Padrões de atividade da ornitina decarboxilase (ODC) e sua regulação hormonal sob estresse de temperatura em Anastrepha fraterculus (Diptera, Tephritidae)

Ornitina decarboxilase (ODC) (EC 4.1.1.17) é a primeira enzima que desencadeia a síntese das poliaminas putrescina, espermidina e espermina nas células. As poliaminas são cátions alifáticos envolvidos no controle de crescimento e são requeridas para uma variedade de eventos biológicos como síntese de proteína, replicação do DNA e divisão celular. No presente estudo, a atividade da ODC foi medida em ovo, larva, pupa, fêmea jovem e adulta de Anastrepha fraterculus. Durante o desenvolvimento de A. fraterculus, a atividade da ODC apresentou flutuações. Entre os estágios anteriores à emergência, o ovo teve a mais alta atividade específica, provavelmente devido à embriogênese que é caracterizada pela alta taxa de divisão celular. A atividade da ODC foi também altamente significativa em ovários e corpo gorduroso de fêmeas jovens possivelmente devido ao avanço da oogênese e vitelogênese. Parâmetros cinéticos (Km app e Vmax) para atividade da ODC foram determinados em pupa, larva e ovário de fêmeas jovens e apresentaram grande variação. A guanosina trifosfato (GTP) demonstrou afetar grandemente estes parâmetros cinéticos, sugerindo estarem ocorrendo modificações pós-traducionais. Fêmeas jovens (4 dias) de A. fraterculus também foram analisadas quanto ao efeito do estresse de temperatura (6ºC e 20/6ºC) e da aplicação tópica do hormônio juvenil isolados ou em conjunto. . Os principais resultados foram que a concentração de 500 ng e os tempos de incubação de 3, 7 e 18 horas aumentaram a atividade da ODC. As fêmeas mantidas a 6ºC e 20/6ºC tiveram atividade da ODC mais alta do que as fêmeas mantidas a 25ºC. O tempo de incubação de 1 hora com o HJ aumentou a atividade da ODC no tratamento de 6ºC, quando comparado com fêmeas mantidas apenas com o estresse de temperatura sem a adição do hormônio (controle). No entanto, no tratamento das fêmeas mantidas a 20/6ºC, somente os tempos de 3 e 18 horas de incubação com o HJ demonstraram aumento na atividade da ODC quando comparadas com o tempo de incubação de 1 hora e com as fêmeas mantidas sem a adição do hormônio (controle). Os machos não apresentaram diferença na atividade da ODC quando submetidos ao estresse de temperatura de 6ºC, mas as medidas do apódema ejaculatório foram maiores a 25ºC que a 6ºC. Estes resultados podem ser considerados como parte de um processo adaptativo a mudanças ambientais. Por último, observamos que as medidas dos ovários (comprimento e largura) de fêmeas jovens mantidas com o inibidor da ODC, -difluormetilornitina (-DFMO; 50mM) são diferentes significativamente quando comparadas com às medidas das fêmeas controle sem o inibidor. O conjunto desses resultados indica a importância da relação entre ODC, HJ e estresse de temperatura para a A. fraterculus. Como esta mosca é uma das piores pragas para a fruticultura brasileira, estes dados, além de contribuírem para um maior conhecimento de sua biologia básica, poderão também ser usados para a escolha de melhores estratégias de controle populacional.

Detecção de cinco novas mutações em pacientes brasileiros com gangliosidose GM1

A Gangliosidose GM1 é um Erro Inato do Metabolismo (EIM) causado pela deficiência da enzima B-galactosidase ácida. Essa doença é caracterizada pelo acúmulo de metabólitos não degradados, principalmente gangliosídeo GM1, nos lisossomos de vários tipos celulares. Baseado na idade de início e na atividade residual da enzima, a Gangliosidose GM1 é classificada em três diferentes tipos: infantil, juvenil e adulto. O gene da B-galactosidase ácida (GLB1, GeneBank M27507) está situado no cromossomo 3 e possui mais de 60 kb, contendo 16 exons. Cerca de 50 mutações associadas à doença estão descritas na literatura. No sul do Brasil, há uma alta freqüência dessa doença (1:17.000 nascidos vivos). Neste trabalho, vinte pacientes diagnosticados no Hospital de Clínicas de Porto Alegre (Brasil) tiveram o gene GLB1 investigado por SSCP (Single Strand Conformational Polymorphism) usando DNA extraído de sangue periférico. Através desta triagem foram encontradas 52 alterações de mobilidade do DNA, indicando a presença de mutações. As amostras relativas aos exons 2 e 15 foram submetidas a sequenciamento direto com seqüenciador ABI31O(Applied Biosystens) utilizado kit BigDye 3.1. Cinco novas mutações no gene GLB1 (F63Y, R38G, Y36S, Y64F e R59C) e duas mutações já descritas (R59H e 1622-1627insG) foram encontradas. Este trabalho possibilitou a genotipagem completa de 6 pacientes e parcial de 5, e direcionou a investigação de mutações, contribuindo diretamente no diagnóstico da enfermidade e permitindo a realização de estudos de correlação genótipo/fenótipo destes pacientes.

Polineuropatia do diabetes mellitus : caracterização clínica e padronização de testes autonômicos e somáticos

A neuropatia diabética é a complicação mais freqüente do Diabetes Mellitus. Sua natureza ubíqüa, atingindo praticamente todo o organismo, a multiplicidade de técnicas de diagnóstico descritas tendem a dificultar o seu estudo. No presente trabalho, nos detivemos no diagnóstico de neuropatia autonômica e da polineuropatia sensitiva somática. No que concerne a neuropatia autonômica buscou-se: 1) Padronizar em indivíduos normais os testes para o diagnóstico de neuropatia autonômica cardiovascular utilizando um método de registro eletrônico das respostas autonômicas desenvolvida em nosso laboratório e avaliar a resposta aos mesmos testes em um grupo de pacientes diabéticos. Foram estudados 111 indivíduos hígidos e 143 portadores de Diabetes Mellitus dos quais foram avaliadas as respostas da freqüência cardíaca à respiração profunda, à posição supina e à manobra de Valsalva, e a resposta da pressão arterial à posição supina e ao handgrip sustentado. Foram observadas: forte correlação positiva entre os resultados obtidos com o método computadorizado e o método tradicional; as respostas da freqüência cardíaca e da pressão arterial de homens e mulheres não diferiram; houve correlação entre a idade dos indivíduos e a resposta da freqüência cardíaca ao assumir a posição supina (r= - 0.47, p< 0.001) e à respiração profunda (r= -0.43; p< 0.001). Respostas anormais da pressão arterial à posição supina foram usualmente observadas somente em diabéticos com neuropatia autonômica definida e grave. 2) Utilizando um delineamento transversal buscou-se identificar a relação entre a presença de sintomas usualmente relacionados a disfunção do sistema autonômico bem como outras complicações crônicas do Diabetes Mellitus com três graus objetivamente definidos de disfunção autonômica (NA). Os sintomas foram avaliados através de um questionário aplicado a 132 diabéticos (38 portadores de Diabetes Mellitus Insulino Dependente e 94 Não insulino Dependente), 65 sem e 67 com Neuropatia Autonômica. A neuropatia autonômica foi classificada conforme os 5 testes cardiovasculares autonômicos descritos no item 1: 1) neuropatia Incipiente: 1 teste anormal (n= 27); 2) neuropatia definida: 2 ou 3 testes anormais(n=26); neuropatia grave- 4 a 5 testes anormais (n=14). Foi observada uma significativa associação entre o grau de envolvimento autonômico e a presença de sintomas. A presença de 2 ou mais dentre 7 sintomas autonômicos teve sensibilidade de 93% e especificidade de 89% para o diagnóstico de neuropatia autonômica grave. Na avaliação da polineuropatia sensitiva somática, buscou-se: 1) Avaliar o desempenho de três métodos (número de erros quando o monofilamento de Semmes-Weinsten 5.07 foi aplicado em 54 sítios plantares de ambos os pés, limiar de sensibilidade vibratória na região plantar do primeiro dedo do pé e presença de sintomas de neuropatia periférica usando o escore de sintomas desenvolvido pela Universidade de Michigan) para o diagnóstico e estadiamento da polineuropatia diabética (PND). Os resultados foram comparados com a condução nervosa (padrão-ouro) em 6 nervos dos membros inferiores. Para tanto foram estudados em 26 indivíduos normais e 30 diabéticos (20 Não Insulino Dependente e 10 Insulino Dependente). Conforme o número de nervos com condução anormal os pacientes foram classificados em 4 grupos: a) sem PND: quando a condução nervosa estava normal em pelo menos 5 nervos; b) PND Grau 1: quando havia distúrbio da condução em 2 a 3 nervos, c) PND Grau 2: com 4 a 5 nervos afetados, e d) PND Grau 3: quando os 6 nervos estudados mostravam anormalidades. O desempenho dos métodos para o diagnóstico destes graus de PND foi estudado através de curvas ROC (Receiver Operator Characteristics). Os três métodos se mostraram igualmente adequados para o diagnóstico de PND grau 3. O monofilamento teve um alto grau de sensibilidade e especificidade também para o diagnóstico de PND grau 2 sendo estatisticamente melhor do que os outros métodos. A variabilidade do teste do monofilamento foi menor do que a da determinação do Limiar de Sensibilidade Vibratória. 3) Em uma amostra de pacientes com Diabetes Mellitus buscou-se caracterizar os aspectos clínicos da neuropatia sensitiva somática diagnosticada conforme a resposta ao monofilamento de Semmes-Weinstein. Cento e quatorze pacientes diabéticos (46 Insulino Dependente, 68 Não Insulino Dependente) foram avaliados para a presença de polineuropatia periférica com o monofilamento de Semmes-Weinsten 5.07. Conforme o número de erros os pacientes foram classificados em 3 grupos de neuropatia somática: grupo 1: até 2 erros; grupo 2: de 2,5 a 5 erros; e grupo 3: acima de 5,5 erros. A proporção de pacientes em cada grupo foi 37,71% no grupo 1,17,54% no grupo 2 e 44,73% no grupo 3. Houve correlação entre o número de sintomas e o número de erros na estesiometria (r= 0,48 p<0,0001). No grupo classificado como polineuropatia diabética grau 3, quando comparado com o 1 e 2, houve maior prevalência neuropatia autonômica, hipertensão arterial sistêmica, nefropatia, retinopatia, ulcerações e amputações, bem como, maior número de sintomas de neuropatia. Os estudos consolidaram técnicas de diagnóstico de neuropatia diabética somática e autonômica para o uso em estudos epidemiológicos, terapêuticos e seguimento clínico dos pacientes diabéticos.