Análise morfológica neural e da densidade de espinhos dendríticos da amígdala medial de ratas durante o ciclo estral

A amígdala medial (AMe) é um núcleo superficial do complexo amigdalói-de, ocupando seu aspecto rostromedial. A AMe modula uma série de comportamen-tos, além de modular a memória e o aprendizado associado a estímulos olfativos e visuais. Em ratos, é uma estrutura sexualmente dimórfica e está dividida em quatro subnúcleos: ântero-dorsal (AMeAD), ântero-ventral (AMeAV), póstero-dorsal (AMePD) e póstero-ventral (AMePV). A AMe apresenta células com características morfológicas variadas e receptores para hormônios gonadais amplamente e heterogeneamente distribuídos entre todos os seus subnúcleos. O presente trabalho teve como obje-tivos caracterizar a morfologia dos neurônios dos subnúcleos AMeAD, AMeAV, AMePD e AMePV de ratas na fase de diestro e verificar a densidade de espinhos dendríticos de neurônios dos subnúcleos AMeAD, AMePD e AMePV de ratas nas fa-ses de diestro, pró-estro, estro e metaestro. Para tal, foram utilizadas ratas Wistar (N=24) que, após a identificação da fase do ciclo estral, foram anestesiadas e per-fundidas, tiveram seus encéfalos retirados e seccionados (cortes coronais de espes-sura de 100 e 200 µm), submetidos à técnica de Golgi. A seguir, os neurônios foram selecionados e desenhados com auxílio de câmara clara acoplada a um fotomicroscópio. Na avaliação da morfologia dos neurônios, observou-se que eles são do tipo multipolar, células estreladas e bitufted, sendo encontrados em todos os subnúcleos da AMe de ratas na fase de diestro além de células com corpos celulares arredondados, fusiformes, piriformes, ovais e com características piramidais. Para a quanti-ficação da densidade de espinhos dendríticos, foram desenhados os primeiros 40 µm de 8 ramos dendríticos de 6 fêmeas por fase do ciclo estral e por subregião da AMe. Os resultados da contagem dos espinhos dendríticos foram submetidos a ANOVA de uma via e ao teste de Newman-Keuls. Verificou-se que, em diestro, a densidade de espinhos nas regiões AMeAD, AMePD e AMePV, foi maior quando comparada às demais fases do ciclo estral. Além disso, em diestro, a AMePD apresentou a maior densidade quando comparada com as regiões AMeAD e AMePV. O estudo mostrou que os neurônios da AMe de ratas estudadas na fase de diestro apresentaram morfologia variada e a densidade de espinhos dendríticos va-riou na AMeAD, AMePD e AMePV durante o ciclo estral de ratas, especialmente na AMePD. Os resultados obtidos sugerem a plasticidade induzida por esteróides se-xuais na morfologia e na fisiologia da AMe de ratas.

Amígdala medial póstero-ventral : caracterização ultra-estrutural e volume somático neuronal em ratos machos e fêmeas ao longo do ciclo estral

A amígdala medial póstero-ventral (MePV) é uma estrutura encefálica onde os hormônios gonadais têm um efeito neurotrófico nos ratos. Os objetivos deste trabalho foram: 1) estimar e comparar o volume somático neuronal da MePV de machos (n=5) e fêmeas nas fases de diestro, proestro e estro (n=5 em cada fase) do ciclo ovariano, além de avaliar o possível efeito na lateralidade em ambos os hemisférios cerebrais. Para tanto utilizou-se a reconstrução estereológica de cortes seriados. 2) Caracterizar os aspectos ultra-estruturais neuronais e descrever a ultra-estrutura dos contatos sinápticos nas diferentes porções de tais células (dendritos, espinhos dendríticos, soma e axônio) da mesma região de ratos machos (n=8) e fêmeas em diestro (n=8). Todos os animais foram manipulados de acordo com os procedimentos éticos, anestesiados e perfundidos por via transcardíaca, tendo seus encéfalos sido removidos, pós-fixados e processados para a microscopia eletrônica. No primeiro experimento, as estimativas do volume somático médio de neurônios da MePV esquerda e direita foram realizadas usando-se o método de Cavalieri associado à técnica de contagem de pontos. Os dados foram comparados entre os grupos usando-se o teste de análise de variância (ANOVA) de duas vias para medidas repetidas e pelo teste post-hoc das mínimas diferenças significativas. O nível de significância estatística foi estabelecido em p < 0,05. A análise estatística dos dados mostrou que houve uma diferença no volume somático da MePV entre os grupos experimentais, machos, fêmeas em diestro, proestro e estro [F(3,16) = 3,42; p = 0,043], mas não houve diferença quanto à lateralidade [F(1,16) = 0,19; p = 0,668] nem na interação entre grupos e lateralidade [F(3,16) = 0,99; p = 0,421]. As comparações post-hoc mostraram que a média do volume dos machos não diferem quando comparados com fêmeas em diestro (p > 0,05), mas foi significativamente maior do que em fêmeas em proestro e em estro (p < 0,05 em ambos os casos). Quando foram comparadas as médias do volume somático da MePV nas diferentes fases do ciclo estral das fêmeas, não houve diferença significativa entre esses todos (p > 0,05). No segundo experimento, secções ultrafinas (70-80 nm) foram analisadas e a ultra-estrutura da MePV descrita. No neuropilo da MePV de machos e fêmeas em diestro, neurônios e suas organelas, dendritos com e sem espinho, processos axonais, feixes axônicos não-mielinizados e poucos axônios mielinizados, processos gliais e vasos sangüíneos foram identificados. Além disso, foram observadas sinapses axo-dendríticas supostamente excitatórias com suas regiões pré-sinápticas contendo vesículas claras arredondadas com algumas achatadas e outras de centro denso. Os dendritos algumas vezes recebem vários terminais axonais sobre um mesmo ramo e axônios contatando com mais de uma estrutura pós-sináptica também foram observados. Os espinhos dendríticos apresentavam diferentes morfologias e geralmente recebiam um único contato sináptico, ainda que se tenha observado espinhos com mais de um terminal em aposição a sua membrana. Sinapses simétricas supostamente inibitórias também foram observadas e geralmente no soma neuronal. Os presentes resultados demonstram que: 1) o volume somático neuronal é um parâmetro sexualmente dimórfico na MePV, sendo maior em machos do que em fêmeas em proestro e estro, mas não em fêmeas em diestro. 2) para evidenciar portanto, os efeitos dos hormônios gonadais nos neurônios da MePV é relevante considerar os estágios do ciclo estral das ratas. 3) o volume somático neuronal não mostrou lateralidade nem interação entre os grupos e lateralidade. 4) as peculiaridades nucleares e citoplasmáticas dos neurônios da MePV de ratos machos e fêmeas em diestro não diferem entre si e são semelhantes àquelas de outras áreas encefálicas. 5) espinhos dendríticos formam somente sinapses assimétricas (tipo I), aparentemente excitatórias, e podem ter mais de um contato sináptico. 6) sinapses simétricas (tipo II), aparentemente inibitórias, ocorrem somente sobre ramos dendríticos proximais e somas neuronais. 7) os terminais axonais formando sinapses foram observadas vesículas claras arredondadas e algumas achatadas e ocasionalmente algumas de centro denso. 8) aparentemente as fêmeas apresentaram maior quantidade de vesículas de centro denso do que em machos. O presente trabalho acrescenta novos achados que são importantes para o estudo da organização celular e sináptica da MePV e que podem se associar a outros dados morfológicos previamente descritos na literatura de modo a aumentar a compreensão que se tem a respeito da atividade funcional dessa área do encéfalo de ratos machos e fêmeas, ainda pouco explorada.

Caracterização ultra-estrutural e volumétrica somática dos neurônios do subnúcleo póstero-dorsal da amígdala medial de ratos adultos

Os objetivos do presente estudo foram descrever a ultra-estrutura neuronal (n=8) e analisar a distribuição dos terminais sinápticos (n=1) no subnúcleo póstero-dorsal da amígdala medial (MePD) de ratos Wistar adultos usando microscopia eletrônica de transmissão e mensurar o volume somático dos neurônios da MePD de ratos (n=5) e ratas em diestro, em proestro e em estro (n=4-5) para revelar diferenças sexuais, do ciclo estral e uma possível lateralidade nesse parâmetro morfológico usando a técnica de reconstrução seriada. Todos os animais foram perfundidos por via transcardíaca e seus encéfalos foram removidos, pós-fixados e processados para microscopia eletrônica. No primeiro experimento, secções ultrafinas (70 nm) foram analisadas e a ultra-estrutura da MePD descrita. No segundo, a estimativa do volume somático neuronal médio da MePD esquerda e direita foi realizada usando-se o método de Cavalieri associado à técnica de contagem de pontos e os dados foram comparados entre os grupos por uma ANOVA de duas vias e o teste post-hoc de Bonferroni. No neurópilo da MePD de machos, dendritos com ou sem espinhos, feixes de axônios não-mielinizados, processos axonais únicos, poucos axônios mielinizados, processos gliais e vasos sangüíneos foram identificados. Sinapses axo-dendríticas foram as mais freqüentemente observadas (58,3%) e foram principalmente excitatórias. Suas regiões pré-sinápticas continham vesículas elétron-lúcidas sozinhas ou mescladas com poucas vesículas de centro denso (DCV). Os dendritos muitas vezes receberam várias sinapses sobre um mesmo ramo, mas terminais axonais contatando mais de uma estrutura pós-sináptica também foram observados. Os espinhos dendríticos apresentaram diferentes morfologias e geralmente recebiam um único contato sináptico excitatório (33,3%). Sinapses axosomáticas (7,3%) excitatórias e inibitórias e sinapses axo-axônicas excitatórias (1%) também foram identificadas. Na MePD, o volume somático neuronal médio apresentou uma diferença estatística entre os grupos estudados (machos e fêmeas nas diferentes fases do ciclo estral) [F(3,37)=5,805; P=0,003], mas nenhum efeito da lateralidade [F(3,37)=0,246; P=0,863] ou interação entre ambos [F(3,37)=0,246; P=0,863]. Os machos (média  desvio-padrão, 2038,03  543,92 e 2113,14  339,87 m3, para a MePD esquerda e direita, respectivamente) apresentaram maior volume somático neuronal médio do que fêmeas em proestro (1521,10  136,82 e 1447,71  120,78 m3; P=0,007) e em estro (1680,67  272,38 e 1551,77  174,40 m3; P=0,035), mas não do que fêmeas em diestro (2028,02  459,07 e 1852,87  385,31 m3; P > 0,05). Enfim, os presentes resultados demonstram que: 1) as características nucleares e citoplasmáticas dos neurônios da MePD são similares àquelas de outras áreas encefálicas; 2) a maioria das sinapses sobre os neurônios da MePD são excitatórias, ocorrendo principalmente sobre ramos e espinhos dendríticos; 3) os espinhos dendríticos da MePD recebem somente um contato sináptico excitatório; 4) terminais sinápticos contendo somente DCV não foram identificados, no entanto, essas vesículas apareceram mescladas às mais numerosas vesículas elétron-lúcidas em todas as regiões dos neurônios da MePD; 5) o volume somático neuronal da MePD é outro parâmetro sexualmente dimórfico; 6) separar as diferentes fases do ciclo estral é de suma importância para revelar a presença dos efeitos dos hormônios gonadais nos neurônios da MePD de ratos; e 7) o volume somático neuronal não se modifica ao longo do ciclo estral, apesar de uma tendência ser observada entre as fêmeas em diestro e proestro. Portanto, o presente trabalho provém novos achados que são relevantes para o estudo da organização celular e sináptica da MePD, que poderiam ser associados a outros dados morfológicos de modo a aumentar nossa compreensão a respeito da atividade funcional dessa área em ratos adultos.

Efeitos da desidroepiandrosterona (DHEA) sobre o comportamento tipo depressivo de ratos machos e fêmeas

A depressão é uma desordem de importância relevante, sendo que as mulheres apresentam o dobro da incidência desta patologia em relação aos homens. No entanto, os trabalhos realizados em modelos animais não conseguem reproduzir estas condições consistentemente. DHEA é um neuroesteróide que está relacionado à depressão. Suas concentrações estão alteradas em pacientes deprimidos e já tem sido usada na clínica, produzindo, no entanto, resultados contraditórios. O objetivo deste trabalho foi investigar os efeitos da administração de desidroepiandrosterona (DHEA) sobre o comportamento tipo depressivo e níveis hormonais de ratos, machos e fêmeas em diferentes fases do ciclo estral, submetidos ao teste do nado forçado, um modelo animal de depressão. Para isto, foram utilizados ratos Wistar, adultos, machos e fêmeas em diestro II e em proestro, 8 por grupo. Receberam injeções intraperitoneais de DHEA: 0; 2; 10 e 50 mg/kg, nos tempos de 24, 5 e 1 h antes do teste do nado forçado. No primeiro dia os animais foram treinados por 15 minutos em aquários contendo água a 25o 1 e 27 cm de profundidade. Após 24 h, foram recolocados no aquário e seus comportamentos gravados por 5 minutos para análise posterior. Os comportamentos foram analisados detalhadamente: head-shake, mergulho, imobilidade (flutuar + congelar) e mobilidade (nadar + escalar). Trinta minutos após o nado, os animais foram mortos e o sangue troncular coletado, para posterior dosagem de DHEA e corticosterona séricas. Um experimento para complementar a curva dose-resposta foi realizado, com a dose de 1 mg/kg, com machos, porém, experimento crônico, onde, no dia seguinte ao treino, os animais receberam a sem resultados significativos nos comportamentos. Foi realizado, então, primeira injeção de DHEA, na dose de 2 mg/kg, com intervalos de 24 horas, durante dois ciclos estrais completos das fêmeas. No dia seguinte à última injeção, os animais foram submetidos ao teste do nado, com duração de 5 minutos e seus comportamentos gravados e analisados. O sangue troncular foi coletado trinta minutos após o nado, para as dosagens de DHEA e corticosterona séricas. Para fins de comparação, DHEA e corticosterona sériica de ratos machos, fêmeas em proestro e em diestro II não submetidos ao nado, foram dosados por radioimunoensaio. No experimento agudo, DHEA, na dose de 2 mg/kg aumentou o tempo de congelar para o grupo proestro. As concentrações séricas de DHEA e de corticosterona aumentaram significativamente. As fêmeas responderam com aumento destes hormônios significativamente maior dos que os machos. No experimento crônico, machos e fêmeas apresentaram diferenças em comportamentos no teste do nado forçado, dependendo de estímulos estressores continuados, evidenciado pelo maior tempo de escalar das fêmeas controle em diestro II. Tratamento com DHEA aumentou o tempo de escalar e a imobilidade das fêmeas no diestro II. As concentrações de DHEA e de corticosterona não aumentaram em relação ao basal, e as diferenças de sexo desapareceram, indicando uma correlacão das respostas de corticosterona e DHEA com eventos estressores interagindo com os hormônios sexuais e o tempo de estresse experimentado. A maior resposta hormonal das fêmeas no experimento agudo parece ter impedido a resposta comportamental no nado. Após manipulação crônica, houve adaptação desta resposta e o efeito depressivo de DHEA apareceu. Estes resultados são importantes especialmente quando consideradas estratégias para o tratamento da depressão e doenças relacionadas ao estresse.

Participação do sistema colinérgico muscarínico hipocampal no processo de evocação da memória em ratos

Introdução: O sistema colinérgico muscarínico apresenta uma função essencialmente modulatória, agindo, principalmente, sobre neurônios inibitórios e excitatórios. As aferências colinérgicas que atingem o sistema límbico, principalmente na formação hipocampal e na amígdala, evidenciam a participação desse sistema nos mecanismos de aprendizagem e memória. Agentes farmacológicos convencionais não são seletivos entre os diferentes subtipos de receptores colinérgicos muscarínicos (M1 – M5). As toxinas muscarínicas extraídas da peçonha da serpente mamba verde africana, têm-se mostrado ferramentas úteis na investigação do papel específico de cada tipo de receptor na memória. Os mecanismos modulatórios do sistema colinérgico muscarínico nos processos de aquisição e consolidação já foram extensivamente estudados, porém ainda são restritos dados referentes à participação desse sistema no processo de evocação. Objetivos: estudar a participação dos receptores colinérgicos muscarínicos na evocação da memória através da utilização pré-teste de fármacos pouco seletivos, como a escopolamina, pirenzepina (antagonistas) e oxotremorina (agonista); comparando com fármacos seletivos, como as toxinas muscarínicas MT3 (antagonista seletivo para o receptor M4) e MT2 (agonista seletivo para receptor M1 com atividade menos seletiva de antagonista M4) nas tarefas comportamentais de Esquiva Inibitória e Habituação ao Campo Aberto. Material e Métodos: ratos Wistar machos foram canulados bilateralmente no hipocampo dorsal. Após a recuperação da cirurgia, foram treinados na tarefa de Esquiva Inibitória (EI), com choque de 0,5 mA (3 s). Após 24 horas, receberam uma infusão intra-hipocamapal de escopolamina (0,5, 2,0 e 8,0 μg por lado), de oxotremorina (2,5 e 5 ng por lado), de pirenzepina (0,5 μg por lado), de MT3 (0,5, 1,0 e 2,0 μg por lado), de MT2 (0,75, 1,0 e 6,0 μg por lado) ou de TFS (grupo controle de todos os fármacos). Dez minutos após a infusão, os animais foram testados na EI. A latência de descida da plataforma no teste é o índice de memória da tarefa. Um procedimento semelhante foi aplicado no experimento com a tarefa comportamental de habituação ao campo aberto (menos aversiva que a esquiva inibitória), porém apenas foi utilizado a escopolamina e a MT3 (ambas 2,0 μg por lado); essa tarefa sérvio como um “controle motor” para a tarefa de esquiva inibitória Resultados: Os antagonistas colinérgicos muscarínicos escopolamina, pirenzepina e MT3 (doses, respectivamente, de 2,0 μg por lado, 0,5 μg por lado e 2,0 μg por lado), juntamente com a MT2 (agonista M1-seletivo, dose de 0,75 μg por lado) apresentaram um efeito facilitatório sobre a evocação da tarefa de Esquiva Inibitória. Além disso, o agonista pouco seletivo oxotremorina teve um efeito amnésico parcial nessa tarefa. A escopolamina e MT3 não tiveram qualquer efeito na evocação da tarefa de habituação ao campo aberto. Discussão: nossos resultados, obtidos com antagonistas, sugerem uma participação inibitória do sistema colinérgico muscarínico sobre o processo de evocação da memória aversiva da esquiva inibitória, porém, analisando a seletividade da MT3, podemos inferir uma atividade inibitória exclusiva do receptor M4. Esse resultado, entretanto, é contrário ao encontrado com a administração desses mesmos antagonistas no período pós-treino, demonstrando um papel oposto desse sistema entre os processos de consolidação e evocação. Além disso, o receptor M1 excitatório modula positivamente a evocação. A ausência de efeito dos fármacos na habituação ao campo aberto indica que o efeito na esquiva inibitória é cognitivo, e não motor ou exploratório.

Alterações endócrinas do eixo hipotálamo-hipófise-gônadas em ratas manipuladas no período neonatal

A manipulação no período neonatal tem sido utilizada há algumas décadas como modelo experimental para analisar os mecanismos pelos quais variações precoces no ambiente do animal afetam o desenvolvimento de sistemas neurais, dando origem a alterações comportamentais e neuroendócrinas estáveis na vida adulta. Nos ratos, a manipulação neonatal consiste do manuseio suave dos filhotes nos primeiros dias de vida em geral, durante as duas semanas após o parto. Quando adultos, os animais submetidos a essa manipulação apresentam uma menor secreção de glicocorticóides pela adrenal quando expostos a estímulos estressores, e um retorno mais rápido à concentração plasmática basal quando comparados aos ratos não manipulados. Trabalhos prévios demonstram que além de alterar o eixo hipotálamo-hipófise-adrenal, a manipulação pode alterar o eixo hipotálamo-hipófise-gônadas, ratas manipuladas apresentam ciclos anovulatórios e uma diminuição do comportamento sexual. Com isso, o nosso objetivo nesse trabalho foi analisar o perfil de secreção de estradiol e progesterona em ratas manipuladas no período neonatal nas quatro fases do ciclo estral, como também, verificar o efeito da manipulação sobre as concentrações plasmáticas de LH e FSH em ratas ovariectomizadas e com reposição hormonal No experimento I foram estudados dois grupos de ratas adultas: não manipuladas (fêmeas que nos 10 primeiros dias de vida não foram tocadas pelo experimentador ou tratador); e manipuladas (ratas que nos 10 primeiros dias pós-parto foram diariamente manipuladas pelo experimentador por 1 minuto, retornando para a mãe logo em seguida). Quando adultas, o ciclo estral das ratas foi controlado, e aquelas com 3 a 4 ciclos regulares seguidos tiveram a veia jugular externa canulada em cada uma das fases do ciclo estral (metaestro, diestro, estro e proestro). No dia seguinte ao da cirurgia às 8 horas da manhã, iniciaram-se as coletas de sangue (800µL) de 3 em 3 horas. O sangue foi centrifugado, o plasma coletado e destinado ao radioimunoensaio para estradiol e progesterona. As ratas cujo sangue foi coletado no proestro tiveram o número de óvulos contados na manhã seguinte. No experimento II, as ratas manipuladas e não manipuladas foram ovariectomizadas e 3 semanas após receberam injeções subcutâneas de estradiol por 3 dias consecutivos às 9 horas da manhã, no quarto dia receberam progesterona às 10 horas e às 11 horas tiveram a veia jugular canulada Neste mesmo dia às 13 horas, iniciaram-se as coletas de sangue (600µL) que foram realizadas de hora em hora, até às 18 horas. O sangue foi centrifugado o plasma coletado e destinado ao radioimunoensaio para LH e FSH. Os resultados mostraram que as ratas manipuladas no período neonatal apresentam uma redução nas concentrações plasmáticas de estradiol no proestro e de progesterona no metaestro e no estro comparadas às não manipuladas. O número de óvulos encontrados na manhã do estro está reduzido nas ratas manipuladas quando comparado às não manipuladas, confirmando resultados prévios. A alteração destes esteróides gonadais pode explicar a redução do número de óvulos das fêmeas manipuladas. As concentrações plasmáticas de LH e de FSH não são diferentes entre os dois grupos, indicando que a responsividade do eixo hipotálamo-hipófise parece não ser alterada pela manipulação, no entanto é necessário realizar mais experimentos para que afirmações possam ser feitas a respeito da responsividade do eixo.

Maturação e fecundação "in vitro" de ovócitos de caninos domésticos (Canis familiaris)

Este estudo foi realizado com o objetivo de 1) determinar a eficácia de duas temperaturas (370 C e 390 C) e três intervalos de tempo (48, 72 e 96h) comumente usados na maturação in vitro (MIV) de ovócitos caninos, 2) verificar o efeito de hormônios heterólogos: hormônio folículo estimulante (FSH) 0,5µg/ml, estradiol 20µg/ml e somatotropina humana (hST) 1µg/ml; e o efeito de proteínas: 0,4 % albumina sérica bovina (BSA), 10 % de soro de vaca em estro inativado (SVE), e 10 % soro de cadela em estro inativado (SCE) na maturação nuclear de ovócitos caninos, 3) observar a influência da condição reprodutiva das doadoras de ovários (folicular, diestro, anestro, piometra, e prenhez) sobre os índices de maturação in vitro ovocitária, 4) verificar a habilidade para fecundação in vitro de ovócitos coletados de fêmeas em diferentes estágios do ciclo estral, previamente maturados in vitro e adicionalmente, examinar sua capacidade de desenvolvimento embrionário in vitro. O meio de maturação usado nos experimentos foi TCM-199 suplementado com 25 mM Hepes/l (v/v) com 10 % de soro de vaca em estro inativado (SVE), 50 µg/ml de gentamicina, 2,2 mg/ml de bicarbonato de sódio, 22 µg/ml de ácido pirúvico, 1 µg/ml de estradiol, 0,5 µg/ml de FSH e 0,03 UI/ml de hCG. O meio de maturação era modificado de acordo com a proposta experimental apresentada. Os resultados do primeiro experimento não mostraram diferença estatística no índice de meiose de ovócitos maturados à 37oC ou à 39oC em quaisquer dos intervalos testados (48, 72, 96 horas), embora a proporção de ovócitos que alcançaram metáfase II a 37oC após 72 horas da maturação in vitro, mostrasse uma tendência estatística à significância (p = 0,064), quando comparada àquela dos ovócitos maturados à 39oC. Foi concluído que temperaturas de 37oC e 39oC são similares para maturação in vitro de ovócitos de cadelas. No segundo experimento deste estudo, os índices mais elevados (p < 0,05) de retomada da meiose após 72 horas de maturação in vitro foram obtidos, quando TCM 199 era suplementado com 0,4 % de BSA. Uma influência positiva sobre a aquisição de metáfase II (MII) foi observada com a suplementação de 1µg/ml de hST no meio de maturação. Ao contrário, ovócitos maturados em TCM 199 com 10 % de soro de cadela em estro não se desenvolveram até o estádio de MII. Os resultados deste experimento mostraram que a suplementação de proteínas e de hormônios ao TCM-199 não facilitam as etapas finais da maturação in vitro de ovócitos de cadelas.No terceiro experimento, os resultados de maturação dos ovócitos não mostraram diferença estatística na progressão do material nuclear até o estádio de MII entre os ovócitos provenientes de cadelas em várias condições reprodutivas (fase folicular: 5,4 %; diestro: 4,2 %; anestro: 4,4 %; piometra: 8,1 % e prenhez: 4,7 %). A retomada da meiose mostrou índices de 24,6 % na fase folicular, 19,6 % no diestro, 16,4 % no anestro, 37,1 % na piometra e 29,2 % na prenhez. Índices positivos e mais elevados de resíduo acima do valor esperado foram observados para as condições de piometra e de prenhez nos estádios de metáfase/anáfase I (MI/AI). Nossos resultados indicam que a maturação nuclear in vitro de ovócitos caninos não é influenciada pela condição reprodutiva in vivo da fêmea no momento da coleta ovariana. No experimento de fecundação in vitro (FIV), 888 ovócitos selecionados através de sua qualidade morfológica superior foram distribuídos em 3 grupos de acordo com o estágio do ciclo estral da doadora em: a) folicular, b) anestro, c) luteal . Após período de 48 horas de maturação a 37oC em TCM 199 suplementado com 25 mM Hepes/l (v/v), com 10 % soro de vaca em estro inativado (SVE), 50 µg/ml de gentamicina, 2,2 mg/ml de bicarbonato de sódio, 22 µg/ml de ácido pirúvico, 20 µg/ml de estradiol, 0,5 µg/ml de FSH, 0,03 UI/ml hCG e 1 µg/ml de hST, os ovócitos eram fecundados in vitro (2x106 espermatozóides/ml) por um período de 24 horas. A percentagem de ovócitos nucleados desenvolvendo-se em embriões foi de 10,1 % (27/ 267). O índice de clivagem (2-8 células) após cinco dias da FIV foi similar nas fases reprodutivas (folicular, anestro, e luteal). Contudo, o índice geral de fecundação foi superior nos ovócitos oriundos de cadelas nos estágios folicular (42,4 %) e anestro do ciclo (34,3 %) comparativamente àqueles provenientes da fase luteal (18,6 %) (p < 0,001). Além disso, foi verificada influência da fase folicular sobre o desenvolvimento de pronúcleos, com os índices nesta fase (24,2 %) sendo estatisticamente diferentes daqueles observados no anestro e na fase luteal (9,6 % e 3,7 %, respectivamente) (p < 0,004). Não foi estabelecida correlação entre a proporção de espermatozóides capacitados ou com reação acrossômica e formação pronuclear e/ou percentagem de clivagem. Em resumo, conclui-se que: a) ovócitos caninos podem ser maturados in vitro de forma similar às temperaturas de 39oC e 37o. b) a adição de hormônios (FSH, estradiol, hST) e proteínas (BSA, SVE, SCE) ao meio TCM 199 não eleva os índices de maturação nuclear até o estádio de MII de ovócitos caninos maturados in vitro. c) em cães, a seleção de ovócitos com base na coleta dentro de um estágio específico do ciclo estral não deve ser usada para prever índices de meiose ou habilidade para desenvolvimento embrionário in vitro. d) ovócitos caninos maturados, fecundados e cultivados in vitro podem se desenvolver a zigotos com até 8 células.

Avaliação da função reprodutiva em ratas submetidas ao clampeamento da artéria renal esquerda modelo 2 rins/1 clipe

No modelo de hipertensão renovascular, a redução do fluxo sangüíneo para o rim causada pela aplicação de um clipe na artéria renal, modelo 2 Rins/ 1 Clipe (2R/1C), leva à secreção de renina e um aumento secundário na concentração de angiotensina II (Ang II) periférica, que tem papel na elevação da pressão arterial. Além de seu efeito vasopressor a Ang II tem envolvimento na fisiologia reprodutiva. A Ang II está envolvida na regulação da secreção do hormônio liberador do hormônio luteinizante (LHRH), ovulação, e comportamento sexual em ratos machos e fêmeas. Nosso objetivo nesse trabalho foi analisar a regularidade do ciclo estral após a implantação do clipe, o comportamento sexual, peso ovariano, ovulação, como também, verificar as concentrações plasmáticas de estradiol, hormônio luteinizante (LH) e hormônio folículo estimulante (FSH) durante a tarde do proestro em ratas submetidas ao modelo 2R/1C. Dos animais clipados, em torno de 55% apresentaram pressão arterial sistólica (PAS) maior que 150 mmHg, dessa forma os animais neste estudo foram divididos em três grupos: grupo de ratas FICT (submetidas à cirurgia fictícia), grupo 2R/1C (fêmeas submetidas à laparotomia, com dissecação da artéria renal esquerda, para a implantação de um clipe de prata de 0,15mm de diâmetro, e que apresentavam PAS <125 mmHg), e 2R/1C-H (fêmeas submetidas ao modelo 2R/1C e que apresentavam PAS >150 mmHg). O sangue foi centrifugado, o plasma coletado foi destinado ao radioimunoensaio para estradiol, LH, e FSH. Ao final das coletas as ratas retornaram ao biotério, e na manhã seguinte (fase estro), tiveram os ovários coletados, pesados separadamente, e em seguida foi realizada a contagem do número de óvulos. Os resultados mostraram que ratas 2R/1C-H e 2R/1C apresentam um maior tempo, em dias, para o retorno às mudanças de fases do ciclo estral, após a cirurgia. Ratas 2R/1C-H apresentaram redução na freqüência de lordose e um menor quociente de lordose (Freqüência de lordose/Freqüência de monta). Foi verificada redução no número de óvulos nos animais 2R/1C-H e 2R/1C quando comparado ao grupo FICT. As concentrações plasmáticas de estradiol e FSH na tarde do proestro não foram diferentes entre os grupos, porém a concentração plasmática de LH no grupo hipertenso foi menor às 16:00h em relação ao demais grupos. A redução no número de óvulos em ratas 2R/1C-H e 2R/1C, na fase estro, foi confirmada no experimento II, porém esta não foi acompanhada por alteração no peso do ovário direito e esquerdo. Em conjunto nossos resultados demonstraram que ratas 2R/1C-H apresentam redução na capacidade reprodutiva, que não foi associada a alterações nas concentrações plasmáticas de estradiol e FSH, mas sim a uma modificação do perfil da curva de secreção de LH na tarde do proestro. Sugere-se que a redução na função reprodutiva verificada seja devido ao aumento de Ang II e/ou elevação da pressão arterial.

Efeitos da manipulação neonatal sobre a concentração plasmática de hormônios da reprodução e a densidade de receptores de angiotensina II no sistema nervoso central de ratas adultas

A manipulação neonatal é um modelo experimental utilizado para avaliar o modo pelo qual interferências precoces na vida do animal podem alterar funções neuroendócrinas e comportamentos na vida adulta. O procedimento de manipulação neonatal, além de alterar a atividade do eixo hipotálamo-hipófise-adrenal (eixo HPA) em ratos machos e fêmeas, pode causar profundas mudanças na função reprodutiva de ratas adultas. De fato, há evidências de que a manipulação neonatal diminui a atividade do eixo HPA através da redução da síntese e secreção de hormônios que são liberados quando os animais são expostos ao estresse na vida adulta e, além disso, induz à presença de ciclos anovulatórios e diminui a receptividade sexual de ratas. Considerando essas alterações induzidas pela manipulação neonatal que são relacionadas à função reprodutiva de ratas, essa tese teve por objetivo estudar as possíveis causas da alteração no comportamento sexual e ovulação induzidas pela manipulação neonatal. Para isto, além de estudar o perfil hormonal desses animais, o que incluiu os esteróides gonadais, as gonadotrofinas e a prolactina (PRL) em diferentes fases e horários do ciclo estral, o conteúdo do hormônio liberador de gonadotrofinas (LHRH) em algumas regiões do sistema nervoso central (SNC) e na eminência mediana (EM); foi avaliada a possível participação do sistema angiotensinérgico central, através da análise da densidade dos receptores de angiotensina II (Ang II) pela técnica de auto-radiografia, na mediação dos efeitos da manipulação neonatal sobre a função do eixo hipotálamo-hipófise-gônada (eixo HPG) e do eixo HPA. O presente estudo confirmou dados obtidos em nosso laboratório sobre a redução do comportamento sexual e da ovulação em ratas manipuladas no período neonatal. Na tarde do proestro, período no qual ocorrem os eventos necessários para a ovulação na próxima fase do ciclo estral, os resultados mostram que os animais do grupo manipulado têm redução significativa da concentração plasmática de estradiol, de gonadotrofinas e de PRL, assim como um aumento no conteúdo de LHRH na área pré-óptica medial (APOM). A manipulação neonatal também reduziu a concentração plasmática de progesterona analisada após o coito que pode ser decorrente da reduzida estimulação vaginocervical recebida por essas ratas, já que houve uma redução significativa da freqüência de intromissão realizada pelo macho sobre as ratas do grupo manipulado. A densidade de receptores de Ang II na APOM e no núcleo paraventricular do hipotálamo (PVN) também foi alterada pela manipulação neonatal, pois houve redução significativa na densidade desses receptores nessas duas regiões. Em conclusão, a manipulação neonatal reduz profundamente a atividade do eixo HPG e essa alteração é causada por modificações nas concentrações de estradiol no plasma que, por sua vez, pode alterar a secreção de LHRH, de gonadotrofinas e de PRL, comprometendo dessa maneira a ovulação e a receptividade sexual. Contribuindo para os efeitos deletérios da manipulação neonatal sobre a função reprodutiva em ratas, este procedimento pode alterar a implantação do blastocisto devido à redução da secreção de progesterona observada após o coito no grupo manipulado. Alguns dos efeitos da manipulação neonatal parecem ser mediados pelo sistema angiotensinérgico central, como o aumento do conteúdo de LHRH na APOM e a diminuída resposta do eixo HPA observada em animais manipulados submetidos a situações estressantes na vida adulta.

Influência da taxa de crescimento e estroda cobertura no desempenho reprodutivo da leitoa.

A inseminação artificial da leitoa é recomendada levando em consideração a idade, o peso, a espessura de toucinho e o ciclo estral no qual se encontra a fêmea. Entretanto, apesar dessas variáveis estarem correlacionadas, nem sempre todos esse índices são obtidos. A leitoa representa alto impacto nos dias-não-produtivos do plantel e é fundamental que seja inseminada no momento correto pois a longevidade e o desempenho reprodutivo da fêmea suína estão diretamente relacionados com o momento dessa inseminação. Esta tese foi dividida em três trabalhos, objetivando avaliar os efeito da idade, do peso, do estro da cobertura e da taxa de crescimento no desempenho reprodutivo da leitoa. O primeiro experimento foi realizado com o objetivo de determinar se leitoas que apresentam maiores taxas de crescimento e apresentam o peso mínimo recomendado para cobertura em uma idade mais precoce podem ser inseminadas sem apresentarem prejuízos reprodutivos ou uma maior taxa de descarte até o 3º parto. Foram formados 3 grupos, conforme o peso e a idade na inseminação. O grupo 1 foi composto pelas fêmeas que apresentaram alta taxa de crescimento (700 g/dia) inseminadas com idade inferior a 210 dias. O grupo 2 foi formado também por leitoas que apresentaram alta taxa de crescimento (700 g) porém que foram inseminadas com idade igual ou superior a 210 dias. O grupo 3 foi formado por fêmeas inseminadas com idade igual ou superior a 210 dias mas que apresentaram baixa taxa de crescimento (< 700 g/dia). Houve um maior número de nascidos totais no primeiro parto para as fêmeas do grupo 2. Entretanto, analisando os 3 primeiros partos, não houve diferença no número médio de leitões produzidos (11,6 x 12,3 x 11,7), na taxa de parto (87,1% x 88,7% x 89,8%) e na taxa de descarte (30,0% x 25,3% x 28,3%) entre as fêmeas dos grupos 1, 2 e 3, respectivamente (p>0.05). O segundo experimento foi desenvolvido com o objetivo de avaliar se existia diferença na idade à puberdade, na taxa de ovulação e na sobrevivência embrionária de leitoas que apresentaram diferenças nas taxas de crescimento. Foram selecionadas 120 leitoas, aos 144 dias de idade, sendo formados 2 grupos, de acordo com a taxa de crescimento na seleção. O grupo 1 foi formado por 60 leitoas que apresentaram taxa de crescimento média de 576 g/d e o grupo 2 por 60 fêmeas que apresentaram taxa de crescimento média de 722 g/d na seleção. As fêmeas foram agrupadas em baias e estimuladas ao desencadeamento da puberdade com o auxílio de machos adultos. As leitoas foram inseminadas a partir de 50 dias após o início do manejo e foram abatidas 30 dias após, para análise das ovulações e do número de embriões. As fêmeas com maiores taxas de crescimento apresentaram puberdade mais precoce (156 x 163 dias; p<0.01) e menor porcentagem de anestro aos 190 dias de idade (3,5% x 20,7%; p<0.01). O terceiro experimento teve por objetivo avaliar a influência do estro da inseminação sobre o desempenho reprodutivo no primeiro parto de leitoas que não apresentaram mesmo peso e idade na inseminação. Foram formados 4 grupos, conforme os estros da inseminação, sendo que as leitoas inseminadas no 1º estro apresentaram menor número de nascidos e menor taxa de parto que as leitoas inseminadas no 3º e 4º estros. Não houve diferença nas taxas de parto e no número de leitões nascidos entre as fêmeas inseminadas no 2º, 3º e 4º estro. Conforme os resultados obtidos nos 3 experimentos, é possível concluir que leitoas podem ser inseminadas a partir do 2º estro e aquelas que apresentam maiores taxas de crescimento têm puberdade mais precoce, menor porcentagem de anestro e podem ser inseminadas mais precocemente, sem prejuízos produtivos até o terceiro parto.

Estudo sobre a ação dos hormônios gonadais na densidade de espinhos dendríticos na amígdala medial póstero-dorsal de ratas

A amígdala medial (AMe) é um núcleo superficial do complexo amigdalóide e que ocupa seu aspecto rostromedial. A AMe modula uma série de comportamentos além de modular a memória e o aprendizado associado a estímulos olfativos e visuais. Em ratos é uma estrutura sexualmente dimórfica e está dividida em quatro subnúcleos: ântero-dorsal (AMeAD), ântero-ventral (AMeAV), póstero-dorsal (AMePD) e pósteroventral (AMePV). A AMe apresenta células com características morfológicas variadas e receptores para hormônios gonadais amplamente distribuídos entre todos os seus subnúcleos, mas principalmente na AMePD. O presente trabalho teve por objetivo estudar a ação dos esteróides sexuais na densidade de espinhos dendríticos na AMePD de ratas ovariectomizadas e se sua ação pode ser mediada pelos receptores do tipo NMDA. Para tanto, foram utilizadas ratas Wistar adultas (n = 6 por grupo experimental, descritos a seguir) que foram ovariectomizadas e injetadas com veículo oleoso (“O”; 0,1ml s.c.); benzoato de estradiol (“BE”; 10μg/0,1ml s.c.); benzoato de estradiol e progesterona (“BE+P”; 10μg/0,1ml e 500μg/0,1ml s.c.). Adicionalmente, foram estudadas fêmeas ovariectomizadas e que receberam benzoato de estradiol e salina (“BE+S”; 10μg/0,1ml s.c. e 0,2 ml i.p.) ou benzoato de estradiol e LY235959, antagonista específico dos receptores do tipo NMDA para o glutamato (“BE+LY235959”; 10μg/0,1ml s.c. e 3mg/Kg i.p.). Todas as injeções foram feitas ao longo de 4 dias. Cinco horas após a última injeção, os animais foram anestesiados e submetidos à técnica de Golgi do tipo “single-section”. Os encéfalos foram seccionados em vibrátomo e os cortes foram colocados, após fixação, em solução de bicromato de potássio e, a seguir, em nitrato de prata. Neurônios bem impregnados e indubitavelmente presentes na AMePD foram selecionados para estudo. Os espinhos presentes nos primeiros 40 μm dendríticos foram desenhados com auxílio de uma câmara clara acoplada a microscópio óptico em aumento de 1000X. Cada animal teve 8 ramos dendríticos selecionados, um por neurônio diferente, perfazendo 48 ramos ao total em cada grupo experimental. Os valores obtidos foram submetidos à análise de variância (ANOVA) de uma via e ao teste post hoc de Bonferroni (primeiros 3 grupos) ou ao teste “t” de Student não-pareado (últimos 2 grupos), ambos com α = 5%. Os resultados indicaram que as ratas que foram ovariectomizadas e tratadas com O, BE e BE+P apresentaram uma diferença estatisticamente significante entre si [F(2,143) = 104,24; p < 0,001]. Os grupos BE e BE+P (média ± epm = 1,91 ± 0,04 e 2,67 ± 0,05, respectivamente) apresentaram maior densidade de espinhos dendríticos na AMePD quando comparados ao grupo controle injetado com óleo (1,60 ± 0,05; p < 0,001). Adicionalmente, nos grupos BE+S e BE+LY235959, a densidade de espinhos dendríticos diminuiu no grupo que recebeu o antagonista dos receptores do tipo NMDA (2,02 ± 0,04) em relação ao que recebeu salina (2,15 ± 0,04; p = 0,04). O presente estudo sugere que a densidade de espinhos dendríticos na AMePD é afetada pelos hormônios gonadais femininos, sendo que a progesterona potencializa o efeito do estradiol. De forma muito interessante, a ação do estradiol parece ocorrer, pelo menos em parte, pela interação com receptores do tipo NMDA. Esses resultados podem contribuir para o entendimento da plasticidade morfológica e sináptica representada pela densidade de espinhos dendríticos na AMePD, a qual parece ser mediada pelos esteróides sexuais e em área do sistema nervoso relacionada com a modulação de comportamento reprodutivo feminino.

Efeitos da bicuculina em diferentes estruturas cerebrais no processamento da memória em ratos

Diversos estudos sugerem que os receptores inibitórios GABA��rgicos do tipo A estão envolvidos no processamento da memória. Para examinar o papel dos receptores GABAA na consolidação da memória, ratos foram implantados bilateralmente com cânulas na região CA1 do hipocampo, córtex entorrinal, córtex parietal posterior e núcleo basolateral da amígdala, e treinados na tarefa de esquiva inibitória. Em diferentes tempos depois do treino, o antagonista dos receptores GABAA - bicuculina - foi infundido nas estruturas acima mencionadas. A bicuculina facilitou a memória quando infundida imediatamente após o treino (0h) no hipocampo, córtex entorrinal e córtex parietal posterior; 1,5h no hipocampo; 3h no córtex entorrinal e no córtex parietal. Nos tempos mais tardios da consolidação da memória (4,5h e 6h) não houve facilitação. A bicuculina não teve efeito na memória quando administrada na amígdala em nenhum dos tempos. Nossos dados sugerem que os receptores GABA��rgicos inibem os primeiros momentos da consolidação da memória de longa duração no hipocampo, córtex entorrinal e córtex posterior, mas não nos tempos mais tardios.

Turno de trabalho, cronotipo e desempenho de memória e atenção de profissionais da área da saúde de dois serviços de emergência da cidade de Porto Alegre/RS/BRASIL

Trabalhadores forçados a alterar o ciclo sono/repouso em função do turno de trabalho tendem a dessincronizar seus ritmos fisiológicos (endógenos) em relação aos do meio ambiente (exógenos) acarretando transtornos na organização dos sistemas fisiológicos. Os objetivos deste estudo foram avaliar a relação do turno de trabalho (manhã, noite e rotativo) e perfil cronobiológico e seus efeitos sobre desempenho em testes de atenção e memória de profissionais (médicos, enfermeiros e técnicos/auxiliares de enfermagem) dos serviços de emergência de dois hospitais de Porto Alegre (RS/Brasil). Uma amostra aleatória de 140 profissionais, de ambos os sexos e idade entre 25 e 60 anos, foi avaliada num estudo transversal. Os sujeitos que relataram presença de doença (clínica, neurológica ou psiquiátrica), transtornos do sono prévios ao emprego atual, e uso de benzodiazepínicos nas 6 horas anteriores à testagem foram excluídos. Padrão cronobiológico (matutinidade/vespertinidade) foi definido pelo questionário de Hidalgo-Chaves (2002). Os testes de atenção e memória foram span de dígitos, span palavras, stroop, memória lógica, e Wisconsin Card Sorting Test (versão computadorizada). Déficit de atenção foi definido pela combinação de testes positivos (50%+1). Não se observou associação significativa entre cronotipo e turnos de trabalho. A freqüência de desempenho abaixo do ponto de corte em diversos testes foi maior no turno da noite. Déficit de atenção/memória foi observado em 51% dos profissionais do turno da noite, 21% do turno da manhã, e 22% do rotativo. O desempenho nos testes de atenção/memória entre os sujeitos distribuídos por cronotipo (tanto no total, como entre coincidentes com o turno de trabalho) não mostrou diferença estatisticamente significativa. Em conclusão, a discordância entre turno de trabalho e cronotipo pode ser explicada por diferentes motivos como a falta de opção para escolher o turno, questões financeiras, e desconhecimento quanto às características relacionadas ao perfil cronobiológico. Os déficits observados podem expressar efeitos de longo prazo do trabalho em turnos e especialmente no noturno.