5 resultados para CA2 ATPASES
em Lume - Repositório Digital da Universidade Federal do Rio Grande do Sul
Resumo:
A protena cida fibrilar glial (GFAP) uma protena da classe dos filamentos intermedirios, exclusivamente expressa em astrcitos no sistema nervoso central (SNC). A funo especfica da fosforilao desta protena ainda desconhecida. No entanto, tem sido demonstrado que o equilbrio dinmico entre o estado fosforilado e desfosforilado de stios especficos da GFAP pode regular a polimerizao e despolimerizao dos filamentos intermedirios durante eventos de estruturao do citoesqueleto glial. Nosso grupo de pesquisa demonstrou que a fosforilao da GFAP em hipocampo de ratos jovens (P12-P16) estimulada no mesmo nvel por glutamato, via um receptor glutamatrgico metabotrpico do grupo II (mGluR II), e pela ausncia de Ca2+ externo (presena de EGTA). Entretanto, o tratamento simultneo com glutamato e EGTA no resulta em efeito sinergstico, sugerindo um mesmo mecanismo de ao para estas duas situaes estimulatrias da fosforilao da GFAP (WofchuK & Rodnight, 1994; Kommers et al., 1999; Rodnight et al., 1997). Este mecanismo provavelmente no envolve reservas intracelulares de Ca2+ associadas a receptores de IP3, uma vez que mGluRs II esto envolvidos com o mecanismo de transduo de sinal via adenilato ciclase e no via hidrlise de fosfoinositdios. Uma hiptese proposta de que o glutamato, via mGluR, bloqueia canais de Ca2+ tipo L, inibindo uma cascata de desfosforilao dependente de Ca2+, associada a GFAP (Rodnight et al., 1997). Interessantemente, os receptores rianodina (RyRs) presentes nas reservas intracelulares de Ca2+ reguladas por tais receptores esto associados com canais de Ca2+ tipo L (Chavis et al., 1996). Com base nestes dados, buscou-se neste trabalho avaliar se a modulao glutamatrgica da fosforilao da GFAP em fatias de hipocampo de ratos jovens envolve as reservas intracelulares de Ca2+ reguladas por RyRs e se o Ca2+ proveniente destas reservas atua de maneira semelhante ao Ca2+ oriundo do espao extracelular. Nossos resultados mostraram que h uma evidente participao do Ca2+ proveniente das reservas intracelulares reguladas por RyRs no mecanismo modulatrio da fosforilao da GFAP via ativao de mGluRs em fatias de hipocampo de ratos jovens, uma vez que a cafena e a rianodina (agonistas de RyRs) revertem totalmente o efeito estimulatrio do agonista glutamatrgico metabotrpico 1S,3R-ACPD sobre a fosforilao da protena e este efeito da cafena inibido por dantrolene (antagonista de RyRs). Talvez o Ca2+ oriundo das reservas reguladas por RyRs tenha o mesmo papel do Ca2+ proveniente do espao extracelular, ou seja, desencadeia uma cascata de desfosforilao associada GFAP mediada pela calcineurina, uma vez que quelando o Ca2+ intracelular livre com BAPTA-AM, aps a mobilizao destas reservas, tal efeito no ocorre. A participao de receptores adenosina (AdoRs) e do AMP cclico (AMPc) ainda permanece a ser estudada. Entretanto, sabido que em ratos jovens a ativao de mGluRs aumenta a formao de AMPc potenciando o efeito de outros tipos de receptores, como os AdoRs e, provavelmente, isto mediado por um mGluR II (Schoepp & Johnson, 1993; Winder & Conn, 1996). Neste trabalho mostrou-se justamente o possvel envolvimento de tais mecanismos de transduo de sinal na modulao da fosforilao da GFAP, pois a adenosina deaminase (enzima que metaboliza adenosina endgena) e a forscolina (agente que estimula a enzima adenilato ciclase) alteraram o nvel de fosforilao da GFAP. Estes resultados evidenciam o envolvimento das reservas intracelulares de Ca2+ reguladas por RyRs no mecanismo de transduo de sinal que modula o estado de fosforilao GFAP mediado pela ativao de mGluRs.
Resumo:
O dinmico processo de polimerizao e despolimerizao dos filamentos intermedirios de astrcitos modulado principalmente por fosforilao da protena cida fibrilar glial (GFAP). Os stios de fosforilao da GFAP esto localizados na poro N-terminal, onde atuam protenas quinases dependentes de AMPc e Ca2+. Este processo vem sendo investigado em fatias cerebrais, culturas de astrcitos, fraes citoesquelticas ou sistemas purificados. Neste trabalho estamos descrevendo uma nova tcnica para o estudo do sistema fosforilante da GFAP que consiste na permeabilizao de astrcitos em cultura com digitonina, Este modelo permite o acesso aos stios intracelulares mantendo preservada, ainda que parcialmente, a compartimentalizao celular. As condies de permeabilizao foram estebelecidas com base na excluso ao azul de Tripan. A incubao das clulas com AMPc e Ca2+ promoveram o aumento da fosforilao da GFAP, enquanto imunocitoqumica com anti-GFAP mostrou que em condies basais astrcitos permeabilizados mantm sua morfologia protoplasmtica tpica e apresenta a estrutura dos filamentos intermedirios preservada. Ao incubar os astrcitos permeabilizados com AMPc estes filamentos aparentemente condensaram formando longos processos. Estes resultados sugerem que esta tcnica tem potencial considervel para o estudo de alteraes estruturais nos filamentos gliais em paralelo com a fosforilao de protenas por permitir o uso de moduladores especficos de protenas quinases e fosfatases.
Resumo:
O presente estudo investiga a funo reprodutiva de ratos machos com hipertenso induzida pelo modelo dois-rins, um-clipe (2R/1C), e de ratos 2R/1C normotensos devido ao tratamento com o bloqueador de canais de Ca2+ nifedipina. O aumento da AngII perifrica/central caracterstico do modelo 2R/1C. Parmetros de comportamento sexual (latncia e freqncia de monta com intromisso, latncia de ejaculao e durao do intervalo ps-ejaculatrio) e de espermatognese (quociente espermtico e trnsito epidimrio), e hormnios plasmticos (LH, FSH, PRL e testosterona) foram utilizados para a avaliao da funo reprodutiva dos animais. Noventa e nove ratos Wistar foram utilizados neste estudo, divididos em seis grupos: 2R/1C- ratos com hipertenso induzida pelo modelo 2R/1C; FICT- ratos com cirurgia fictcia; 2R/1C+V- ratos 2R/1C que usaram veculo; 2R/1C+N- ratos 2R/1C que foram tratados com nifedipina; FICT+V- ratos FICT que usaram veculo; FICT+N- ratos FICT que foram tratados com nifedipina. Os animais permaneceram clipados na artria renal durante vinte e oito dias. O tratamento oral com nifedipina (10mg/kg/rato) foi iniciado no primeiro dia aps o clipamento da artria renal. O comportamento sexual foi registrado por vdeo e a presso arterial mdia (PAM) foi aferida por cateter inserido na artria femoral. Aps o registro de PAM, os animais foram mortos para coleta de sangue e retirada das gnadas. Os resultados mostraram que o grupo 2R/1C exibe elevada PAM, aumento da latncia de monta com intromisso e de ejaculao, aumento da durao do intervalo ps-ejaculatrio, reduo do nmero de animais que ejaculam e que apresentam perodo ps-ejaculatrio, aumento da PRL com reduo da testosterona plasmtica, e reduo do quociente espermtico com aumento do trnsito epidimrio, quando comparado ao grupo FICT. Entretanto, animais 2R/1C+N apresentaram valores de comportamento sexual e dos hormnios plasmticos semelhantes aos animais FICT+V ou FICT+N, diferindo significativamente apenas dos ratos 2R/1C+V. Animais 2R/1C+V e 2R/1C+N mantiveram o prejuzo da espermatognese. Os dados sugerem uma associao entre hipertenso induzida pelo modelo 2R/1C e reduo da funo reprodutiva; no entanto, o comportamento sexual e a PRL plasmtica, ambos normais, foram coincidentes com uma PAM normal. Os efeitos da nifedipina sobre o impedimento em diminuir o comportamento sexual e em aumentar a PRL plasmtica, e sobre a manuteno do prejuzo na espermatognese acontece somente em animais clipados na artria renal. A AngII elevada, caracterstica do modelo 2R/1C, parece ter ao decisiva sobre o prejuzo na espermatognese, o mesmo no acontecendo quanto reduo do comportamento sexual e ao aumento da PRL plasmtica.
Parmetros bioqumicos de alteraes do citoesqueleto no modelo experimental da doena do Xarope do Bordo
Resumo:
A Doena do Xarope do Bordo (DXB) um erro inato do metabolismo causado pela deficincia na atividade do complexo desidrogenase dos cetocidos de cadeia ramificada, levando ao acmulo de concentraes milimolares dos seguintes -cetocidos de cadeia ramificada (CACR): cidos -cetoisocaprico (CIC), -ceto--metilvalrico (CMV), -cetoisovalrico (CIV) e dos seus aminocidos precursores, leucina, isoleucina e valina em tecidos de pacientes afetados. Essa doena caracterizada por severos sintomas neurolgicos que incluem edema e atrofia cerebral, entretanto, os mecanismos envolvidos na neuropatologia da DXB ainda no so bem estabelecidos. Neste trabalho utilizamos um modelo experimental de DXB com o objetivo de verificar os efeitos dos CACR que se acumulam nessa desordem neurodegenerativa sobre o citoesqueleto de clulas neurais de ratos. Nesse modelo fatias de crtex cerebral de ratos de diferentes idades, ou culturas de clulas neurais foram incubados com concentraes variando de 0,1 a 10 mM de cada metablito. Inicialmente demonstramos que o CIC, CMV e CIV inibiram a captao de glutamato em fatias de crtex cerebral de ratos durante o desenvolvimento. O CIC inibiu a captao de glutamato em ratos de 9, 21 e 60 dias de idade, enquanto o CMV e o CIV inibiram a captao de glutamato em animais de 21 e 60 dias. Observamos que o CIC alterou a fosforilao de protenas do citoesqueleto de um modo dependente do desenvolvimento atravs de receptores glutamatrgicos ionotrpicos em fatias de crtex cerebral de ratos. O metablito causou diminuio da fosforilao dos filamentos intermedirios (FI) em ratos de 9 dias de idade e aumento dessa fosforilao em animais de 21 dias de vida. Tambm demonstramos que em animais de 9 dias de idade o efeito do CIC foi mediado pelas protenas fosfatases PP2A e principalmente pela PP2B, uma protena fosfatase dependente de clcio, enquanto que em animais de 21 dias de idade o efeito deste metablito foi mediado pela protena quinase dependente de AMP cclico (PKA) e pela protena quinase dependente de clcio e calmodulina (PKCaMII). Alm disso, verificamos que o CIC promoveu um aumento nos nveis intracelulares dos segundos mensageiros AMPc e Ca2+. O aumento do Ca2+ intracelular provocado pelo CIC foi demonstrado pelo uso de bloqueadores especficos de canais de clcio dependentes de voltagem tipo L, por exemplo, nifedipina, canais de clcio dependentes de ligantes, por exemplo, NMDA e de quelantes de clcio intracelular, por exemplo, BAPTA-AM. Por outro lado, o CMV aumentou a fosforilao de FI somente em ratos de 12 dias de idade, sendo esse efeito mediado por receptores GABArgicos do tipo A e B, desencadeando a ativao das protenas quinases PKA e PKCaMII. importante salientar que o CIV no alterou a atividade do sistema fosforilante em nenhuma das idades estudadas. Alm dos efeitos causados pelos CACR que se acumulam na DXB sobre a atividade do sistema fosforilante associado aos FI em fatias de crtex cerebral de ratos, demonstramos que esses metablitos foram capazes de alterar a fosforilao da protena glial fibrilar cida (GFAP) na linhagem de glioma C6. Essa alterao de fosforilao causou uma reorganizao do citoesqueleto de GFAP e um aumento no imunocontedo da GFAP na frao citoesqueltica. Tambm verificamos que o CIC, o CMV e o CIV, em concentraes encontradas em pacientes portadores de DXB, levaram a uma reorganizao dos filamentos de GFAP e do citoesqueleto de actina de astrcitos em cultura, causando uma importante alterao na morfologia destas clulas. As alteraes do citoesqueleto levaram a morte celular progressiva quando os astrcitos foram expostos por vrias horas aos metablitos. Demonstramos tambm que os efeitos dos CACR sobre a morfologia dos astrcitos foram desencadeados por mecanismos de membrana que diminuram a atividade da Rho GTPase. Esse mecanismo foi evidenciado utilizando-se cido lisofosfatdico (LPA), um ativador especfico da RhoA, o qual preveniu os efeitos causados pelos CACR em culturas de astrcitos. importante salientar que as alteraes morfolgicas e a morte celular induzida pelos CACR em culturas de astrcitos foram totalmente evitadas com a suplementao de creatina s culturas. Tambm verificamos que a atividade da creatina quinase foi inibida pelos metablitos, indicando que a homeostase energtica provavelmente estaria envolvida nos efeitos causados pelos CACR. XI Sabe-se que as alteraes do citoesqueleto esto relacionadas com inmeras doenas neurodegenerativas. Portanto, provvel que as alteraes causadas pelos CACR nos mecanismos de membrana que regulam nveis de segundos mensageiros intracelulares e cascatas de sinalizao celular, na perda do equilbrio fisiolgico do sistema fosforilante associado ao citoesqueleto e conseqentemente na sua reorganizao, possam ter importantes conseqncias para a funo neural. Com base nos presentes resultados demonstramos que os CACR que se acumulam na DXB levam desorganizao do citoesqueleto em um modelo experimental podendo ser uma contribuio importante para o estudo da patognese do sistema nervoso central caracterstica dos pacientes portadores de DXB.
Resumo:
O trabalho descreve a ocorrncia de gagarinita-(Y) das pores mineralizadas de criolita da base do Depsito Crioltico Macio associado subfcies albita granito do Granito Madeira (1.8Ma) na jazida de Pitinga (Sn, Nb, Ta e criolita), onde o Y e ETR sero explorados como co-produtos. A gagarinita forma cristais andricos de at 7mm, intersticiais ou inclusos na criolita, de cristalizao anterior criolita dos bolses. Todos os cristais apresentam texturas tpicas de exsoluo, pela primeira vez descritas em fluoretos. Os padres de exsoluo so variados. Os cristais exsolvidos tm at 0,4mm, so incolores, as cores de interferncia so de primeira ordem, com birrefringncia 0,005-0,007, so U(-), com retardo de 150 a 210nm. A fase exsolvida distribui-se uniformemente em toda a extenso dos gros da gagarinita-(Y), inclusive na borda; segue uma ou mais orientaes preferenciais e tem dimenses semelhantes. Podem ocorrer coalescncia de diferentes cristais exsolvidos, resultando em strings e stringlets. Mais raramente, a orientao menos evidente e as dimenses dos cristais so mais variveis No contato gagarinita/criolita, reconhece-se a formao da fase exsolvida como anterior cristalizao da criolita. A anlise modal de uma populao de gros de gagarinita-(Y) com os diversos padres texturais de exsoluo fornece o valor mdio de 25,8% (considerado estatisticamente representativo) de proporo de fase exsolvida em relao fase hospedeira. Os parmetros cristalinos da gagarinita-(Y) determinados a partir de anlises por DRX so compatveis com os da literatura. Anlises por MSE, FRX e MEV da gagarinita-(Y) mostram uma composio bastante homognea. A frmula estrutural mdia calculada na base de 2(ETR+Y+Ca) Na0,24Ca0,58Y1,01ETR0,39F5,81. O padro de ETR normalizado ao condrito caracterizado por enriquecimento em ETRP e anomalia negativa em Eu. A composio da fase exsolvida obtida por MSE, calculada para um total de ctions igual a 1, Ce0,53-0,66 La0,09-0,26 Nd0,08-0,26 Sm0,01-0,04 Eu0,01Y0-0,03 F3,3-4,14. Esta frmula semelhante da fluocerita, cujos picos caractersticos, entretanto, no ocorrem nos difratogramas. O padro de ETR mostra um fracionamento contnuo dos ETR com empobrecimento em ETRP e discreta anomalia positiva em Eu. A composio da gagarinita inicial foi reconstituda considerando-se as propores modais das fases hospedeira e exsolvida, obtendo-se Na0,19Ca0,48Y0,83ETR0,69F6,27. O padro de ETR plano com anomalia negativa em Eu menos acentuada que na gagarinita hospedeira Antes da exsoluo, o sistema mineral comportava-se provavelmente como uma soluo slida com a substituio - + 2ETR3+<=> Na+ + Ca2+ + Y3+ . Formou-se, assim, uma gagarinita inicial excepcionalmente rica em ETRL (ctions relativamente grandes) cuja presena foi compensada por vacncias, notadamente no stio de coordenao VI. A diminuio da temperatura desestabilizou a estrutura mineral que exsolveu os ctions de ETR com raio inico maior que o do Sm. A gagarinita hospedeira preservou os contedos de Y, ETRP (com exceo do Sm que se repartiu entre ela e a fase exsolvida) e Na (e Ca), constituindo uma estrutura estvel, menos afetada por vacncias e com um balano de cargas bastante equilibrado. A fase exsolvida um fluoreto com razo ctions/flor= 1/3, correspondendo composio da fluocerita. Sua estrutura no pde ser determinada: picos da fluocerita no foram identificados e uma estrutura semelhante da gagarinita (razo ctions/flor= 1/2) parece pouco provvel. Estudos subseqentes podero definir se trata-se de um novo mineral, polimorfo da fluocerita.
