Estabelecimento de um protocolo de Nested-PCR para detecção do vírus da anemia das galinhas e análise filogenética de cepas brasileiras.

O vírus da anemia das galinhas (CAV) pode causar imunodepressão em galinhas de todas as idades e doença nos frangos jovens, a qual é caracterizada por severa anemia, atrofia da medula óssea e hemorragias. A doença clínica é rara hoje, porém a forma subclínica é freqüentemente encontrada em criações comerciais e resulta num considerável decréscimo do desempenho. O CAV apresenta variabilidade genética, entretanto, em relação às amostras brasileiras do CAV, pouco ou quase nada desta variabilidade é conhecida. O presente trabalho descreve um protocolo de Nested-PCR para a detecção do CAV diretamente de amostras clínicas e analisa filogeneticamente as seqüências nucleotídicas das amostras positivas buscando verificar se a patologia apresentada por estas está relacionada com a variabilidade genética. Para a extração de DNA, o método baseado em tiocianato de guanidina mostrou-se mais eficiente e prático de executar que os demais testados. Foi selecionado um par de primers que amplifica uma região de 664 pb do gene vp1 e outro par que amplifica uma região interna de 539 pb para a realização da Nested-PCR. A especificidade dos primers foi avaliada utilizando amostras de lotes controlados para CAV e 30 diferentes isolados de vírus e bactérias causadoras de doenças em galinhas, as quais não geraram produto de amplificação. A sensibilidade foi determinada a partir de diluições seriadas da vacina comercial para o CAV. A Nested-PCR mostrou ser mais sensível do que a PCR e foi capaz de detectar 0,16 DICC50% da cepa vacinal. Além disso, a Nested-PCR detectou DNA viral em tecidos, soro e cama aviária de lotes com e sem sintomas clínicos.O produto de amplificação de 539 pb do gene vp1 de 44 amostras, provenientes de diferentes Estados produtores de frangos do Brasil, foi seqüenciado e foram encontradas 10 novas seqüências nucleotídicas do CAV. Estas 10 seqüências nucleotídicas foram analisadas filogeneticamente pelo método de distância neighbour joining com 1000 replicações o qual, mostrou que não houve correlação entre a patogenia apresentada nos animais e os grupos genéticos. Estas seqüências nucleotídicas também foram comparadas com 30 cepas de CAV isoladas em outros países e não foi observada correlação entre a distribuição geográfica e a variabilidade genética. Substituições de amino ácidos foram observadas em 9 posições sendo que, 65R substituindo o resíduo Q e 98F substituindo o resíduo Y ainda não haviam sido observadas. Conclui-se que, como técnica de detecção do CAV, o protocolo de Nested-PCR aqui descrito é mais sensível e menos trabalhoso do que o isolamento viral. As amostras Brasileiras de CAV possuem características filogenéticas similares às isoladas em outros países.

Caracterização parcial de um fragmento e detecção por RT-PCR de Rice Stripe Necrosis Virus

O enrolamento do arroz é uma doença viral emergente no Brasil causada pelo Rice stripe necrosis virus (RSNV) que é transmitido pelo protozoário Polymyxa graminis. RSNV é um membro do gênero Benyvirus com genoma dividido em 4 RNAs de fita simples no sentido positivo (ssRNA +). Em função da falta de conhecimento sobre a seqüência de nucleotídeos do seu genoma, a detecção de RSNV através de métodos moleculares não é utilizada. O objetivo deste trabalho foi identificar seqüências do genoma de RSNV que possibilitassem sua detecção em plantas de arroz através da técnica de transcrição reversa seguida da reação em cadeia da polimerase (RT-PCR). As seqüências do genoma foram identificadas a partir de clones de uma biblioteca de cDNAs obtidos de uma amostra do vírus parcialmente purificado. Os clones que hibridizaram com sondas sintetizadas a partir de RNA de plantas infectadas com RSNV foram seqüenciados e comparados às seqüências do GenBank. Um fragmento de 957 nt da extremidade 3’ da fita de um dos 4 RNAs genômicos de RSNV foi obtido. A análise da seqüência nucleotídeos desse fragmento não revelou qualquer similaridade com seqüências conhecidas, tampouco indicou uma possível função. Um par de oligonucleotídeos iniciadores foi desenhado a partir de um clone que potencialmente contém uma seqüência de RSNV. A especificidade e a sensibilidade da RT-PCR utilizando esse par de oligonucleotídeos iniciadores, bem como sua eficiência na detecção do vírus em diferentes partes da planta de arroz, foram avaliadas. Os resultados indicam que a RT-PCR é específica para RSNV e pode detectar o vírus em tecido oriundo das raízes, do colo e de folhas com distorção. Comparada ao diagnóstico da doença através da observação de sintomas e de estruturas do vetor, a RT-PCR é uma ferramenta confiável para a diagnose do enrolamento do arroz.

Avaliação do estado nutricional, tipo de aleitamento e a evolução de lactentes previamente hígidos com bronquiolite viral aguda

Objetivos: Avaliar associação do estado nutricional e o tipo de aleitamento, na evolução da Bronquiolite Viral Aguda, em lactentes hospitalizados, menores de seis meses, previamente hígidos. Métodos: Estudo transversal prospectivo, realizado com 175 lactentes de zero a seis meses com diagnóstico clínico de bronquiolite viral aguda e primeiro episódio de sibilância, atendidos nas unidades pediátricas de emergência, internação e cuidados intensivos, em um hospital público de atendimento terciário, no sul do Brasil. Foi coletado aspirado nasofaríngeo para detecção de vírus através do teste da imunofluorescência indireta. Após preencherem os critérios de inclusão e assinatura do termo de consentimento informado, foram submetidos a avaliação antropométrica, entrevista com os pais ou responsáveis e acompanhados. Os desfechos clínicos foram tempo de uso de oxigênio, tempo de hospitalização e local de internação. Resultados: Na classificação do estado nutricional, encontramos 72,6% de eutróficos, 6,3% de desnutridos, 8,6% com risco nutricional, 10,9% com sobrepeso e 1,7% de obesos. Foi comparado o estado nutricional em relação ao aleitamento materno exclusivo, observando-se que 81% das crianças desnutridas e com risco nutricional não recebiam aleitamento materno exclusivo, comparadas com 72% das demais. Não se observaram diferenças, quando avaliados o estado nutricional ou tipo de aleitamento com os desfechos avaliados. Conclusões: O estado nutricional e o aleitamento materno não foram fatores de risco defavoráveis na evolução clínica de lactentes previamente hígidos com Bronquiolite Viral Aguda.

Prevalência de vírus respiratório em pacientes atendidos por asma aguda na sala de emergência

Introdução: As infecções virais do trato respiratório (IVTR) têm sido freqüentemente identificadas em associação com asma aguda (AA) em crianças, porém poucos estudos têm mostrado resultados similares em adultos com asma. Objetivos: Avaliar a prevalência de infecção viral na asma aguda em pacientes atendidos no setor de adultos do departamento de emergência (DE), comparando as características entre os grupos com amostras positivas e negativas para os vírus respiratórios. Material e Métodos: Conduzimos um estudo transversal de pacientes que se apresentaram com AA no setor de adultos do DE (idade igual ou maior que 12 anos) do Hospital de Clínicas de Porto Alegre. Um aspirado nasofaríngeo foi obtido para detecção de antígeno com a técnica de coloração de imunofluorescência indireta (vírus sincicial respiratório, adenovírus, influenza e parainfluenza tipo 1, 2, 3 e 4). Foram coletados dados referentes a características demográficas, medicações regulares, história médica pregressa, crise que levou à atual visita ao DE e desfechos da crise. Resultados: No período de março de 2004 a novembro de 2005, 111 pacientes foram examinados para IVTR. Foram identificados vírus respiratórios em 15 pacientes (8 com Adenovírus, 1 com RSV, 2 com Influenza A, e 4 com Parainfluenza tipo 1). Utilizando a análise de regressão logística, as variáveis com (p < 0,10), índice de massa corporal (IMC) e febre no domicilio, foram significativamente associados à identificação de vírus respiratório. Sessenta e seis por cento dos pacientes com IVTR apresentaram febre no domicílio, enquanto que somente 27% dos pacientes sem infecção viral apresentaram febre a domicílio, (p = 0,006). Não houve outra diferença significativa nas características clínicas, tempo de permanência e desfechos. Conclusão: Este estudo mostra uma prevalência de 13,5% de IVTR na AA em pacientes com idade igual ou maior que 12 anos atendidos na sala de emergência, confirmando a infecção viral como importante desencadeante nesta faixa etária. Dentre as características clínicas estudadas, febre no domicílio e IMC elevado, apresentam maior chance de identificação viral positiva.

Reprodutibilidade e validade In Vivo e In Vitro da inspeção visual associada ao exame radiográfico interproximal para a detecção de lesões de cárie na superfície oclusal de molares decíduos

O objetivo do presente estudo foi comparar os diagnósticos de lesões de cárie oclusal de molares decíduos obtidos in vivo e in vitro, a partir da inspeção visual associada à radiografia interproximal e avaliar in vivo e in vitro a efetividade destes exames para a detecção de lesões de cárie na superfície oclusal de molares decíduos. A amostra foi constituída de 52 molares decíduos superiores e inferiores. Os pacientes foram radiografados com posicionadores que possuíam os registros das mordidas em acrílico dos dentes posteriores aos dentes que seriam examinados. Moldagens dos hemiarcos foram obtidas com silicona de adição. O exame visual associado ao radiográfico da superfície oclusal dos molares decíduos foi realizado. Os dentes foram extraídos e posicionados nas moldagens para obtenção de modelos de gesso simulando as condições in vivo. Os posicionadores com as mordidas em acrílico foram novamente utilizados para as radiografias in vitro. O exame clínico associado ao radiográfico foi repetido in vitro pelo mesmo examinador, depois de em média 120 dias. Os dentes foram avaliados no estereomicroscópio para a obtenção dos diagnósticos definitivos. Através do teste de Wilcoxon, não foram observadas diferenças estatisticamente significantes entre os exames in vivo e in vitro (p = 0,356). Nas análises de todas as lesões, a sensibilidade foi de 0,95 in vivo e in vitro e a especificidade foi de 0,75 in vivo e 1 in vitro. Quando apenas as lesões em dentina foram validadas, a sensibilidade foi de 0,80 in vivo e in vitro e a especificidade foi de 0,77 in vivo e 0,83 in vitro. Assim, os resultados confirmam que os estudos de diagnóstico de cárie em condições laboratoriais são viáveis e possuem aplicabilidade clínica. Os exames associados foram considerados efetivos na detecção de lesões de cárie na superfície oclusal de molares decíduos in vivo e in vitro.