Padronização da técnica de imunoistoquímica para identificação de Listéria monocytogenes em placentas humanas e tecido nervoso central de ruminantes.

Este projeto foi desenvolvido no Laboratório de Patologia Experimental do Hospital de Clínicas de Porto Alegre (HCPA), com a aprovação da Comitê de Ética em Pesquisa do HCPA e com apoio financeiro parcial do Fundo de Incentivo à Pesquisa e Eventos do HCPA (FIPE). O experimento 1, chamado de projeto piloto, teve como objetivo implementar a técnica de IHQ para identificar a Listeria monocytogenes (L.m.), utilizando anticorpo policlonal antilisteria monocytogenes (Biodesig ). Vários testes foram realizados para acertar a diluição (1:1000) que foi diferente da preconizada pelo fabricante. Os blocos de parafina, de dez placentas provenientes de parto prematuro ou aborto foram utilizados para os cortes histológicos e a preparação das lâminas para a coloração Hematoxilina e Eosina (HE) e imunoistoquímica (IHQ). As lâminas foram identificadas por números para resguardar a identidade das pacientes. O resultado do HE mostrou alterações inflamatórias em oito placentas e L. m. foi identificada pelo IHQ em cinco dessas placentas. O objetivo do 2º experimento foi identificar a L. m. em tecido nervoso cerebral de ruminantes, utilizando a técnica implementada no projeto piloto. O material utilizado neste trabalho foi cedido pelo Setor de Patologia Veterinária do Departamento de Patologia da Universidade Federal de Santa Maria. Os casos estudados (2 ovinos, 1 caprino e 2 bovinos) tinham suspeitas clínicas diversas e as necropsias dos animais evidenciaram aspectos sugestivos da doença. Os cinco casos foram confirmados pelo IHQ, comprovando a importância da utilização desta técnica para o diagnóstico da listeriose no SNC de ruminantes. O 3º experimento objetivou identificar a L. m. em placentas encaminhadas ao Serviço de Patologia do HCPA no ano 2000. Da mesma forma que no experimento 1, as lâminas foram identificadas por números. Após o levantamento realizado nos registros dos exames anatomopatológicos (AP) deste setor, observou-se que 714 AP eram de placentas provenientes de aborto, parto prematuro e nascimento a termo examinados naquele período. Foram sorteados 254 AP para análise através de HE, revelando que 148 desses AP apresentavam alterações inflamatórias (corioamnionite, vilite e deciduite). Os blocos destas placentas foram utilizados para fazer as lâminas e realizar IHQ. A consulta aos prontuários dos casos com alterações inflamatórias permitiu observar que um deles tinha a confirmação bacteriológica de L. m. na placenta, tornando-se este o controle positivo. O controle negativo foi selecionado entre aqueles sorteados que não apresentavam alterações inflamatórias. A presença de L. m. foi identificada em 33,78% das placentas analisadas pela técnica IHQ. Corioamnionite e vilite foram as alterações inflamatórias que mostraram diferença estatística significativa nas placentas positivas. L. m. estava presente nas placentas de 1º, 2º e 3º trimestres gestacionais. A idade das gestantes, casos de aborto e/ou parto prematuro não mostraram diferença estatística significativa com a presença ou ausência de L. m. nas placentas. Abortos habituais ocorreram em pacientes com ou sem L. m. no tecido placentário. Conclusão: a técnica de imunohistoquímica pode ser utilizada para confirmar o diagnóstico histopatológico de listeriose em placentas e tecido nervoso central de ruminantes.

Influência do tratamento crônico com cafeína em modelos animais de esquizofrenia : parâmetros cognitivos e comportamentais

A esquizofrenia envolve um conjunto de sintomas de sensopercepção, cognição e afeto que compromete significativamente a vida do sujeito. O mais aceito modelo para se entender essa doença é o modelo de hiperatividade dopaminérgica, pois drogas como anfetamina e cocaína, que aumentam a atividade dopaminérgica, mimetizam alguns sintomas dessa patologia, e os fármacos usados para o tratamento são os que bloqueiam os receptores de dopamina. Além da dopamina, o sistema glutamatérgico também tem sido relacionado à esquizofrenia, pelo fato de antagonistas de receptores glutamatérgicos do tipo NMDA, tais como PCP, MK-801 e cetamina, provocarem alguns sintomas dessa doença, como desorganização cognitiva e delírios em pessoas saudáveis. adenosina, por sua vez, desempenha um papel neuromodulatório tanto da atividade dopaminérgica quanto da atividade glutamatérgica, inibindo o tônus de ambos neurotransmissores por diferentes vias. Assim, sugerimos que antagonistas de receptores adenosinérgicos, como a cafeína, também seriam um modelo farmacológico para a doença. Com base nisso, demonstramos previamente que camundongos tratados cronicamente com cafeína desenvolvem tolerância cruzada ao efeito do antagonista NMDA MK-801 em provocar hiperlocomoção, mas não em seu déficit cognitivo na esquiva inibitória. Buscando ampliar e melhor caracterizar essa interação, os seguintes parâmetros foram avaliados em camundongos: atividade locomotora realizando-se as curvas de dose e de tempo; memória de trabalho, avaliada na tarefa de alternação tardia; memória de longa duração, avaliada na tarefa de esquiva inibitória e a avaliação de ataxia. Os resultados nos mostraram que camundongos subcronicamente tratados com cafeína na bebida (1 mg/mL, por 1, 3, ou 7 dias) apresentaram habituação semelhante entre os grupos e que MK-801 (0,25 mg/kg, i.p.) produziu hiperlocomoção nos animais tratados com água e 1 dia de cafeína, com efeito diminuído depois de 3 dias e praticamente abolido depois de 7 dias. Depois de 7 dias, o efeito também foi dose-dependente, sem tolerância cruzada na dose de 0,1 mg/mL, intermediária na dose de 0,3 mg/mL e total a 1,0 mg/mL. Os escores de ataxia induzidos por 0,5 mg/kg de MK-801 não foram afetados pelo tratamento com cafeína por 7 dias a 1 mg/mL, mas uma hiperlocomoção transitória foi observada. O tratamento com cafeína por 7 dias a 1 mg/mL preveniu os déficits induzidos por 0,01 mg/kg de MK-801 na tarefa de esquiva inibitória e os atenuou, a 0,4 mg/kg de MK-801, na tarefa de alternação tardia, no labirinto em T. Conclui-se, então, que a hiperlocomoção e os déficits cognitivos – mas não a ataxia – induzidos por MK-801 podem estar influenciados pela atividade reduzida da adenosina. Assim, os estudos sobre a ação da adenosina podem se fazer relevantes para a melhor compreensão da neurobiologia da esquizofrenia. Estes resultados são concordantes com o novo modelo proposto, que é o de hipofunção adenosinérgica na esquizofrenia.

Aborto bovino por Neospora caninum: fatores associados ao resultado positivo da imunoistoquímica

Um total de 237 fetos bovinos abortados foram enviados ao Setor de Patologia Veterinária da Universidade Federal do Rio Grande do Sul entre junho de 1999 e maio de 2004. Tecidos destes fetos foram analisados através da histologia e imunoistoquímica (IHQ) anti-Neospora caninum. Destes, 72 apresentaram lesões histológicas sugestivas de infecção por protozoário, caraterizadas pela presença de miosite não-supurativa, miocardite não-supurativa, pneumonia intersticial mononuclear associada a focos de necrose e encefalite necrosante não-supurativa multifocal. O cérebro apresentava consistência líquida ou semi-líquida em 61,1% dos fetos, dificultando a obtenção de tecido para a análise histológica e IHQ. A IHQ revelou a presença de taquizoítos e raros cistos de N. caninum no cérebro de 33/47 (70,2%) dos fetos que apresentam lesões histológicas sugestivas de infecção por protozoário. No modelo final da análise multivariada, três variáveis estiveram associadas significativamente com resultado positivo na IHQ nos fetos abortados: consistência do cérebro (P=0,031), lesão no cérebro (P=0,028) e idade (P=0,189). As chances de um resultado positivo na IHQ de N. caninum foram 4,35 vezes maiores (OR=4,35; 95% CI:1,1320-2,8116) quando o feto apresentava cérebro com consistência considerada normal e 4,94 vezes maiores (OR=4,94; 95%CI: 0,1646-3,0313) na presença de lesão sugestiva de infecção por protozoário caracterizada por encefalite de intensidade variada. A probabilidade de resultado positivo na IHQ foi inversamente proporcional à idade fetal, cada mês adicional de gestação diminuíram as chances de um feto apresentar resultado positivo na imunoistoquímica por 0,41 (OR=0,41, 95%CI: 1,5982- 0,1436).

Aplicação de microssatélites (STR) de bovinos em animais de raças zebuínas

O gado zebu (Bos indicus) é predominante em todo o mundo. Atualmente, no Brasil, o rebanho de bovinos e zebuínos é composto por aproximadamente 170 milhões de indivíduos, no qual, 80% são zebuínos ou animais de raças cruzadas com zebu. O principal objetivo deste estudo foi determinar a possibilidade da utilização de marcadores moleculares de bovinos na identificação genética de zebuínos. A confirmação desta possibilidade seria de extrema valia, já que a quantidade de informações sobre o genoma zebuíno é limitada e metodologias específicas de identificação de marcadores genéticos para raças zebuínas são raras. Assim, o DNA de 65 zebus, de 4 raças diferentes (Gir, Tabapuã, Nelore e Brahman), foi extraído a partir de sangue aplicado em papel filtro, utilizando o “kit” DNA IQTM SYSTEM (Promega®). Após a extração de DNA, foi feito um PCR Multiplex utilizando o “kit” StockMarks® (Applied Biosystems®), o qual amplifica um total de 11 loci (BM1824, BM2113, ETH10, ETH225, ETH3, INRA023, SPS115, TGLA122, TGLA126, TGLA227 e TGLA53). Os fragmentos gerados pela PCR foram analisados por eletroforese capilar utilizando o analisador genético ABI Prism 3100 (Applied Biosystems®) e o programa GeneScan® v.3.7 (Applied Biosystems®). A freqüência dos marcadores e os índices de variabilidade genética foram calculados utilizando o programa Microsatellite Toolkit v.3.1 e o equilíbrio de Hardy-Weinberg foi determinado através do programa GENEPOP v.3.4. Através destas técnicas foi possível demonstrar que os marcadores moleculares utilizados para identificação genética de bovinos podem também ser utilizados para a realização da técnica de identificação genética de zebuínos Além disso, foi possível demonstrar a freqüência alélica na população de zebuínos analisada como um todo, assim como foi determinada a freqüência alélica para os diferentes marcadores moleculares dentro das 4 raças estudas. Considerando o total de 100 diferentes alelos identificados entre os 11 STR (Short Tandem Repeats) analisados, foi possível observar que a heterozigosidade esperada (He) foi relativamente alta na população analisada, assim como na análise por raça. Estes dados indicam alto grau de diversidade genética nas diferentes raças. Neste sentido, a raça Brahman apresentou a menor diversidade (0,60) e a raça Tabapuã, a maior (0,69). Contudo, estudos complementares são necessários, a fim de confirmar as freqüências alélicas estabelecidas, uma vez que os resultados encontrados no presente trabalho referem-se a um número relativamente pequeno de zebuínos, quando comparados com o total de zebus encontrados no rebanho brasileiro.

Uso de plantas medicinais durante a gravidez e risco para malformações congênitas

A utilização de plantas com fins medicinais para o tratamento, cura e prevenção de doenças, é uma das mais antigas formas de prática medicinal da humanidade. Estas plantas são comercializadas apoiadas em propagandas que prometem benefícios seguros, já que se trata de “fonte natural”. Porém, muitas vezes as supostas propriedades terapêuticas anunciadas não possuem validade científica ou por não terem sido investigadas, ou por não terem tido suas ações farmacológicas comprovadas em testes científicos. Por outro lado, existem evidências significativas em experimentos em animais que muitas substâncias de origem vegetal são potencialmente embriotóxicas ou teratogênicas. Dentro deste contexto, realizamos um estudo do tipo caso-controle de base hospitalar e multicêntrico com o propósito de elucidar os potenciais riscos relacionados ao uso de fitoterápicos em geral, antidepressivos e/ou ansiolíticos de origem vegetal e plantas medicinais com suposta atividade abortiva, com o aparecimento de malformações congênitas maiores nos bebês de gestantes expostas. O presente trabalho tem por objetivo estimar a freqüência do uso de plantas medicinais e seus derivados durante a gestação, particularmente as com potencialidades abortivas e as com efeito sobre o Sistema Nervoso Central, descrevendo as principais substâncias utilizadas e as razões de seu uso. Tais freqüências foram comparadas entre 443 mães de bebês portadores de defeitos congênitos maiores e 443 mães de bebês normais. De acordo com os resultados obtidos abservou-se que 156 (17,6%) puérperas relataram usar algum tipo de fitoterápico e que 300 (33,9%) usaram substâncias de origem vegetal exclusivamente para tratar sintomas de depressão e/ou ansiedade. Não houve diferença estatisticamente significativa entre casos e controles no consumo destas substâncias. Porém, 176 (39,7%) mães de bebês malformados e 110 (24,8%) mães de controle utilizaram plantas com potencialidades abortivas (p<0,001). O conjunto destas observações evidenciou que o uso de fitoterápicos e ansiolíticos/antidepressivos de origem vegetal durante a gestação, não parece estar associado ao aparecimento de defeitos congênitos maiores nesta amostra. No entanto, a observação de que as mães de crianças malformadas utilizaram mais chás considerados abortivos ou suspeitos de algum tipo de risco para a gestação, sugere uma associação entre o uso destas substâncias e o desfecho malformação congênita maior na população estudada. Estes resultados devem ser interpretados cuidadosamente, pois podem significar uma ação teratogênica do composto vegetal, ou podem dever-se à co-existência de outros fatores teratogênicos relacionados à tentativa de aborto.