Expressão de uma quitinase de Metarhizium anisopliae em Nicotiana tabacum : obtenção de plantas transgênicas resistentes a doenças fúngicas

A resistência a doenças em plantas transgênicas tem sido obtida por meio da expressão de genes isolados de bactérias, fungos micoparasitas e plantas. Neste trabalho, relatamos a utilização de um gene do fungo entomopatogênico Metarhizium anisopliae como modo de gerar resistência a doenças fúngicas em plantas. O gene chit1 codifica a quitinase CHIT42 (EC 3.2.1.14), pertencente a uma classe de glicosil-hidrolases capazes de converter quitina em oligômeros de N-acetil-glicosamina (NAcGlc). Quando presentes em tecidos vegetais, supõese que as quitinases ataquem especificamente a parede celular de fungos invasores, provocando danos às hifas e causando a morte por lise das células fúngicas. Deste modo, dois diferentes grupos de plantas transgênicas de Nicotiana tabacum foram produzidos: no primeiro deles, denominado chitplus, os indivíduos possuem o gene chit1 sob o controle do promotor CaMV 35S. O segundo grupo, demoninado chitless, consiste de plantas transformadas com um T-DNA não contendo o gene do fungo. Trinta e quatro plantas transgênicas resistentes à canamicina (17 de cada grupo) foram regeneradas a partir de discos de folhas infectados por Agrobacterium tumefaciens. A produção da quitinase em extratos protéicos de folhas foi analisada por zimogramas em SDS-PAGE contendo glicol-quitina e corados por calcoflúor branco, na forma de um screening dos transgênicos primários. As plantas transgênicas foram testadas, ainda, por meio de ensaios colorimétricos empregando oligômeros sintéticos de NAcGlc como substratos específicos, além de immunoblot e Western blot com soro anti-quitinase. A quantidade de enzima recombinante nas plantas chitplus variou desde nenhuma atividade detectável a elevados níveis de expressão da enzima. A hibridização de Southern blot demonstrou que o número de cópias do gene chit1 integradas no genoma vegetal foi estimado entre uma e quatro. A primeira geração de plantas transgênicas geradas por autofecundação de parentais portadores de duas cópias do transgene foi testada com relação à estabilidade da herança do transgene e em 43 de um total de 67 descendentes, originados de quatro cruzamentos independentes, o padrão de segregação não diferiu das proporções Mendelianas esperadas. Ensaios de resistência, desafiando as plantas transgênicas com o basidiomiceto Rhizoctonia solani foram realizados e uma evidente diminuição da área foliar contendo lesões fúngicas foi observada entre as linhagens transgênicas, embora variações na atividade quitinolítica tenham influenciado o nível de resistência. Nossos resultados sugerem uma relação direta entre a atividade específica de quitinase e ao aumento nos níveis de resistência às lesões causadas pela infecção por R. solani.

Biorremediação de antraceno, fenantreno e pireno em um argissolo

O antraceno, o fenantreno e o pireno são hidrocarbonetos aromáticos policíclicos (HAPs) que podem ser carcinogênicos e que não são degradados pela maioria dos microrganismos do solo. A biorremediação é uma estratégia para eliminação dos HAPs, que pode demandar a inoculação de microrganismos degradadores e a modificação das condições químicas e físicas do solo. O objetivo do presente estudo foi isolar, identificar e caracterizar microrganismos degradadores e mineralizadores de antraceno, fenantreno e pireno em meio mineral e no solo, assim como avaliar a influência do pH e da disponibilidade de água, N, P, Fe e S na biorremediação de um solo contaminado com antraceno. Seis amostras de solo de landfarming foram inoculadas individualmente a um solo contaminado em laboratório com antraceno. Após 176 dias, o solo com maior produção de C-CO2 foi utilizado para o enriquecimento em meio mineral mais antraceno. Os microrganismos foram isolados e identificados pelo seqüenciamento do gene do RNAr. A capacidade dos microrganismos em degradar os 3 HAPs no meio mineral e no solo foi avaliada por cromatografia gasosa. A mineralização de diferentes concentrações de antraceno, fenantreno e pireno no solo foi avaliada por respirometria, assim como o efeito de diferentes doses de N, P, S e Fe, de diferentes pH e umidades do solo na mineralização do antraceno. Isolou-se do solo de landfarming um consórcio microbiano composto por 6 bactérias, identificadas como Mycobacterium fortuitum, Bacillus cereus, Microbacterium sp., Gordonia polyisoprenivorans, Microbacteriaceae bacterium e Naphthaleneutilizing bacterium, e um fungo, Fusarium oxysporum. O consórcio microbiano degradou respectivamente 48, 67 e 22% do antraceno, fenantreno e pireno do meio mineral. No solo o consórcio degradou, em média, mais de 92% e mineralizou mais de 78% das diferentes concentrações destes 3 HAPs em 70 dias. As maiores mineralizações do antraceno ocorreram nos solos com as maiores umidades gravimétricas (12,5%) e pH (7,5). A adição de 100 kg ha-1 ou mais de nitrogênio no solo e a conseqüente redução da relação C:N para valores inferiores a 67:1 diminuíram a mineralização do antraceno no solo. O aumento da disponibilidade do fósforo, do ferro e do enxofre e a presença de amplas relações C:P (1076:1 a 50:1) e C:N:P (1076:16:1 a 50:1,3:1) no solo não influenciaram a mineralização do antraceno. Conclui-se que a seleção e a inoculação ao solo de microrganismos degradadores de HAPs, associado a modificação das condições ambientais, pode conduzir a um eficiente processo de biorremediação, onde a grande maioria dos HAPs é mineralizada em curto período de tempo.

Caracterização de um peptídeo antimicrobiano produzido por linhagem de Bacillus amyloliquefaciens isolada de solo

Em anos recentes, surgiram numerosos casos de intoxicação alimentar envolvendo patógenos emergentes. Estes casos levaram a um aumento da preocupação com a preservação dos alimentos minimamente processados e com a segurança alimentar. Este fato está induzindo a pesquisa por inibidores para estes patógenos e fatores para prolongar a vida de prateleira de produtos alimentícios. Entre as novas alternativas na preservação está a utilização de peptídeos antimicrobianos produzidos por bactérias. No presente trabalho uma bactéria identificada como Bacillus amyloliquefaciens LBM 5006 isolada de solos de mata Atlântica de Santa Catarina foi selecionada dentre outros microrganismos e sua capacidade de produzir antimicrobianos foi avaliada. O extrato bruto da cultura do isolado LBM 5006 foi caracterizado, sendo ativo contra importantes bactérias patogênicas e deteriorantes como Listeria monocytogenes, Bacillus cereus, Erwinia carotovora, Escherichia coli, dentre outras. Houve maior produção do antimicrobiano quando a bactéria foi propagada em caldo infusão de cérebro e coração (BHI) a 37o C durante 48 h. Após concentração, a atividade antimicrobiana resistiu ao tratamento com enzimas proteolíticas. A atividade antimicrobiana foi verificada em pHs ácidos, sendo inibida em pH 9 e 10. O extrato foi purificado por meio de cromatografia de gel filtração e extração com butanol. O teste qualitativo de ninidrina, juntamente com a espectroscopia de infravermelho e ultravioleta, feitos com a substância purificada revelou que o antimicrobiano possui natureza protéica. O antimicrobiano apresentou um efeito bacteriostático contra 106 UFC/mL de Listeria monocytogenes na concentração de 25 AU/ml.