Maturação e fecundação "in vitro" de ovócitos de caninos domésticos (Canis familiaris)

Este estudo foi realizado com o objetivo de 1) determinar a eficácia de duas temperaturas (370 C e 390 C) e três intervalos de tempo (48, 72 e 96h) comumente usados na maturação in vitro (MIV) de ovócitos caninos, 2) verificar o efeito de hormônios heterólogos: hormônio folículo estimulante (FSH) 0,5µg/ml, estradiol 20µg/ml e somatotropina humana (hST) 1µg/ml; e o efeito de proteínas: 0,4 % albumina sérica bovina (BSA), 10 % de soro de vaca em estro inativado (SVE), e 10 % soro de cadela em estro inativado (SCE) na maturação nuclear de ovócitos caninos, 3) observar a influência da condição reprodutiva das doadoras de ovários (folicular, diestro, anestro, piometra, e prenhez) sobre os índices de maturação in vitro ovocitária, 4) verificar a habilidade para fecundação in vitro de ovócitos coletados de fêmeas em diferentes estágios do ciclo estral, previamente maturados in vitro e adicionalmente, examinar sua capacidade de desenvolvimento embrionário in vitro. O meio de maturação usado nos experimentos foi TCM-199 suplementado com 25 mM Hepes/l (v/v) com 10 % de soro de vaca em estro inativado (SVE), 50 µg/ml de gentamicina, 2,2 mg/ml de bicarbonato de sódio, 22 µg/ml de ácido pirúvico, 1 µg/ml de estradiol, 0,5 µg/ml de FSH e 0,03 UI/ml de hCG. O meio de maturação era modificado de acordo com a proposta experimental apresentada. Os resultados do primeiro experimento não mostraram diferença estatística no índice de meiose de ovócitos maturados à 37oC ou à 39oC em quaisquer dos intervalos testados (48, 72, 96 horas), embora a proporção de ovócitos que alcançaram metáfase II a 37oC após 72 horas da maturação in vitro, mostrasse uma tendência estatística à significância (p = 0,064), quando comparada àquela dos ovócitos maturados à 39oC. Foi concluído que temperaturas de 37oC e 39oC são similares para maturação in vitro de ovócitos de cadelas. No segundo experimento deste estudo, os índices mais elevados (p < 0,05) de retomada da meiose após 72 horas de maturação in vitro foram obtidos, quando TCM 199 era suplementado com 0,4 % de BSA. Uma influência positiva sobre a aquisição de metáfase II (MII) foi observada com a suplementação de 1µg/ml de hST no meio de maturação. Ao contrário, ovócitos maturados em TCM 199 com 10 % de soro de cadela em estro não se desenvolveram até o estádio de MII. Os resultados deste experimento mostraram que a suplementação de proteínas e de hormônios ao TCM-199 não facilitam as etapas finais da maturação in vitro de ovócitos de cadelas.No terceiro experimento, os resultados de maturação dos ovócitos não mostraram diferença estatística na progressão do material nuclear até o estádio de MII entre os ovócitos provenientes de cadelas em várias condições reprodutivas (fase folicular: 5,4 %; diestro: 4,2 %; anestro: 4,4 %; piometra: 8,1 % e prenhez: 4,7 %). A retomada da meiose mostrou índices de 24,6 % na fase folicular, 19,6 % no diestro, 16,4 % no anestro, 37,1 % na piometra e 29,2 % na prenhez. Índices positivos e mais elevados de resíduo acima do valor esperado foram observados para as condições de piometra e de prenhez nos estádios de metáfase/anáfase I (MI/AI). Nossos resultados indicam que a maturação nuclear in vitro de ovócitos caninos não é influenciada pela condição reprodutiva in vivo da fêmea no momento da coleta ovariana. No experimento de fecundação in vitro (FIV), 888 ovócitos selecionados através de sua qualidade morfológica superior foram distribuídos em 3 grupos de acordo com o estágio do ciclo estral da doadora em: a) folicular, b) anestro, c) luteal . Após período de 48 horas de maturação a 37oC em TCM 199 suplementado com 25 mM Hepes/l (v/v), com 10 % soro de vaca em estro inativado (SVE), 50 µg/ml de gentamicina, 2,2 mg/ml de bicarbonato de sódio, 22 µg/ml de ácido pirúvico, 20 µg/ml de estradiol, 0,5 µg/ml de FSH, 0,03 UI/ml hCG e 1 µg/ml de hST, os ovócitos eram fecundados in vitro (2x106 espermatozóides/ml) por um período de 24 horas. A percentagem de ovócitos nucleados desenvolvendo-se em embriões foi de 10,1 % (27/ 267). O índice de clivagem (2-8 células) após cinco dias da FIV foi similar nas fases reprodutivas (folicular, anestro, e luteal). Contudo, o índice geral de fecundação foi superior nos ovócitos oriundos de cadelas nos estágios folicular (42,4 %) e anestro do ciclo (34,3 %) comparativamente àqueles provenientes da fase luteal (18,6 %) (p < 0,001). Além disso, foi verificada influência da fase folicular sobre o desenvolvimento de pronúcleos, com os índices nesta fase (24,2 %) sendo estatisticamente diferentes daqueles observados no anestro e na fase luteal (9,6 % e 3,7 %, respectivamente) (p < 0,004). Não foi estabelecida correlação entre a proporção de espermatozóides capacitados ou com reação acrossômica e formação pronuclear e/ou percentagem de clivagem. Em resumo, conclui-se que: a) ovócitos caninos podem ser maturados in vitro de forma similar às temperaturas de 39oC e 37o. b) a adição de hormônios (FSH, estradiol, hST) e proteínas (BSA, SVE, SCE) ao meio TCM 199 não eleva os índices de maturação nuclear até o estádio de MII de ovócitos caninos maturados in vitro. c) em cães, a seleção de ovócitos com base na coleta dentro de um estágio específico do ciclo estral não deve ser usada para prever índices de meiose ou habilidade para desenvolvimento embrionário in vitro. d) ovócitos caninos maturados, fecundados e cultivados in vitro podem se desenvolver a zigotos com até 8 células.

Influência da taxa de crescimento e estroda cobertura no desempenho reprodutivo da leitoa.

A inseminação artificial da leitoa é recomendada levando em consideração a idade, o peso, a espessura de toucinho e o ciclo estral no qual se encontra a fêmea. Entretanto, apesar dessas variáveis estarem correlacionadas, nem sempre todos esse índices são obtidos. A leitoa representa alto impacto nos dias-não-produtivos do plantel e é fundamental que seja inseminada no momento correto pois a longevidade e o desempenho reprodutivo da fêmea suína estão diretamente relacionados com o momento dessa inseminação. Esta tese foi dividida em três trabalhos, objetivando avaliar os efeito da idade, do peso, do estro da cobertura e da taxa de crescimento no desempenho reprodutivo da leitoa. O primeiro experimento foi realizado com o objetivo de determinar se leitoas que apresentam maiores taxas de crescimento e apresentam o peso mínimo recomendado para cobertura em uma idade mais precoce podem ser inseminadas sem apresentarem prejuízos reprodutivos ou uma maior taxa de descarte até o 3º parto. Foram formados 3 grupos, conforme o peso e a idade na inseminação. O grupo 1 foi composto pelas fêmeas que apresentaram alta taxa de crescimento (700 g/dia) inseminadas com idade inferior a 210 dias. O grupo 2 foi formado também por leitoas que apresentaram alta taxa de crescimento (700 g) porém que foram inseminadas com idade igual ou superior a 210 dias. O grupo 3 foi formado por fêmeas inseminadas com idade igual ou superior a 210 dias mas que apresentaram baixa taxa de crescimento (< 700 g/dia). Houve um maior número de nascidos totais no primeiro parto para as fêmeas do grupo 2. Entretanto, analisando os 3 primeiros partos, não houve diferença no número médio de leitões produzidos (11,6 x 12,3 x 11,7), na taxa de parto (87,1% x 88,7% x 89,8%) e na taxa de descarte (30,0% x 25,3% x 28,3%) entre as fêmeas dos grupos 1, 2 e 3, respectivamente (p>0.05). O segundo experimento foi desenvolvido com o objetivo de avaliar se existia diferença na idade à puberdade, na taxa de ovulação e na sobrevivência embrionária de leitoas que apresentaram diferenças nas taxas de crescimento. Foram selecionadas 120 leitoas, aos 144 dias de idade, sendo formados 2 grupos, de acordo com a taxa de crescimento na seleção. O grupo 1 foi formado por 60 leitoas que apresentaram taxa de crescimento média de 576 g/d e o grupo 2 por 60 fêmeas que apresentaram taxa de crescimento média de 722 g/d na seleção. As fêmeas foram agrupadas em baias e estimuladas ao desencadeamento da puberdade com o auxílio de machos adultos. As leitoas foram inseminadas a partir de 50 dias após o início do manejo e foram abatidas 30 dias após, para análise das ovulações e do número de embriões. As fêmeas com maiores taxas de crescimento apresentaram puberdade mais precoce (156 x 163 dias; p<0.01) e menor porcentagem de anestro aos 190 dias de idade (3,5% x 20,7%; p<0.01). O terceiro experimento teve por objetivo avaliar a influência do estro da inseminação sobre o desempenho reprodutivo no primeiro parto de leitoas que não apresentaram mesmo peso e idade na inseminação. Foram formados 4 grupos, conforme os estros da inseminação, sendo que as leitoas inseminadas no 1º estro apresentaram menor número de nascidos e menor taxa de parto que as leitoas inseminadas no 3º e 4º estros. Não houve diferença nas taxas de parto e no número de leitões nascidos entre as fêmeas inseminadas no 2º, 3º e 4º estro. Conforme os resultados obtidos nos 3 experimentos, é possível concluir que leitoas podem ser inseminadas a partir do 2º estro e aquelas que apresentam maiores taxas de crescimento têm puberdade mais precoce, menor porcentagem de anestro e podem ser inseminadas mais precocemente, sem prejuízos produtivos até o terceiro parto.