Comparação de diferentes etapas de enriquecimento seletivo no isolamento de Salmonella sp. a partir de fezes de suínos de terminação

A detecção de Salmonella sp. é fundamental nos programas de controle de salmonelose. Métodos de detecção mais eficientes permitem uma melhor determinação do nível de infecção dos rebanhos, um melhor entendimento da epidemiologia da infecção por Salmonella sp. e o desenvolvimento de programas de controle do patógeno, que visem a segurança biológica do alimento. Nos métodos convencionais, o enriquecimento seletivo é uma etapa crítica, pois inibe a microbiota competitiva e permite a multiplicação de Salmonella sp. Vários caldos de enriquecimento seletivo têm sido comparados quanto à eficiência na recuperação de Salmonella sp. a partir de alimentos, contudo existem poucos estudos relativos a fezes de suínos. O objetivo deste trabalho foi comparar caldos de enriquecimento seletivo para o isolamento de Salmonella sp. a partir de fezes de suínos. Numa primeira fase, amostras de fezes foram contaminadas artificialmente e os caldos Rappaport-Vassiliadis incubado a 42°C (RV), Tetrationato Müller-Kauffmann a 37°C (TMK37) e 42°C (TMK42), e Selenito Cistina (SC) a 37°C foram testados, em associação com meios sólidos seletivos: Rambach (RA), Xilose Lisina Tergitol 4 (XLT4), e Verde Brilhante Vermelho de Fenol Lactose Sacarose (VB). Na segunda fase os caldos RV, TMK37 e TMK42, semeados nos meios XLT4 e VB, foram testados com amostras naturalmente contaminadas. Na primeira fase o RV, TMK42 e TMK37 foram mais eficientes que o SC. No isolamento de Salmonella sp. em amostras naturalmente contaminadas os caldos TMK42 e RV foram superiores ao TMK37. O desempenho destes influenciou diretamente a capacidade seletiva e indicadora dos meios sólidos seletivos. No presente estudo, a associação TMK42/XLT4 demonstrou ser mais sensível, e a RV/XLT4 mais específica. O ágar VB também é recomendado para aumentar a probabilidade de detecção do patógeno. Desta forma os caldos RV e TMK42 e o ágar XLT4 e o VB foram considerados os mais indicados para a implantação de protocolos de detecção de Salmonella sp. em fezes suínas.

Estudo de bacteriocinas produzidas por espécies de Enterococcus

As enterocinas são compostos de natureza protéica que apresentam atividade antimicrobiana contra bactérias patogênicas e deteriorantes de alimentos. Por esta razão, nos últimos anos, o interesse por estas substâncias tem aumentado devido ao seu uso potencial como biopreservante de alimentos. Realizando uma triagem com 352 cepas de Enterococcus spp para detectar atividade antimicrobiana, foram encontradas 18 cepas (5%) produtoras de enterocinas, pertencentes às espécies E. faecalis, E. faecium e E. mundtii todas provenientes de amostras de fezes de humanos. Destas cepas foram produzidos sobrenadantes livres de células e realizados testes para caracterização das enterocinas produzidas. As enterocinas produzidas pelas 18 cepas apresentaram o mesmo espectro de atividade antimicrobiana, inibindo 4 espécies do gênero Listeria, Lactobacillus plantarum e Salmonella Enteritidis. Todas foram parcialmente estáveis ao aquecimento (121ºC por 10 minutos), a variações de pH de 2 a 10 e a estocagem por 60 dias a 4ºC e a -20ºC. A sensibilidade a proteases confirmou a natureza protéica destas substâncias antimicrobianas. Com cinco sobrenadantes livres de células foram realizadas curvas de produção de enterocinas e todas iniciaram a produção na fase logarítmica de crescimento, indicando cinética de metabólito primário. Com estes sobrenadantes foi determinado o peso molecular aproximado de 3 KDa, utilizando a técnica de SDS-PAGE. As cepas com atividade antimicrobiana no sobrenadante livre de células não apresentaram os genes para produção das enterocinas A e B, mas 14 cepas de E. faecium apresentaram o gene para enterocina A e 9 para enterocina B, sendo que apenas uma cepa apresentou ambos os genes. Nenhuma das 18 cepas produtoras de enterocinas apresentou atividade hemolítica e presença de adesinas, todas apresentaram cápsula. Os resultados obtidos neste trabalho indicam que estas enterocinas demonstram um potencial aplicabilidade em novos estudos relacionados aos biopreservantes.

Comparação da presença de suínos portadores de Salmonella sp. no início da fase de terminação e ao abate, em três granjas do Rio Grande do Sul

O objetivo deste estudo foi comparar o índice de animais positivos para Salmonella sp. no início da terminação e ao abate e identificar possíveis fontes de contaminação. Em três granjas terminadoras, foram coletados suabes de superfície nas baias e nos silos durante o vazio sanitário; amostras de fezes e sangue dos animais no dia do alojamento; alíquotas de todos os lotes de ração e amostras de sangue, linfonodos mesentéricos (LM) e conteúdo intestinal (CI) dos animais ao abate. As amostras de sangue foram submetidas a testes de ELISA-LPS para Salmonella Tiphymurium, enquanto nas demais amostras pesquisou-se a presença de Salmonella sp. As amostras de ração foram adicionalmente submetidas à técnica da Reação em Cadeia da Polimerase (PCR). Todos animais foram negativos para presença de Salmonella sp. nas fezes no início da terminação, entretanto um pequeno número de animais foi positivo na sorologia. Em duas granjas, havia a contaminação residual no ambiente, enquanto na terceira granja, em um dos lotes de ração, foi detectada a presença de Salmonella sp. pela PCR. Ao abate, acima de 90% dos animais foi positivo no teste de ELISA-LPS, sendo que, em todos os lotes, encontrou-se um número variável (12-92%) de portadores em LM e CI. A partir disso, concluiu-se que a terminação foi a fase crítica para a amplificação da infecção por Salmonella sp., sendo a presença residual do microrganismo na granja e o fornecimento de ração contaminada fontes prováveis de infecção.

Uso de probióticos em crianças HIV positivas : um ensaio clínico randomizado duplo cego (controlado)

Introdução: AIDS é uma infecção caracterizada pela disfunção das células imunes - imunodeficiência, e freqüente disfunção intestinal. Probióticos, suplemento alimentar microbiano vivo, que afeta beneficamente o animal hospedeiro através do balanço da microflora intestinal e promoção de efeitos benéficos à saúde. Objetivos: determinar a resposta imunológica (CD4 cels/mm3) e diminuir os episódios de fezes líquidas. Metodologias: estudo randomizado duplo-cego controlado, com crianças infectadas pelo vírus HIV (2 - 12 anos), divididas em dois grupos – um recebendo probióticos (fórmula contendo Bifidobacterium bifidum e Streptococcus thermophilus – 2,5x1010 ufc) e, o outro, fórmula padrão (grupo controle). Os valores de CD4 foram coletados no início e término do estudo. A consistência e o número de episódios de fezes foram acessados através de um questionário, e duas amostras de fezes foram coletadas para cultura de Cândida. Resultados: observamos aumento da media de células totais de CD4 no grupo (791 cels/mm3), e um pequeno declínio no grupo controle (538 cels/mm3); a diferença das médias foi de 118 cels/mm3 vs. -42 cels/mm3 (p 0.049), analisado estatisticamente pelo delta de logaritmo base 10 do CD4 log10. Observamos uma redução na freqüência de fezes líquidas semelhante nos dois grupos (p 0,06), porém com leve melhora no grupo probiótico, porém sem diferença estatística (p 0,522). Também houve uma leve diminuição da freqüência de fezes pastosa (p 0,955), bem como um aumento na freqüência de fezes normais nos dois grupos (p 0.01). Conclusão: Nosso estudo mostrou as propriedades imunomodulatórias dos probióticos, e que estes podem ser úteis para auxiliar no tratamento de crianças infectadas pelo HIV.

Monitoramento do impacto de dejetos industriais em amostras de água do Rio Caí através do teste SMART em Dorsophila melanogaster

O presente estudo teve como objetivos (i) avaliar a validade do emprego do teste SMART, em Drosophila melanogaster, como indicador da contaminação de amostras de água superficial associada a misturas complexas, (ii) detectar a atividade tóxico-genética de dejetos industriais, lançados no rio Caí, empregando o cruzamento aprimorado. Dentro desta perspectiva, pretendeu também (iii) comparar os dados obtidos para as amostras sob influência de despejos industriais com aqueles previamente observados para amostras sob influência de dejetos de origem urbana, provenientes das cidades de Montenegro e São Sebastião do Caí (Silva., 1999). Na tentativa de avaliar a genotoxicidade, associada ao curso final do rio Caí, foram selecionados os seguintes pontos de coleta de despejos industriais: Km 18,6 - situado na foz do arroio Bom Jardim, próximo à área de disposição do efluente final líquido e da drenagem das áreas de disposição dos resíduos sólidos do complexo industrial – e Km 13,6 - no canal da bacia de acumulação e segurança 7 do pólo industrial Neste ensaio genético, cada amostra industrial foi administrada às larvas de terceiro estágio em duas diluições (25% e 50%), bem como na sua forma crua (100%) - sendo avaliados um total de 40 indivíduos por amostra por concentração, totalizando a análise de 11.712.000 células por amostra. Foram utilizados dois controles negativos, o controle de campo – representado pela nascente de um riacho localizada em uma área conservada com fraca ação antrópica e próxima aos pontos do rio – assim como o diluente água destilada. Uma vez que as freqüências das diferentes categorias de manchas não foram significantemente superiores àquelas observadas nos controles negativos (água destilada), os pontos Km 18,6 e Km 13,6 foram caracterizados como destituídos de ação genotóxica nos três meses de coleta : março, junho e setembro. Estes achados sugerem que, nas condições experimentais empregadas, os dejetos de origem industrial não foram capazes de induzir lesões do tipo mutação gênica, cromossômica, assim como eventos relacionados com recombinação mitótica. Por outro lado, a comparação dos dados obtidos no presente estudo com os observados por Silva (1999) para dejetos urbanos, revelou a validade do emprego do teste SMART como uma ferramenta para detecção de contaminação ambiental. De fato, as amostras urbanas referentes aos meses de março (Km 52, 78 e 80) e setembro (Km 52) – coletadas concomitantemente com as de origem industrial – foram diagnosticadas como indutoras de aneuploidias e/ou de grandes deleções cromossômicas. As potências genotóxicas médias estimadas mostraram que o Km 80 foi o local com o maior grau de genotoxicidade – seguido pelos Km 78 e 52 – que apresentaram potências semelhantes Considerando os resultados obtidos, em cinco pontos situados ao longo do curso final do rio Caí, conclui-se que os prejuízos causados pelos dejetos urbanos podem ser tão ou mais nocivos que os impostos pelos de origem industrial – especialmente em função de seu grande volume de lançamento.

Genotipificação de amostras sorotipificáveis e não sorotipificáveis de Actinobacillus pleuropneumoniae através de RAPD.

Actinobacillus pleuropneumoniae é o agente etiológico da pleuropneumonia suína, enfermidade amplamente distribuída no rebanho suíno mundial, responsável por prejuízos econômicos relevantes. Possui 12 sorotipos, determinados por técnicas de sorotipificação. Além disso é descrita a ocorrência de amostras não sorotipificáveis. O conhecimento do sorotipo prevalente nos surtos da enfermidade é necessário aos programas de profilaxia. Procurando contornar as dificuldades normalmente encontradas na sorotipificação de A. pleuropneumpnoae, a técnica de RAPD foi avaliada na genotipificação de amostras sorotipificáveis e não sorotipificáveis do agente. Foram utilizados amostras ATCC dos 12 sorotipos e amostras dos sorotipos, 1, 3, 5a, 5b, 7, 11 e 12 isolados no Brasil. Os primers OPG e OPG-19, utilizados individualmente nas reações, foram mais adequados para a diferenciação dos sorotipos. O primer OPG-19 detectou polimorfismos semelhantes entrer os sorotipos 1, 3, 4, 5 e 11; e sorotipos 7 e 12. O perfil de RAPD detectado pelo primier OPGF-10 diferenciou os isolados de campo dos sorotipos 1, 7, 11 e 12. Os sorotipos 3 e 5 apresentaram padrão de RAPD semelhantes, sendo diferenciados pelo perfil de exotoxinas característico, determinado previamente através de PCR. Este primer identificou quatro diferentes perfis de RAPD no sorotipo 3. Um destes foi semelhante ao obtido como sorotipo 11. Neste isolado, foi detecta a presença dos genes para ApxI e ApxII, características do sorotipo 11. As amostras do sorotipo 4 apresentaram perfil de RAPD semelhante ao identificado nos sorotipos 3 ou 5 com o primeir OPG-10, sendo identificada, por PCR, a presença dos genes para ApxI e ApxI, os quais não são característicos do sorotipo. Estas amostras foram isoladas em anos posteriores à amostras dos sorotipos 3 e 5 analisadas. Foi possível caracterizar 14 das 14 amostras não sorotipificáveis de A.pleuropneumpniae obtidas de suínos com sinais da doença. Entre as 4 amostras não sorotipificáveis isoladas de leitões sem sinais clínicos, apenas uma foi caracterizada através de RAPD. É possível que as demais amostras sejam outrtas bactérias NAD-dependente isoladas do trato respiratório de suínos. Amostras caracterizadas como A. minor e A. indolicus apresentaram perfis de RAPD divergentes dos identificados em isolados puros de A. pleuropneumoniae, comprovando a capacidade da técnica na caracterização do agente. Diferentes amostras do mesmo sorotipo de A. pleuropneumoniae apresentaram polimorfismos de RAPD idênticos, demonstrando reprodutividade da técnica. Os resultados comprovam a capacidade de tipificação de A. Pleuropneumoniae através de RAPD. A pesquisa de primers adequados para a diferenciação dos sorotipos 3, 4 e 5 aprimorar sua caracterização, o que pode vir a contribuir com as técnicas de sorotipificação tradicionalmente utilizados, ou permitir o uso como método de confirmação nas amostras cuja sorotipificação é problemática.

Avaliação genotóxica pelo teste Salmonella/Microssoma e determinação de contaminantes químicos de amostras de água superficial da bacia do Guaíba

A avaliação do potencial genotóxico é um importante índice da ação do homem sobre os corpos d’água, complementando os critérios legalmente exigidos na avaliação da qualidade de águas. A bacia do Lago Guaíba é a mais importante do Rio Grande do Sul em termos sócio- econômicos, concentrando em suas margens mais da metade da população e 86% da produção do estado. Esse estudo avaliou o potencial mutagênico de amostras não concentradas das águas superficiais dos rios que compõem a bacia hidrográfica do Guaíba, e do próprio Lago Guaíba, pelo ensaio Salmonella/Microssoma. Paralelamente foi analisada a presença de hidrocarbonetos aromáticos policíclicos (criseno e benzo[a]pireno), de pesticidas (pentaclorofenol, organofosforados e carbamatos), e de elementos inorgânicos, buscando uma possível correlação desses com os efeitos mutagênicos encontrados. As amostras apresentaram fraca atividade mutagênica, sendo detectado um único resultado positivo frente a linhagem TA98, na presença de ativação metabólica em águas coletadas no lago Guaíba próximo a um local de liberação de efluente urbano Foram ainda observados cinco indícios de mutagenicidade, indicando a provável presença de compostos de ação indireta sobre o DNA, que causam mutações do tipo substituição nos pares de bases (detectado pela TA100). Os efeitos tóxicos encontrados foram igualmente pouco intensos, podendo estarem relacionados à presença de elementos inorgânicos detectados acima dos limites permitidos pela resolução número 20 do CONAMA. Além disso, observou-se influência sazonal sobre a resposta mutagênica das amostras de água da bacia do Lago Guaíba. Os resultados nos levam a concluir que os rios que formam a Bacia do Guaíba contribuem com uma parte muito pequena da atividade genotóxica das águas do Lago Guaíba, sendo o grande problema a contaminação por esgoto urbano.

Patogenicidade e vacinologia de amostras brasileiras de Herpesvírus bovino tipo 1.

O herpesvírus bovino tipo 1 (BHV-1) está amplamente disseminado no rebanho bovino brasileiro. Visando aprofundar o conhecimento sobre a patogenicidade para o trato respiratório de amostras dos subtipos deste vírus mais freqüentemente encontrados no Brasil (BHV-1.1 e BHV-1.a), isolados autóctones oriundos de casos de doença respiratória foram inoculados em bovinos suscetíveis. As amostras de ambos os subtipos foram capazes de induzir doença respiratória após inoculação pela via intranasal, em intensidade que variou de moderada a grave, independentemente do subtipo de vírus inoculado. Foi ainda caracterizada a resposta imune humoral induzida por tais amostras quanto ao perfil de classes e subclasses de imunoglobulinas, sendo esta igualmente indistinguível com relação aos vírus inoculados. O perfil de classes de imunoglobulinas apresentadas pelos animais permitiu a determinação do status da infecção nos animais inoculados através da análise da resposta sorológica. Na segunda etapa deste trabalho foram testadas as propriedades vacinais de um vírus recombinante, do qual foi deletada a glicoproteína E (gE; 265gE-), gerado a partir de uma amostra brasileira de BHV-1.2a. Experimentos de inoculação do recombinante 265gE- em animais suscetíveis e o desafio destes animais com a amostra parental virulenta demonstraram a segurança e eficácia desta amostra na prevenção de sinais clínicos da infecção pelo BHV-1. Posteriormente, o recombinante 265gE- foi inoculado em vacas em diferentes estágios da gestação. Não foram observadas quaisquer anormalidades nestas gestações e as 22 vacas vacinadas deram à luz a animais saudáveis. Conclui-se que o recombinante é imunogênico e capaz de conferir significativa proteção frente ao desafio com a amostra parental virulenta do vírus. O recombinante também não causou enfermidade nas vacas inoculadas nem tampouco aos fetos quando inoculado em diferentes estágios da gestação.

Avaliação da patogenicidade de amostras de Brachyspira pilosicoli através de técnicas histopatológicas convencionais e por imunohistoquímica.

O presente trabalho objetivou avaliar diferenças na patogenicidade de 19 cepas de B. pilosicoli isoladas de casos de diarréia em suínos no Estado do Rio Grande do Sul. Foi utiliza o modelo experimental em pintos de um dia, que possui boa eficiência quando usado para a infecção oral com a B. pilosicoli, pois permite a consistente colonização cecal dos animais inoculados. Através dessa infecção experimental, buscou-se estabelecer diferenças de patogenicidade entre cepas de referência da B. pilosicoli e cepas dessa espécie isoladas previamente de casos de diarréia em leitões no Rio Grande do Sul. Foram inoculadas 21 cepas de origem suína e duas cepas controle (uma a referência da espécie, P43/6/78 e um isolado humano, P16). Os animais foram inoculados por via oral com uma suspensão de bactérias vivas multiplicadas em meio líquido, num inóculo de 0,8 mL contendo 1x106 espiroquetas na fase logarítmica de crescimento. Decorridos 21 dias após a infecção experimental, os animais foram sacrificados e os cecos fixados em formalina 10% tamponada, processados para exame histológico e os cortes examinados através da coloração pela prata e com uma técnica imunohistoquímica. Com o uso da coloração pela prata, 65% dos animais mostraram colonização pela B. pilosicoli do epitélio do cecal. Houve diferenças no tipo de colonização, consistindo de aderência contínua, aderência focal ou presença de bactérias livres na luz intestinal. Com a técnica de imunohistoquímica, 76,2% das cepas mostraram colonização. Dessa forma, concluiu-se que a imunohistoquímica foi superior à coloração pela prata para a avaliação da colonização intestinal dos pintos, pois foi capaz de detectar 11,2% de cepas colonizadoras a mais do que a coloração pela prata Um segundo experimento visou avaliar a transmissão horizontal da infecção por B. pilosicoli. Para tal, foram mantidos em contato na mesma gaiola, pintos inoculados com a bactéria e animais chamados “contatos”, não inoculados. Com o uso da coloração pela prata, 23,8 % apresentaram-se positivos e, pela imunohistoquímica, 54,2 % foram positivos. Aqui também a imunohistoquímica revelou-se mais eficiente do que a coloração pela prata. Como conclusão desse experimento, as cepas de campo analisadas mostraram alta capacidade de difusão horizontal. Um achado inesperado foi a presença de figuras elongadas dentro do citoplasma das células epiteliais cecais entre alguns animais inoculados. Essas estavam presentes em 33,3 % das cepas, quando analisadas através da coloração pela prata. Pelos dados obtidos, não foi possível concluir que as figuras fossem Brachyspira pilosicoli, pois poderia tratar-se de outra bactéria intracelular ou artefato. Entretanto, como recentemente (no ano de 2003) foi realizado o primeiro registro por microscopia eletrônica de um achado de Brachyspira spp. intracelular, esse achado poderia significar uma alta capacidade invasiva entre as cepas analisadas. Novos estudos serão realizados e, caso comprovado, esse fato poderia auxiliar em muito o entendimento da patogenia da infecção pela B. pilosicoli, pouco clara até o momento.

Estudo longitudinal da infecção por Salmonella sp. em um sistema integrado de produção de suínos.

O presente estudo teve por objetivo acompanhar um lote de suínos durante todas as fases zootécnicas de produção, de forma a demonstrar em que momento os animais eram expostos à contaminação por Salmonella sp. e quando observava-se a soroconversão nos mesmos. A unidade produtora de leitões foi escolhida por ter apresentado uma alta prevalência de leitoas de reposição positivas (32%), em avaliação bacteriológica prévia. As matrizes incluídas no estudo (n=19) foram selecionadas de acordo com a idade gestacional (100 dias), identificadas e amostradas para teste bacteriológico e sorológico. Aos 15 dias de lactação, 15 fêmeas deste grupo foram novamente amostradas, sendo 99 leitões, pertencentes às suas leitegadas, igualmente identificados e incluídos no estudo. Subseqüentemente, todos os leitões foram amostrados aos 38 dias e um subgrupo destes (n=56), aos 59 e 80 dias. Em todas as visitas foram coletados sangue e fezes dos animais, amostras de ração e suabe de arrasto das instalações. Ao abate, de 26 animais do grupo acompanhado no estudo foram coletados sangue, conteúdo intestinal e linfonodos mesentéricos. As baias de espera do frigorífico e o caminhão que transportou o lote de animais para o abate foram amostrados por suabes de arrasto. O isolamento de Salmonella sp. foi confirmado por caracterização bioquímica e sorotipificação. No teste de ELISA foi utilizado antígeno LPS de Salmonella Typhimurium e o ponto de corte foi definido por média de densidade ótica de uma população negativa somado a quatro desvios padrões. Entre as fêmeas da gestação, 94,7% (18/19) foram soropositivas, mas nenhuma apresentou isolamento de Salmonella. Por outro lado, aos 15 dias de lactação, a soroprevalência do grupo reduziu para 66,7% (10/15), mas duas fêmeas estavam excretando Salmonella nas fezes. Os leitões foram negativos no isolamento e na sorologia durante todo período de maternidade e creche. Entretanto, já na primeira coleta realizada na terminação (80 dias de idade), 28,6% (16/56) foram soropositivos e 75% (42/56) estavam excretando Salmonella. Ao abate, houve um aumento na soroprevalência 20/26 (76,9%), e 5/26 (19,2%) animais tiveram isolamento de Salmonella no conteúdo intestinal e/ou linfonodos mesentéricos. A avaliação da contaminação ambiental realizado na granja demonstrou que, apenas após o aparecimento de animais excretores no lote, foram encontrados suabes de arrasto positivos nas instalações. Ao lado disto, foi possível isolar Salmonella de 2/26 amostras de ração, sendo todas as amostras positivas provenientes do período final da terminação. As baias de espera do frigorífico apresentaram 25% dos suabes de arrasto positivos antes da entrada do lote. Em todos os animais positivos durante a terminação foi encontrado o sorovar Typhimurium; dois animais tiveram isolamento concomitante do sorovar Senftenberg. Ao abate, os sorovares Typhimurium e Senftenberg foram encontrados em três e dois animais, respectivamente. Todas as amostras de Salmonella isoladas de ração pertenciam ao sorovar Senftenberg, enquanto que as amostras de baias de espera eram S. Panama. A presença do sorovar Senftenberg em animais durante a terminação e ao abate demonstra a possível relação com a contaminação encontrada nas amostras de ração.