Transformação genética em cevada por bombardeamento de partículas

A presente Tese de Doutorado objetivou: (1) definir um método eficiente de transformação genética, por bombardeamento de partículas, para a obtenção de plantas transgênicas de cultivares brasileiras de cevada e (2) identificar gene(s) codificante(s) de quitinase(s) potencialmente capaz(es) de conferir resistência ao fungo patogênico de cevada Bipolaris sorokiniana. Culturas de calos obtidos a partir de escutelos imaturos das cultivares Brasileiras de cevada MN-599 e MN-698 (Cia. de Bebidas das Américas, AMBEV) foram bombardeadas com partículas de tungstênio e avaliadas quanto à expressão do gene repórter gusA através de ensaios histoquímicos de GUS e quanto ao efeito dos bombardeamentos na indução estruturas embriogênicas e regeneração de plantas. As condições de biobalística analisadas incluíram a região promotora regulando a expressão de gusA, tipo e pressão de gás hélio de dois aparelhos de bombardeamento, distância de migração das partículas, número de tiros e a realização de pré e pós-tratamento osmótico dos tecidos-alvo. No presente trabalho foram obtidos um número bastante alto de pontos azuis por calo, a indução de calos embriogênicos e embriões somáticos em uma freqüência de até 58,3% e a regeneração de 60 plantas, sendo 43 de calos bombardeados. As melhores condições observadas foram o promotor e primeiro íntron do gene Adh de milho (plasmídeo pNGI), o aparelho de bombardeamento “ Particle Inflow Gun” (PIG) utilizando-se a distância de migração de partículas de 14,8 cm, dois tiros disparados por placa e a realização de tratamento osmótico dos explantes com 0,2 M de manitol e 0,2 M de sorbitol 4-5 horas antes e 17-19 horas depois dos bombardeamentos. Das 43 plantas obtidas de calos bombardeadas, 3 apresentaram atividade de GUS na base das suas folhas. A utilização de primers sintéticos definidos a partir de genes de quitinases descritos na literatura em PCRs resultou na amplificação de dois fragmentos de aproximadamente 700 e 500 pb a partir de DNA total das cvs. MN-599 e MN-698 de cevada e um fragmento, com aproximadamente 500 pb, a partir do DNA total do isolado A4c de Trichoderma sp. Estes fragmentos foram purificados dos géis de agarose e diretamente seqüenciados de forma manual e automática. Os fragmentos de 700 e 500 pb amplificados do genoma da cultivar MN-599 foram identificados como genes de quitinases de cevada e o fragmento de 500 pb do isolado A4c de Trichoderma sp. não apresentou homologia com seqüências conhecidas de quitinases depositadas no EMBL/GenBank. A utilização de novos pares de primers, representando seqüências conservadas de quitinases do fungo Metarhizium anisopliae, resultou na amplificação de 3 fragmentos a partir do DNA total do isolado A4b de Trichoderma sp., que estão sendo purificados para realização de seqüenciamento.

QFD aplicado em uma metodologia para avaliação da satisfação de clientes em uma cadeia logística

Este trabalho apresenta uma metodologia para avaliação da satisfação de clientes em uma cadeia logística, que visa buscar a melhoria dos serviços logísticos. A metodologia utiliza técnicas estatísticas, técnicas de pesquisa de mercado e técnica de análise de decisão. A técnica de análise de decisão utilizada nesta metodologia é o Desdobramento da Função Qualidade (QFD) aplicada para planejar melhorias no serviço logístico, priorizando as características do serviço demandadas pelos clientes e os indicadores de desempenho para o mesmo. A aplicação desta metodologia em uma empresa do ramo alimentício resultou na confirmação da metodologia proposta como instrumento de apoio na elaboração de planos de melhorias para sistemas logísticos.

Expressão de uma quitinase de Metarhizium anisopliae em Nicotiana tabacum : obtenção de plantas transgênicas resistentes a doenças fúngicas

A resistência a doenças em plantas transgênicas tem sido obtida por meio da expressão de genes isolados de bactérias, fungos micoparasitas e plantas. Neste trabalho, relatamos a utilização de um gene do fungo entomopatogênico Metarhizium anisopliae como modo de gerar resistência a doenças fúngicas em plantas. O gene chit1 codifica a quitinase CHIT42 (EC 3.2.1.14), pertencente a uma classe de glicosil-hidrolases capazes de converter quitina em oligômeros de N-acetil-glicosamina (NAcGlc). Quando presentes em tecidos vegetais, supõese que as quitinases ataquem especificamente a parede celular de fungos invasores, provocando danos às hifas e causando a morte por lise das células fúngicas. Deste modo, dois diferentes grupos de plantas transgênicas de Nicotiana tabacum foram produzidos: no primeiro deles, denominado chitplus, os indivíduos possuem o gene chit1 sob o controle do promotor CaMV 35S. O segundo grupo, demoninado chitless, consiste de plantas transformadas com um T-DNA não contendo o gene do fungo. Trinta e quatro plantas transgênicas resistentes à canamicina (17 de cada grupo) foram regeneradas a partir de discos de folhas infectados por Agrobacterium tumefaciens. A produção da quitinase em extratos protéicos de folhas foi analisada por zimogramas em SDS-PAGE contendo glicol-quitina e corados por calcoflúor branco, na forma de um screening dos transgênicos primários. As plantas transgênicas foram testadas, ainda, por meio de ensaios colorimétricos empregando oligômeros sintéticos de NAcGlc como substratos específicos, além de immunoblot e Western blot com soro anti-quitinase. A quantidade de enzima recombinante nas plantas chitplus variou desde nenhuma atividade detectável a elevados níveis de expressão da enzima. A hibridização de Southern blot demonstrou que o número de cópias do gene chit1 integradas no genoma vegetal foi estimado entre uma e quatro. A primeira geração de plantas transgênicas geradas por autofecundação de parentais portadores de duas cópias do transgene foi testada com relação à estabilidade da herança do transgene e em 43 de um total de 67 descendentes, originados de quatro cruzamentos independentes, o padrão de segregação não diferiu das proporções Mendelianas esperadas. Ensaios de resistência, desafiando as plantas transgênicas com o basidiomiceto Rhizoctonia solani foram realizados e uma evidente diminuição da área foliar contendo lesões fúngicas foi observada entre as linhagens transgênicas, embora variações na atividade quitinolítica tenham influenciado o nível de resistência. Nossos resultados sugerem uma relação direta entre a atividade específica de quitinase e ao aumento nos níveis de resistência às lesões causadas pela infecção por R. solani.

Dinamicização da distribuição do ônus da prova no processo civil brasileiro

Esta dissertação tem como objetivo principal analisar o cabimento, no direito processual brasileiro, de uma distribuição dinâmica das regras do ônus da prova. Na primeira parte, são analisados o conceito, o objeto e a finalidade da prova, com apontamento da distinção entre fontes e meios. Após, são estudados o conceito de ônus da prova e sua distinção da obrigação, dando ênfase aos seus aspectos objetivo e subjetivo e às principais teorias, antigas e modernas, que tratam dos critérios para a distribuição do ônus da prova. Estudou-se, em seguida, os principais fenômenos relacionados ao ônus da prova, quais sejam a distribuição, cuja regra geral está no art. 333 do CPC, e a redistribuição como gênero, tendo com espécies a redistribuição strictu sensu, cabível em casos de probatio diabolica e em excepcionais casos em que a prova se apresenta difícil por fatores externos ao processo, e a inversão, cujo exemplo, no direito pátrio, é o art. 6o, inc. VIII, do CDC. Na segunda parte do trabalho, são apresentadas duas novas teorias sobre a distribuição do ônus da prova: a visão solidarista do ônus da prova e a teoria dinâmica dos ônus probatórios. Por fim, ante a necessidade de flexibilização das atuais regras gerais de distribuição do ônus da prova e, ao mesmo tempo, controle do excessivo subjetivismo judicial, analisa-se o cabimento da aplicação da teoria dinâmica no direito brasileiro, apontando-se os parâmetros para a decisão judicial que a aplique. Do estudo, concluiu-se que o direito processual brasileiro admite a aplicação da teoria dinâmica dos ônus probatórios em face da incidência do princípio da igualdade, dos poderes instrutórios do juiz e do dever de lealdade, boa-fé e colaboração das partes. Concluiuse, ainda, que embora possa acontecer em momento diverso, o momento mais oportuno para a ocorrência da redistribuição do ônus da prova é a audiência preliminar, não podendo se verificar, em nenhuma hipótese, surpresa às partes, sob pena de ferimento ao princípio do contraditório. Quanto à decisão judicial que aplica a teoria dinâmica, deve esta levar em conta que tal aplicação é de caráter excepcionalíssimo, devendo ser bem fundamentada.