Transformação genética em cevada por bombardeamento de partículas

A presente Tese de Doutorado objetivou: (1) definir um método eficiente de transformação genética, por bombardeamento de partículas, para a obtenção de plantas transgênicas de cultivares brasileiras de cevada e (2) identificar gene(s) codificante(s) de quitinase(s) potencialmente capaz(es) de conferir resistência ao fungo patogênico de cevada Bipolaris sorokiniana. Culturas de calos obtidos a partir de escutelos imaturos das cultivares Brasileiras de cevada MN-599 e MN-698 (Cia. de Bebidas das Américas, AMBEV) foram bombardeadas com partículas de tungstênio e avaliadas quanto à expressão do gene repórter gusA através de ensaios histoquímicos de GUS e quanto ao efeito dos bombardeamentos na indução estruturas embriogênicas e regeneração de plantas. As condições de biobalística analisadas incluíram a região promotora regulando a expressão de gusA, tipo e pressão de gás hélio de dois aparelhos de bombardeamento, distância de migração das partículas, número de tiros e a realização de pré e pós-tratamento osmótico dos tecidos-alvo. No presente trabalho foram obtidos um número bastante alto de pontos azuis por calo, a indução de calos embriogênicos e embriões somáticos em uma freqüência de até 58,3% e a regeneração de 60 plantas, sendo 43 de calos bombardeados. As melhores condições observadas foram o promotor e primeiro íntron do gene Adh de milho (plasmídeo pNGI), o aparelho de bombardeamento “ Particle Inflow Gun” (PIG) utilizando-se a distância de migração de partículas de 14,8 cm, dois tiros disparados por placa e a realização de tratamento osmótico dos explantes com 0,2 M de manitol e 0,2 M de sorbitol 4-5 horas antes e 17-19 horas depois dos bombardeamentos. Das 43 plantas obtidas de calos bombardeadas, 3 apresentaram atividade de GUS na base das suas folhas. A utilização de primers sintéticos definidos a partir de genes de quitinases descritos na literatura em PCRs resultou na amplificação de dois fragmentos de aproximadamente 700 e 500 pb a partir de DNA total das cvs. MN-599 e MN-698 de cevada e um fragmento, com aproximadamente 500 pb, a partir do DNA total do isolado A4c de Trichoderma sp. Estes fragmentos foram purificados dos géis de agarose e diretamente seqüenciados de forma manual e automática. Os fragmentos de 700 e 500 pb amplificados do genoma da cultivar MN-599 foram identificados como genes de quitinases de cevada e o fragmento de 500 pb do isolado A4c de Trichoderma sp. não apresentou homologia com seqüências conhecidas de quitinases depositadas no EMBL/GenBank. A utilização de novos pares de primers, representando seqüências conservadas de quitinases do fungo Metarhizium anisopliae, resultou na amplificação de 3 fragmentos a partir do DNA total do isolado A4b de Trichoderma sp., que estão sendo purificados para realização de seqüenciamento.

Aspectos epidemiológicos da paratuberculose bovina no Rio Grande do Sul

Descrevem-se os achados clínicos e patológicos da paratuberculose em uma criação intensiva de bovinos de leite no municí pio de Capela de Santana, RS. Os sinais clínicos foram observados em oito de um total de 345 bovinos, consistindo em diarréia crônica refratária aos tratamentos, emagrecimento progressivo e queda na produção de leite. As principais lesões macroscópicas, observadas nos oito animais necropsiados, incluíam intestino delgado com acentuado espessamento da parede e superfície mucosa de aspecto reticulado, semelhante às circunvoluções cerebrais, lesão essa perceptível, através da serosa. A luz intestinal estava preenchida com conteúdo fluido e de aspecto leitoso. Os vasos linfáticos do mesentério mostravam-se mais evidentes sendo que alguns tinham aspecto varicoso. Os linfonodos mesentéricos estavam aumentados de volume e, ao corte, fluía grande quantidade de líquido leitoso. Focos de mineralização foram observados na íntima das artérias, nas válvulas cardíacas e na serosa do rúmen. As principais lesões macroscópicas incluíam enterite, linfadenite e linfangite granulomatosa caracterizada por infiltrado inflamatório com macrófagos, células gigantes de Langhans que continham grande quantidade de bacilos álcool-ácido-resistentes. As lesões vasculares consistiam em degeneração e mineralização das túnicas í ntimas e média das artérias de grande calibre associada a proliferação de colágeno. Havia calcificação da serosa do rúmen atrofia hepatocelular difusa e hepatite granulomatosa multifocal. O M. avium subsp. paratuberculosis (Map) foi isolado em amostras de intestino e linfonodos de 8 vacas Holandesas (3,5%) com doença de Johne, dentre 229 amostras cultivadas provenientes de um rebanho leiteiro. Amostras inoculadas em HEYM com micobactina produziram colônias identificadas como Map, segundo as caracterí sticas fenotí picas próprias como: crescimento lento, coloração álcool-ácido-resistente (A.A.R.) e dependência a micobactina. O laboratório de Referência da OIE confirmou a amostra isolada. O M. avium subsp. paratuberculosis (Map) foi isolado em amostras de intestino e linfonodos de 8 vacas Holandesas (3,5%) com doença de Johne, dentre 229 amostras cultivadas provenientes de um rebanho leiteiro Amostras inoculadas em HEYM com micobactina produziram colônias identificadas como Map, segundo as caracterí sticas fenotí picas próprias como: crescimento lento, coloração álcool-ácido-resistente (A.A.R.) e dependência a micobactina. O laboratório de Referência da OIE confirmou a amostra isolada. Não houve isolamento do agente em 221 amostras intestinais quando processadas, após 2 anos de sua colheita. O teste de IDGA aplicado como “screening”, detectou 26 vacas (11,4%) positivas, dentre 228 animais testados e sacrificados em matadouro. O teste de ELISA adsorvido, utilizando o antí geno PPA-3 detectou 125 (39,8%) amostras positivas. O ELISA não adsorvido detectou mais 32 (10,1%) reagentes positivos, dentre os 314 bovinos testados. A prevalência da infecção causada pelo Map em 36 rebanhos leiteiros procedentes de 25 municí pios do Rio Grande do Sul foi estimada em 44,6% das 1316 amostras testadas. A infecção foi identificada em 35 (97,2%) dos 36 rebanhos testados e presentes em todos os municí pios incluí dos. A ocorrência da doença de Johne foi enfatizada, tanto a forma clí nica quanto a infecção subclí nica no Rio Grande do Sul, sugerindo a adoção de medidas de controle sejam aplicadas na proteção dos rebanhos leiteiros nacionais.

Integração de dados em ambiente SIG para mapeamento de favorabilidade mineral de ouro na ilha cristalina de Rivera (Uruguai)

Guias para exploração mineral são normalmente baseados em modelos conceituais de depósitos. Esses guias são, normalmente, baseados na experiência dos geólogos, em dados descritivos e em dados genéticos. Modelamentos numéricos, probabilísticos e não probabilísticos, para estimar a ocorrência de depósitos minerais é um novo procedimento que vem a cada dia aumentando sua utilização e aceitação pela comunidade geológica. Essa tese utiliza recentes metodologias para a geração de mapas de favorablidade mineral. A denominada Ilha Cristalina de Rivera, uma janela erosional da Bacia do Paraná, situada na porção norte do Uruguai, foi escolhida como estudo de caso para a aplicação das metodologias. A construção dos mapas de favorabilidade mineral foi feita com base nos seguintes tipos de dados, informações e resultados de prospecção: 1) imagens orbitais; 2) prospecção geoquimica; 3) prospecção aerogeofísica; 4) mapeamento geo-estrutural e 5) altimetria. Essas informacões foram selecionadas e processadas com base em um modelo de depósito mineral (modelo conceitual), desenvolvido com base na Mina de Ouro San Gregorio. O modelo conceitual (modelo San Gregorio), incluiu características descritivas e genéticas da Mina San Gregorio, a qual abrange os elementos característicos significativos das demais ocorrências minerais conhecidas na Ilha Cristalina de Rivera. A geração dos mapas de favorabilidade mineral envolveu a construção de um banco de dados, o processamento dos dados, e a integração dos dados. As etapas de construção e processamento dos dados, compreenderam a coleta, a seleção e o tratamento dos dados de maneira a constituírem os denominados Planos de Informação. Esses Planos de Informação foram gerados e processados organizadamente em agrupamentos, de modo a constituírem os Fatores de Integração para o mapeamento de favorabilidade mineral na Ilha Cristalina de Rivera. Os dados foram integrados por meio da utilização de duas diferentes metodologias: 1) Pesos de Evidência (dirigida pelos dados) e 2) Lógica Difusa (dirigida pelo conhecimento). Os mapas de favorabilidade mineral resultantes da implementação das duas metodologias de integração foram primeiramente analisados e interpretados de maneira individual. Após foi feita uma análise comparativa entre os resultados. As duas metodologias xxiv obtiveram sucesso em identificar, como áreas de alta favorabilidade, as áreas mineralizadas conhecidas, além de outras áreas ainda não trabalhadas. Os mapas de favorabilidade mineral resultantes das duas metodologias mostraram-se coincidentes em relação as áreas de mais alta favorabilidade. A metodologia Pesos de Evidência apresentou o mapa de favorabilidade mineral mais conservador em termos de extensão areal, porém mais otimista em termos de valores de favorabilidade em comparação aos mapas de favorabilidade mineral resultantes da implementação da metodologia Lógica Difusa. Novos alvos para exploração mineral foram identificados e deverão ser objeto de investigação em detalhe.

Integração de dados geológicos, de sensoriamento remoto, espectrorradiométricos e geofísica aplicada à prospecção de depósitos filoneanos de fluorita hidrotermal no sudeste de Santa Catarina

Os processamentos de imagens orbitais efetuados através de técnicas de sensoriamento remoto geraram informações qualitativas de natureza textural (morfo-estruturas). Estas permitiram (1) o reconhecimento de áreas com diferentes padrões estruturais tendo diferentes potencialidades para a prospecção de fluorita, (2) a identificação de novos lineamentos estruturais potencialmente favoráveis à mineralização e (3) evidenciaram prolongamentos extensos para as principais estruturas mineralizadas, (4) às quais se associam um grande número de estruturas, antes desconhecidas, com grande potencial prospectivo. O aprimoramento de técnicas de classificação digital sobre produtos de razões de bandas e análise por componentes principais permitiu identificar a alteração hidrotermal associada às estruturas, incorporando novos critérios para a prospecção de fluorita. Buscando-se quantificar os dados de alteração hidrotermal, foi efetuada a análise espectrorradiométrica das rochas do distrito fluorítico. Integrando estas informações com dados TM LANDSAT 5, em nível de reflectância, obteve-se a classificação espectral das imagens orbitais, o que permitiu a identificação de estruturas menores com um detalhe nunca antes obtido. Os processamentos de dados aerogeofísicos forneceram resultados sobre estruturas (magnetometria) e corpos graníticos afetados por alteração hidrotermal (aerogamaespectrometria). Estes produtos foram integrados com dados TM LANDSAT 5 associando o atributo textural da imagem orbital ao comportamento radiométrico das rochas. Diagnosticou-se o lineamento Grão-Pará como o principal prospecto do distrito. E levantaram-se uma série de dados sobre a compartimentação tectônica da região, a zonação de fácies das rochas graníticas (rocha fonte do flúor) e as alterações hidrotermais associadas ao magmatismo granítico. Isto permitiu a compreensão da distribuição regional dos depósitos de fluorita, adicionando-se um novo critério à prospecção de fluorita, a relação espacial entre a mineralização e a rocha fonte de F. Esta última corresponde à fácies granítica da borda do Maciço Pedras Grandes.

Caracterização da mutagênese por inserção do retrotransposon Tos17 em genótipos de arroz

O aumento do potencial produtivo da cultura de arroz via melhoramento genético está principalmente relacionado ao rendimento, a qualidade de grãos e a obtenção de plantas resistentes a doenças e pragas. Neste caso, deve ser explorada a variabilidade genética natural ou induzida através de agentes mutagênicos físicos, químicos ou biológicos. A vantagem do uso de mutagênicos biológicos, como os transposons e os retrotransposons, é que ao serem inseridos podem interrompem um gene causando uma mutação. Esta retrotransposição deixa uma marca que possibilita a identificação molecular do local de inserção. No presente trabalho, foi utilizada a estratégia de mutagênese insercional através de eventos de transposição do retrotransposon Tos17, induzido por cultura in vitro. A análise de diferentes genótipos de arroz é muito importante para avaliar se a transposição ocorre de forma similar em genótipos distintos. Foram avaliados calos embriogênicos de cultivares que têm um histórico de variabilidade genética em homozigose, linhagens obtidas através de cruzamentos com espécies silvestres e ecótipos de arroz vermelho, submetidos a 6 meses de cultura in vitro. O método escolhido para avaliar o número de cópias de Tos17 em calos embriogênicos foi a quantificação relativa por PCR em tempo real. A identificação dos genes mutados pela inserção do retrotransposon foi feita através do isolamento e amplificação das seqüências que flanqueiam os insertos de Tos17. O resultado deste experimento indica um aumento no número de cópias de Tos17 em 8 dos 21 genótipos avaliados. O seqüenciamento dos fragmentos de DNA que flanqueiam os insertos do retrotransposon Tos17, indicaram alta similaridade com seqüências genômicas não codificantes de arroz.