Transformação genética em cevada por bombardeamento de partículas

A presente Tese de Doutorado objetivou: (1) definir um método eficiente de transformação genética, por bombardeamento de partículas, para a obtenção de plantas transgênicas de cultivares brasileiras de cevada e (2) identificar gene(s) codificante(s) de quitinase(s) potencialmente capaz(es) de conferir resistência ao fungo patogênico de cevada Bipolaris sorokiniana. Culturas de calos obtidos a partir de escutelos imaturos das cultivares Brasileiras de cevada MN-599 e MN-698 (Cia. de Bebidas das Américas, AMBEV) foram bombardeadas com partículas de tungstênio e avaliadas quanto à expressão do gene repórter gusA através de ensaios histoquímicos de GUS e quanto ao efeito dos bombardeamentos na indução estruturas embriogênicas e regeneração de plantas. As condições de biobalística analisadas incluíram a região promotora regulando a expressão de gusA, tipo e pressão de gás hélio de dois aparelhos de bombardeamento, distância de migração das partículas, número de tiros e a realização de pré e pós-tratamento osmótico dos tecidos-alvo. No presente trabalho foram obtidos um número bastante alto de pontos azuis por calo, a indução de calos embriogênicos e embriões somáticos em uma freqüência de até 58,3% e a regeneração de 60 plantas, sendo 43 de calos bombardeados. As melhores condições observadas foram o promotor e primeiro íntron do gene Adh de milho (plasmídeo pNGI), o aparelho de bombardeamento “ Particle Inflow Gun” (PIG) utilizando-se a distância de migração de partículas de 14,8 cm, dois tiros disparados por placa e a realização de tratamento osmótico dos explantes com 0,2 M de manitol e 0,2 M de sorbitol 4-5 horas antes e 17-19 horas depois dos bombardeamentos. Das 43 plantas obtidas de calos bombardeadas, 3 apresentaram atividade de GUS na base das suas folhas. A utilização de primers sintéticos definidos a partir de genes de quitinases descritos na literatura em PCRs resultou na amplificação de dois fragmentos de aproximadamente 700 e 500 pb a partir de DNA total das cvs. MN-599 e MN-698 de cevada e um fragmento, com aproximadamente 500 pb, a partir do DNA total do isolado A4c de Trichoderma sp. Estes fragmentos foram purificados dos géis de agarose e diretamente seqüenciados de forma manual e automática. Os fragmentos de 700 e 500 pb amplificados do genoma da cultivar MN-599 foram identificados como genes de quitinases de cevada e o fragmento de 500 pb do isolado A4c de Trichoderma sp. não apresentou homologia com seqüências conhecidas de quitinases depositadas no EMBL/GenBank. A utilização de novos pares de primers, representando seqüências conservadas de quitinases do fungo Metarhizium anisopliae, resultou na amplificação de 3 fragmentos a partir do DNA total do isolado A4b de Trichoderma sp., que estão sendo purificados para realização de seqüenciamento.

Indicadores biológicos de qualidade do solo

O presente trabalho teve como objetivo avaliar se as variáveis biomassa (BM) e respiração (RM) microbianas e as atividades de β -glucosidase, urease, amidase, fosfatase ácida e aril-sulfatase podem servir como indicadores biológicos de qualidade do solo. Foram realizados três estudos, utilizando um experimento de longa duração que avalia diferentes sistemas de culturas na recuperação do solo. No primeiro, as variáveis acima foram avaliadas durante um ano, e os resultados foram correlacionados com indicadores físicos, químicos e de produtividade dos tratamentos solo descobertoc (SD), pousio/milho, aveia/milho, pousio/milho+lablab, aveia+vica/milho+caupi, guandu/milho+guandu e campo nativo (CN), buscando demonstrar a adequação de seu uso como indicadores biológicos de qualidade, além de observar seus comportamentos quanto a variações sazonais. No segundo, foi avaliada a influência da presença de raízes e da cobertura constante e integral do solo sobre a qualidade biológica, utilizando-se as variáveis acima para comparar o solo quando sob gramínea perene, sob dois sistemas de cultura de milho (com e sem leguminosa em consórcio) ou sob CN e SD. O terceiro estudo avaliou a qualidade do solo, segundo estas variáveis, em função da adição de N em cobertura no milho, em dois sistemas de cultura de milho (com e sem leguminosa em consórcio). Foram verificadas altas correlações entre as variáveis analisadas e teores de C orgânico e N total, além de outros indicadores de qualidade física e de produtividade do solo, confirmando a adequação de seu uso como indicadores biológicos de qualidade. Porém, como seu uso individual pode induzir a erros, foi proposta sua avaliação conjunta, em forma gráfica ou de índice, o que garante resultados mais abrangentes e integrados sobre a qualidade do solo. No segundo estudo, a elevada presença de raízes no tratamento com gramínea perene não garantiu a elevação dos valores das variáveis analisadas aos níveis do solo sob CN, indicando que estes possam estar relacionados à complexidade da comunidade vegetal presente sobre o mesmo e à diversidade microbiana dela resultante. No terceiro estudo, a adição de N em cobertura no milho, consorciado ou não com leguminosa, agiu seletivamente sobre a vida microbiana e sua atividade no solo, não alterando significativamente sua qualidade em termos biológicos. As variáveis avaliadas mostraram-se adequadas para a quantificação da qualidade biológica do solo, e seus resultados sugerem que a rotação e a consorciação de culturas são práticas recomendáveis para a recuperação e a manutenção da mesma em solos cultivados.