Maturação e fecundação "in vitro" de ovócitos de caninos domésticos (Canis familiaris)

Este estudo foi realizado com o objetivo de 1) determinar a eficácia de duas temperaturas (370 C e 390 C) e três intervalos de tempo (48, 72 e 96h) comumente usados na maturação in vitro (MIV) de ovócitos caninos, 2) verificar o efeito de hormônios heterólogos: hormônio folículo estimulante (FSH) 0,5µg/ml, estradiol 20µg/ml e somatotropina humana (hST) 1µg/ml; e o efeito de proteínas: 0,4 % albumina sérica bovina (BSA), 10 % de soro de vaca em estro inativado (SVE), e 10 % soro de cadela em estro inativado (SCE) na maturação nuclear de ovócitos caninos, 3) observar a influência da condição reprodutiva das doadoras de ovários (folicular, diestro, anestro, piometra, e prenhez) sobre os índices de maturação in vitro ovocitária, 4) verificar a habilidade para fecundação in vitro de ovócitos coletados de fêmeas em diferentes estágios do ciclo estral, previamente maturados in vitro e adicionalmente, examinar sua capacidade de desenvolvimento embrionário in vitro. O meio de maturação usado nos experimentos foi TCM-199 suplementado com 25 mM Hepes/l (v/v) com 10 % de soro de vaca em estro inativado (SVE), 50 µg/ml de gentamicina, 2,2 mg/ml de bicarbonato de sódio, 22 µg/ml de ácido pirúvico, 1 µg/ml de estradiol, 0,5 µg/ml de FSH e 0,03 UI/ml de hCG. O meio de maturação era modificado de acordo com a proposta experimental apresentada. Os resultados do primeiro experimento não mostraram diferença estatística no índice de meiose de ovócitos maturados à 37oC ou à 39oC em quaisquer dos intervalos testados (48, 72, 96 horas), embora a proporção de ovócitos que alcançaram metáfase II a 37oC após 72 horas da maturação in vitro, mostrasse uma tendência estatística à significância (p = 0,064), quando comparada àquela dos ovócitos maturados à 39oC. Foi concluído que temperaturas de 37oC e 39oC são similares para maturação in vitro de ovócitos de cadelas. No segundo experimento deste estudo, os índices mais elevados (p < 0,05) de retomada da meiose após 72 horas de maturação in vitro foram obtidos, quando TCM 199 era suplementado com 0,4 % de BSA. Uma influência positiva sobre a aquisição de metáfase II (MII) foi observada com a suplementação de 1µg/ml de hST no meio de maturação. Ao contrário, ovócitos maturados em TCM 199 com 10 % de soro de cadela em estro não se desenvolveram até o estádio de MII. Os resultados deste experimento mostraram que a suplementação de proteínas e de hormônios ao TCM-199 não facilitam as etapas finais da maturação in vitro de ovócitos de cadelas.No terceiro experimento, os resultados de maturação dos ovócitos não mostraram diferença estatística na progressão do material nuclear até o estádio de MII entre os ovócitos provenientes de cadelas em várias condições reprodutivas (fase folicular: 5,4 %; diestro: 4,2 %; anestro: 4,4 %; piometra: 8,1 % e prenhez: 4,7 %). A retomada da meiose mostrou índices de 24,6 % na fase folicular, 19,6 % no diestro, 16,4 % no anestro, 37,1 % na piometra e 29,2 % na prenhez. Índices positivos e mais elevados de resíduo acima do valor esperado foram observados para as condições de piometra e de prenhez nos estádios de metáfase/anáfase I (MI/AI). Nossos resultados indicam que a maturação nuclear in vitro de ovócitos caninos não é influenciada pela condição reprodutiva in vivo da fêmea no momento da coleta ovariana. No experimento de fecundação in vitro (FIV), 888 ovócitos selecionados através de sua qualidade morfológica superior foram distribuídos em 3 grupos de acordo com o estágio do ciclo estral da doadora em: a) folicular, b) anestro, c) luteal . Após período de 48 horas de maturação a 37oC em TCM 199 suplementado com 25 mM Hepes/l (v/v), com 10 % soro de vaca em estro inativado (SVE), 50 µg/ml de gentamicina, 2,2 mg/ml de bicarbonato de sódio, 22 µg/ml de ácido pirúvico, 20 µg/ml de estradiol, 0,5 µg/ml de FSH, 0,03 UI/ml hCG e 1 µg/ml de hST, os ovócitos eram fecundados in vitro (2x106 espermatozóides/ml) por um período de 24 horas. A percentagem de ovócitos nucleados desenvolvendo-se em embriões foi de 10,1 % (27/ 267). O índice de clivagem (2-8 células) após cinco dias da FIV foi similar nas fases reprodutivas (folicular, anestro, e luteal). Contudo, o índice geral de fecundação foi superior nos ovócitos oriundos de cadelas nos estágios folicular (42,4 %) e anestro do ciclo (34,3 %) comparativamente àqueles provenientes da fase luteal (18,6 %) (p < 0,001). Além disso, foi verificada influência da fase folicular sobre o desenvolvimento de pronúcleos, com os índices nesta fase (24,2 %) sendo estatisticamente diferentes daqueles observados no anestro e na fase luteal (9,6 % e 3,7 %, respectivamente) (p < 0,004). Não foi estabelecida correlação entre a proporção de espermatozóides capacitados ou com reação acrossômica e formação pronuclear e/ou percentagem de clivagem. Em resumo, conclui-se que: a) ovócitos caninos podem ser maturados in vitro de forma similar às temperaturas de 39oC e 37o. b) a adição de hormônios (FSH, estradiol, hST) e proteínas (BSA, SVE, SCE) ao meio TCM 199 não eleva os índices de maturação nuclear até o estádio de MII de ovócitos caninos maturados in vitro. c) em cães, a seleção de ovócitos com base na coleta dentro de um estágio específico do ciclo estral não deve ser usada para prever índices de meiose ou habilidade para desenvolvimento embrionário in vitro. d) ovócitos caninos maturados, fecundados e cultivados in vitro podem se desenvolver a zigotos com até 8 células.

Detecção radiográfica de defeitos ósseos incipientes no periápice

Esta dissertação é apresentada sob a forma de quatro artigos. O artigo I avaliou a concordância e a acurácia no diagnóstico da situação do periápice de molares e prémolares inferiores portadores ou não de patologia periapical. Quarenta radiografias periapicais foram selecionadas, vinte de dentes com vitalidade pulpar e sem radiolucências periapicais e vinte de dentes com necrose pulpar. As radiografias foram digitalizadas em scanner no modo 8 bits, 300 dpi e armazenadas no formato JPEG 12. As imagens digitalizadas foram apresentadas no formato de slides com fundo preto no programa PowerPoint, sendo projetadas em equipamento multimídia para dois grupos de dez observadores, estudantes de pós-graduação de uma mesma instituição de ensino, simultaneamente, com repetição de 20% dos casos. Os observadores apresentaram ampla variação do percentual de concordância entre diagnósticos repetidos, contudo, quando agrupados por especialidade, endodontistas e radiologistas apresentaram percentuais de concordância de 62,50 e 66,25%, respectivamente. Na análise da concordância interobservadores, ambos os grupos apresentaram desempenho semelhante, sendo este superior entre os alunos de radiologia (Kendall´s W= 0,816 e 0,662 respectivamente). Em relação à especificidade, observou-se desempenho idêntico para os dois grupos (70 a 95%), contudo os alunos de radiologia apresentaram sensibilidade ligeiramente superior (70 a 95%). O artigo II verificou, in vitro, se é possível medir com confiabilidade, utilizando a tomografia computadorizada, a distância entre as corticais ósseas e os ápices dentários de molares e pré-molares em mandíbulas humanas secas, além de determinar a relação de proximidade, dos dois grupos, com as corticais. As imagens das peças ósseas foram obtidas por tomografia computadorizada. A partir delas mensurações foram realizadas, por quatro observadores, três não calibrados (A, B e C) e um calibrado (D). A concordância interexaminador, para os observadores A, B e C, assim como a intra para o observador D foram calculadas por meio do Teste de Concordância de Kendall. A partir das médias geradas (observador D) foi calculada a comparação entre os grupos de ápices e as medidas, utilizando os Testes Não-Paramétricos de Kruskal Wallis e Wilcoxon, ambos com a=5%. Uma boa concordância tanto inter quanto intra-examinador foi observada. A tomografia computadorizada mostrou-se reprodutível para a obtenção da distância entre os ápices dentários e as corticais ósseas, tanto na avaliação inter quanto intra-observador. Não foram encontradas diferenças estatisticamente significativas quanto á posição dos ápices de raízes de pré-molares e de molares, contudo os prémolares apresentaram seus ápices significativamente mais próximos da cortical vestibular do que da lingual. O artigo III avaliou o desempenho diagnóstico de radiografias periapicais em diferentes estágios de perda óssea (leve, moderada e severa), digitalmente simulada na região apical. A partir de radiografias trinta ápices dentários de pré-molares e molares inferiores sem radiolucências foram selecionados. As radiografias foram digitalizadas em scanner no modo 8 bits, 300 dpi e armazenadas no formato JPEG 12. Na imagem inicial (original) os sítios apicais selecionados foram demarcados por um quadrado, as mesmas foram digitalmente reproduzidas seis vezes e numeradas em ordem crescente, formando sete conjuntos. A perda óssea foi digitalmente simulada com as ferramentas lápis (modelo mecânico) e spray (modelo químico), com tinta preta, em intensidade de 3%, 5% e 8%. Os pares de imagens (inicial e experimental) e subtrações foram avaliados por três observadores, com repetição de 20% dos casos. O Coeficiente de Correlação de Spearman e o Teste Não Paramétrico de Wilcoxon mostraram uma boa concordância entre a primeira e a segunda medida para os dois modelos, com exceção de um observador. Através da análise das curvas ROC (p> 0,05) observou-se diferença significativa entre os métodos para ambos os modelos nas intensidades de 3% e 5%. Não houve diferença significativa para a intensidade de 8%. A subtração digital qualitativa mostrou desempenho significativamente melhor do que a avaliação de pares de radiografias para ambos os modelos de reabsorção simulada nas intensidades leve e moderada. O artigo IV avaliou, in vitro, os diagnósticos obtidos de pares de radiografias, subtração radiográfica de imagens digitais diretas e digitalizadas em defeitos ósseos periapicais incipientes criados por aplicação de solução ácida. Em quarenta sítios apicais de mandíbulas humanas secas foram criados defeitos ósseos, por meio da aplicação de ácido perclórico 70%, nos tempos 6, 10, 24, 48 e 54 horas. As radiografias convencionais e as imagens digitais diretas foram obtidas duas vezes no tempo zero e, seqüencialmente, antes de cada nova aplicação de ácido. As incidências foram padronizadas fixando os elementos geométricos. As radiografias foram digitalizadas em scanner no modo 8 bits, 300 dpi e armazenadas, assim como as digitais diretas, no formato TIFF. O programa Imagelab foi utilizado para a subtração das imagens digitais indiretas e diretas. A subtração radiográfica das imagens digitalizadas e os pares de imagem digital foram avaliados por um observador experiente, sendo 20% repetidas durante o exame. A análise quantitativa da subtração radiográfica de imagens diretas foi realizada no programa ImageTool. Os resultados das análises qualitativa e quantitativa foram avaliados por meio da ANOVA, sendo a primeira complementada pelo Teste de Comparações Múltiplas Dunnett T3 e a segunda pelo Teste de Tukey, ambos com a=5%. O observador apresentou coeficiente de Kappa = 0,739 para subtração e 0,788 para os pares de imagem. No tempo 0 houve acerto de diagnóstico em 100 e 90% dos casos para subtração e pares de imagem, respectivamente. Nos tempo 6 e 10/24 foram identificadas, para subtração, alterações em 20 e 25% dos casos e para os pares de imagem em 2,5 e 10% dos casos. A proporção de acertos aumentou significativamente nos tempos 48 e 54 horas, tanto para subtração – 80 e 82,5% – quanto para os pares de imagem – 47,5 e 52,5%. A ANOVA evidenciou diferenças estatisticamente significativas entre as áreas controle nos tempos 0/6 e 48/54. Comparando áreas teste e controle, observou-se que aquela apresentou valores médios de densidade óptica significativamente menores nos tempos 24, 48 e 54. Conclui-se que tanto a avaliação qualitativa como a quantitativa de imagens de subtração apresentaram melhor desempenho que a avaliação dos pares de imagem na detecção de defeitos incipientes no periápice.

Estudo molecular e confirmação do aspecto patogênico de mutações novas em pacientes brasileiros com a Síndrome de Morquio A

Introdução: A Síndrome de Morquio A (MPS IVA) é um Erro Inato do Metabolismo do grupo das Doenças Lisossômicas. Esta patologia é caracterizada pelo acúmulo e excreção de queratan e condroitin sulfato devido à deficiência da enzima lisossomal Galactose–6 sulfatase (GALNS; E.C.3.1.6.4). É uma doença rara cuja incidência varia entre 1:45.000 e 1:640.000. Os aspectos clínicos predominantes estão relacionados com o sistema osteo-articular com efeitos secundários sobre o sistema nervoso central, embora não haja déficit cognitivo. Os achados clínicos, evidentes a partir dos 2 anos, direcionam as análises bioquímicas para confirmação do diagnóstico através de avaliação dos glicosaminoglicanos urinários e de ensaios enzimáticos específicos. A doença é herdada de forma autossômica recessiva. O cDNA revela uma região codificante com 1566 nucleotídeos, que determina uma proteína com 522 aminoácidos. O gene contém 14 exons e foi mapeado em 16q24.3. Já foram descritas 148 mutações e 16 polimorfismos. O gene apresenta grande heterogeneidade molecular, sendo que 46,1% das mutações ocorreram menos de três vezes. Objetivo Identificar as mutações presentes no gene da GALNS em pacientes brasileiros com diagnóstico bioquímico para a MPS IVA; verificar se as mutações novas encontradas são causadoras do fenótipo patológico; e padronizar as técnicas de PCR e SSCP para análise do gene da GALNS. Materiais e Métodos: Seis casos-índice tiveram todo o gene da GALNS amplificados por PCR, seguido de seqüenciamento. Para as mutações novas, primers foram confeccionados para os respectivos exons e a patogenicidade testada por análise de freqüência em 100 controles normais. Condições de PCR e SSCP foram determinadas para cada um dos 4 exons com mutações novas. Sete pacientes novos com diagnóstico bioquímico foram analisados para os exons com as condições pré-estabelecidas. Os controles e pacientes com padrão alterado no gel de SSCP foram seqüenciados. Resultados: Em relação aos seis casos-índice 11 dos 12 alelos tiveram a alteração identificada, revelando seis mutações diferentes. Destas, quatro eram novas (p.G116S, p.N164T, p.L307P e p.S341R) e duas já descritas (p.R386C e p.G139S).Dos 100 controles analisados para cada exon nenhum apresentou o mesmo padrão de migração da amostra mutada, mas foram encontradas novas alterações (p.A107A, p.Y108Y e p.P357P). Entre os pacientes novos, sete dos 14 alelos foram identificados (p.N164T, p.G301C e uma mudança do quadro de leitura). Discussão: As quatro mutações novas identificadas foram consideradas patogênicas uma vez que não estavam presentes nos controles, indicando uma freqüência menor que 1% nesse grupo. As mutações p.G116S, p.N164T e p.G301C (freqüências de 14,3%, 14,3% e 19,0% dos alelos, respectivamente) foram consideradas recorrentes, além das já descritas e também recorrentes p.G139S e p.R386C. Nos quatro exons padronizados encontramos 40% das mutações descritas. Entre as diferentes mutações encontradas em nossos casos-índice uma nova (p.G116S) e duas já descritas (p.G139S e p.R386C) se localizam em regiões CpG. Conclusões: Foram identificadas alterações moleculares em 11 dos 12 alelos de seis pacientes brasileiros com MPS IVA, sendo que as quatro mutações novas encontradas puderam ser classificados como patogênicas; as técnicas de PCR e SSCP para os 4 exons do gene da GALNS foram padronizadas.