons, por possibilitar a detecção do lactato cerebral, parece ter utilidade na avaliação clínica de pacientes com suspeita clínica de doença mitocondrial, mesmo quando o quadro não é clássico.