Sistema purinérgico na memória da tarefa de esquiva inibitória em córtex cingulado e córtex pré-frontal de ratos

A memória pode ser definida como o armazenamento e a evocação de uma informação aprendida. Sendo um processo dinâmico, requer a ativação de diversos sistemas para que a informação adquirida seja consolidada. O ATP é um importante neurotransmissor que, após a sua liberação e conseqüente ativação de seus receptores específicos, precisa ser inativado. Esta remoção do ATP da fenda sináptica ocorre através de sua hidrólise promovida pelas ectonucleotidases. Como um dos produtos da hidrólise do ATP, a adenosina é considerada um potente neuromodulador e exerce suas ações através de receptores específicos com ações excitatórias (A2A e A2B ) ou inibitórias (A1 e A3). Vários trabalhos já demonstraram a participação do sistema purinérgico nos processos relacionados a memória da tarefa da esquiva inibitória. Estudos realizados em nosso laboratório mostraram a participação das ectonucleotidases sinaptossomais de hipocampo, córtex entorrinal e córtex parietal na consolidação da memória para esquiva inibitória. No entanto, existem poucos estudos a respeito do sistema purinérgico nos mecanismos de consolidação da memória em outras regiões cerebrais, tais como o córtex cingulado anterior (CA) e posterior (CP) e a área pré-central medial (FR2). Portanto, na primeira parte deste estudo, avaliamos as atividades ectonucleotidásicas em sinaptossomas de CA, CP e FR2 de ratos submetidos à tarefa de esquiva inibitória. Nossos resultados demonstraram um aumento na hidrólise de ATP em sinaptossomas de FR2 e CA; e na hidrólise de ADP em sinaptossomas de FR2 e CP. Este aumento na hidrólise de ATP e ADP ocorreu devido ao choque administrado na tarefa, já que o grupo de animais que não recebeu choque não apresentou alterações na hidrólise de ATP e ADP. Este efeito observado provavelmente não está associado à consolidação da memória, mas a mudanças neuroquímicas e neurohumorais induzidas pelo estresse após o choque. Além disso, foi observado um aumento relacionado ao aprendizado na atividade ATPásica e ADPásica em CP e CA, respectivamente. Estes resultados sugerem fortemente que estas enzimas participam da consolidação da memória em CP e CA. O aumento na hidrólise de ATP e ADP sugere um possível aumento na concentração de adenosina nestas regiões. Portanto, na segunda parte deste estudo, verificamos a influência de agonistas e antagonistas de receptores de adenosina nas memórias de curta (STM) e de longa (LTM) duração na tarefa de esquiva inibitória. Então, neste estudo administramos intrafusões de análogos de adenosina em CP, imediatamente após o treino em esquiva inibitória. Os resultados demonstraram que a intrafusão de DPCPX, um antagonista de receptores A1, em CP, na concentração de 50 nM, aumentou significativamente a retenção da tarefa em ambas STM e LTM. Além disso, a administração de CPA, um agonista de receptores A1 de adenosina, não alterou ambas STM e LTM nas concentrações testadas. Portanto, este estudo sugere que os receptores A1 exercem uma modulação inibitória em CP tanto na STM quanto na LTM para o aprendizado de esquiva inibitória. A regulação dos níveis de ATP e adenosina pelas ectonucleotidases em CP, CA e FR2 controlaria a ativação dos receptores A1 nestas estruturas, podendo exercer efeitos modulatórios na consolidação da memória nestas estruturas.

Efeito da fenilalanina sobre a atividade da creatina quinase em córtex cerebral, cerebelo e cérebro médio de ratos

A fenilcetonúria (PKU) é um erro inato do metabolismo de aminoácidos causada pela deficiência da enzima fenilalanina hidroxilase hepática (PAH) que converte fenilalanina (Phe) em tirosina. Caracteriza-se clinicamente por retardo mental severo e, em alguns pacientes, por convulsões e eczema cutâneo. Bioquimicamente os pacientes afetados por esta doença apresentam acúmulo de Phe e seus metabólitos no sangue e nos tecidos. Phe é considerada o principal agente neurotóxico nesta doença, cujos mecanismos de neurotoxicidade são pouco conhecidos. O metabolismo energético cerebral é caracterizado por níveis altos e variáveis de síntese e de utilização de ATP. O cérebro contém altos níveis de creatinaquinase (CK), uma enzima que transferere reversivelmente um grupo fosforil entre ATP e creatina e entre ADP e fosfocreatina (PCr). Considerando que a CK parece estar envolvida em certas condições patológicas relacionadas com deficiência de energia cerebral e sabendo que a PKU está associada à redução de produção e de utilização de energia pelo cérebro, no presente trabalho verificamos a atividade da CK em homogeneizado total de córtex cerebral, cerebelo e cérebro médio de ratos Wistar submetidos aos modelos experimentais agudo e crônico de hiperfenilalaninemia (HPA) quimicamente induzida. Também investigamos o efeito in vitro da Phe e da α-metil-DL-fenilalanina (MePhe), um inibidor da PAH, nas mesmas estruturas de ratos Wistar de 22 dias de idade não tratados. Nossos resultados mostraram uma redução significativa na atividade da CK nas estruturas cerebrais estudadas de ratos sujeitos a HPA. Também verificamos que Phe e MePhe inibiram in vitro a atividade da CK nas mesmas estruturas. O estudo da interação cinética entre Phe e MePhe, sugere a existência de um único sítio de ligação na CK para os dois compostos. Considerando a importância da CK para a manutenção do metabolismo energético cerebral, nossos resultados sugerem que a alteração da homeostasia energética pode contribuir para a neurotoxicidade da Phe na PKU.

Efeitos de crises crônicas e agudas induzidas por pentilenotetrazol sobre a hidrólise de nucleotídeos púricos em soro de ratos adultos

A adenosina tem sido descrita como tendo importante efeito neuromodulatório em SNC, inibindo a liberação de neurotransmissores excitatórios através da ativação dos receptores A1. Agonistas de receptores A1, bem como adenosina e seus análogos, tem sido descritos como supressores de crises epilépticas. Uma das vias de produção de adenosina é a hidrólise extra-celular completa do ATP envolvendo as enzimas ATP difosfoidrolase (CD39) e 5’-nucleotidase (CD73). Embora esta associação enzimática já esteja bem descrita, o envolvimento da enzima fosfodiesterase não pode ser descartado, uma vez que esta hidrolisa nucleotídeos como ATP e ADP, além de outros substratos. Recentemente, foi demonstrado em nosso laboratório um aumento das atividades ATP difosfoidrolase e 5’-nucleotidase em sinaptossomas de ratos após a indução de 2 diferentes modelos de epilepsia de lobo temporal. Neste trabalho, nós investigamos o efeito de crises agudas e crônicas induzidas pelo agente pró-convulsivante pentilenotetrazol (PTZ) sobre a hidrólise dos nucleotídeos ATP, ADP e AMP em soro de ratos, uma vez que formas solúveis de nucleotidases já estão descritas. No modelo agudo os animais receberam apenas 1 injeção de PTZ ou salina, sendo mortos por decapitação em diferentes tempos após a injeção da droga. A hidrólise dos nucleotídeos ATP, ADP e AMP apresentaram aumento significativo de 40 –50% nos ratos tratados em relação aos ratos controle até 24 após a última injeção. Em 48 horas, este efeito foi abolido. Já, a hidrólise do substrato artificial p-Nph-5’-TMP usado como marcador para a fosfodiesterase, não apresentou nenhum aumento significativo em ratos tratados quando comparado aos animais controle. No modelo crônico (kindling), os animais recebiam doses inicialmente subconvulsivantes que resultam em crises progressivamente mais intensas ao longo das subseqüentes estimulações. Para descartar o efeito da injeção aguda, os ratos foram mortos 48 horas após a última estimulação. Com exceção do substrato artificial para a fosfodiesterase, a hidrólise dos nucleotídeos testados aumentou de maneira significativa (cerca de 40% - 45%) em soro de ratos submetidos ao modelo de kindling. Estes resultados demonstram o envolvimento de nucleotidases solúveis no controle dos níveis do neurotransmissor ATP e do neuromodulador adenosina, sendo estas respostas presentes tanto em situações patológicas agudas, como em situações patológicas crônicas que envolvem o fenômeno de plasticidade sináptica.

Identificação das características cinéticas, expressão e localização das ecto-nucleotidases em cultura de astrócitos e linhagens de gliomas

Nucleotídeos extracelulares são envolvidos em diversos processos patofisiológicos no sistema nervoso central. Astrócitos são a maior fonte de nucleotídeos extracelulares da adenina no cérebro e também importantes alvos para as ações desses nucleotídeos via receptores purinérgicos P2. As ações induzidas pela sinalização purinérgica são reguladas pelas ecto-nucleotidases, que incluem membros da família das ecto-nucleosídeo trifosfato difosfoidrolase (E-NTPDase), ecto-5’-nucleotidase (ecto- 5’N) e ecto-adenosina deaminase (ADA). Culturas de astrócitos preparadas de hipocampo, córtex e cerebelo de ratos foram capazes de rapidamente converter ATP extracelular a ADP, que foi então hidrolizado a AMP. Os nucleosídeos tri-fosfatados foram hidrolisados preferencialmente aos difosfatados em todas as estruturas cerebrais. A análise cinética sugere que varias ecto-nucleotidases estão envolvidas nessa cascata enzimática. Análises preliminares de mRNA por PCR indicaram que astrócitos expressam múltiplos membros da família das NTPDases (NTPDase1 a NTPDase3 e NTPDase5/6). Por RT-PCR quantitativo (Real-time PCR), nós identificamos a NTPDase2 (CD39L1) como a NTPDase predominante expressa por astrócitos de hipocampo, córtex e cerebelo de ratos. Astrócitos do cerebelo apresentaram um padrão diferente para a hidrólise do AMP, com uma atividade específica 7 vezes maior, quando comparada com astrócitos de hipocampo e córtex. Uma maior expressão da ecto-5’N por RT-PCR foi identificada nessa estrutura. Não houve acúmulo de adenosina extracelular em todas as estruturas estudadas, indicando a presença de uma alta atividade ecto-adenosina deaminase em astrócitos. Dipiridamol aumentou significativamente os níveis de inosina no meio extracelular de astrócitos de hipocampo e córtex, mas não em astrócitos de cerebelo. Essas diferenças observadas podem indicar heterogeneidade funcional dos nucleotídeos no cérebro. Com o objetivo de investigar as enzimas envolvidas no catabolismo dos nucleotídeos como indicadoras da invasividade e agressividade dos gliomas malignos, nós avaliamos a degradação dos nucleotídeos extracelulares em cinco linhagens de gliomas diferentes e comparamos com astrócitos. Todas as linhagens de gliomas examinadas apresentaram baixas razões de hidrólise quando comparadas com astrócitos. Resultados preliminares sugerem que a falta de expressão da NTPDase1 e 2 possam ser responsáveis pela baixa hidrólise de ATP nas linhagens de gliomas. Considerando que o ATP é reconhecido como um fator mitogênico que induz a proliferação em células de gliomas, a substancial diminuição na hidrólise de ATP e ADP observadas em gliomas, sugere que alterações na via das ecto-nucleotidases pode representar um importante mecanismo associado com a transformação maligna desse tipo de tumor.

Efeito dos aminoácidos de cadeia ramificada e seus cetoácidos sobre a atividade da creatinaquinase de cérebros de ratos jovens

A Doença do Xarope do Bordo é uma alteração metabólica hereditária caracterizada bioquimicamente pelo acumulo dos aminoácidos de cadeia ramificada e seus respectivos aminoácidos no sangue e nos tecidos destes pacientes. Os mecanismos patogênicos das alterações neurológicas presentes nos pacientes ainda são pouco conhecidos. Há evidências de que o metabolismo energético esteja alterado no cérebro dos pacientes. A creatinaquinase, enzima chave no metabolismo energético, está envolvida transporte e manutenção da energia cerebral. Neste trabalho investigamos a inibição da creatinaquinase pelos aminoácidos de cadeia ramificada in vitro em cérebro de ratos em desenvolvimento, nas concentrações semelhantes as encontradas no plasma destes pacientes. O mesmo efeito não foi verificado com os cetoácidos de cadeia ramificada. Verificamos ainda que este efeito também ocorreu em ratos tratados com leucina de forma crônica do 60 ao 210 dia, e de forma aguda quando tratados por 12 horas com intervalos de três horas. Os parâmetros cinéticos estudados mostraram um Km baixo (0,8 – 1,4 mM) para a fosfocreatina como substrato, cuja variação no cérebro oscila entre 4 a 8 mM. Assim nas condições fisiopatológicas a enzima estaria saturada em ralação à fosfocreatina, sendo difícil a competição com os aminoácidos de cadeia ramificada, principalmente devido ao alto Ki encontrado (6 a 26 mM), exceto em situações de baixas concentrações deste substrato. Entretanto, o Km encontrado para o ADP como substrato (0,3 ± 0,1 mM) é semelhante à concentração do ADP do cérebro (0,2 – 0.4 mM). Como o Ki encontrado também é alto (14 – 30 mM), é possível que a competição entre o ADP como substrato e os aminoácidos de cadeia ramificada diminua a atividade da enzima alterando a homeostasia energética do cérebro, contribuindo para o dano neurológico encontrado nos pacientes com a Doença do Xarope de Bordo. Os dados deste trabalho propõem um novo mecanismo fisiopatológico para as alterações neurológicas encontradas na Doença do Xarope do Bordo. Os aminoácidos de cadeia ramificada, acumulados no cérebro destes pacientes, ocasionando a inibição da creatinaquinase estariam competindo com o ADP, produzindo deste modo um desequilíbrio energético e conseqüentemente o dano neurológico.

Estudo dos efeitos do ATP extracelular e das ecto-nucleotidases no crescimento de gliomas

Glioblastomas são a forma mais comum de tumores cerebrais primários e, apesar do tratamento, os pacientes com estes tumores têm um prognóstico muito ruim. Os nucleotídeos da adenina (ATP, ADP e AMP) e também a adenosina possuem muitas funções importantes em condições fisiológicas e patológicas em vários organismos. O ATP é uma importante molécula sinalizadora no SNC, e os nucleotídeos e nucleosídeos podem induzir a proliferação de linhagens celulares de gliomas. Na invasão dos gliomas dois mecanismos podem liberar ATP: a morte excitotóxica do tecido adjacente e a lesão causada pela ressecção do tumor, que é o tratamento de primeira linha nestes casos. Neste estudo foram observados os efeitos do ATP extracelular na citotoxicidade em linhagens celulares de glioma humano U138 e na linhagem C6 de ratos, comparado com culturas organotícias de hipocampo. A citotoxicidade do ATP (0.1mM, 0.5mM, 5mM) foi medida usando os ensaios de incorporação de iodeto de propídeo e ensaio da lactato desidrogenase. O ensaio de caspases foi realizado para identificar à morte apoptótica. Os resultados mostraram que as células de gliomas apresentam resistência a morte induzida pelo ATP quando comparados com o tecido normal. Altas concentrações de ATP (5mM) induziram à morte celular após 24 h de tratamento em culturas organotípicas, mas não nas linhagens de gliomas estudados. Os nucleotídeos são hidrolisados muito lentamente pelas linhagens de gliomas, o que foi confirmado pela baixa expressão das enzimas NTPDases quando comparado com astrócitos. Portanto, para testar o papel do ATP extracelular no mecanismo de implante e crescimento dos gliomas, um milhão destas células de gliomas foram injetadas em 3µl de DMEM no estriado direito de ratos Wistar, e foi testada a co-injeção da enzima apirase no tratamento dos gliomas implantados. Após 20 dias, os ratos foram mortos e o cérebro foi seccionado e corado com hematoxilina e eosina. Nossos resultados mostraram que os ratos que sofreram co-injeção de apirase tiveram uma redução significativa no tamanho do tumor e menor índice mitótico (p<0,05), bem como menor imunodetecção para Ki67, VEGF e CD31 quando comparado com os grupos controle e controle apirase. A medida da hidrólise enzimática dos nucleotídeos no soro pode contribuir no diagnóstico de lesão celular em muitas condições patológicas. Com o objetivo de avaliar a atividade enzimática da ATPase, ADPase e AMPase in vivo, amostras de soro foram coletadas vinte dias após o implante dos gliomas em ratos. Os ratos com indução de gliomas mostraram um aumento significativo na hidrólise de ATP, ADP e AMP quando comparado com os respectivos controles. O tratamento com o fármaco temozolomida e com 10% dimetil sulfoxida diminuiu a hidrólise dos nucleotídeos. Nenhum dos animais incluídos neste trabalho apresentaram alterações significativas na atividade das enzimas alanina aminotransferase, aspartato aminotransferase e fosfatase alcalina. Nossos dados indicam que o ATP pode ter uma função importante no crescimento do glioma, pois quando liberado pode induzir a morte celular do tecido normal ao redor do tumor, abrindo espaço para o rápido crescimento e invasão do tumor. As avaliações da hidrólise dos nucleotídeos da adenina no soro podem ajudar no acompanhamento da progressão dos tumores cerebrais.

Investigação das ectonucleotidases de células musculares lisas vasculares : efeito dos hormonios tireoideanos e estradiol

Nucleotídeos extracelulares (ATP, ADP, AMP) e seu derivado adenosina são conhecidos sinalizadores do sistema cardiovascular podendo mediar vários processos fisiológicos entre eles a proliferação celular, agregação plaquetária, inflamação e o tônus vascular. Os níveis destas substâncias, localmente e na circulação sanguínea, são controlados pelas ecto-NTPDases em conjunto com a ecto-5’nucleotidase (ecto-5’-NT) que realizam a degradação completa do ATP até adenosina. Os hormônios tireoideanos tiroxina (T4) e triiodotironina (T3) e o hormônio esteróide sexual estradiol (E2) atuam ativamente no sistema vascular promovendo vasodilatação. Nosso objetivo foi investigar quais enzimas da família das NTPDases estão presente em células musculares lisas vasculares (CMLVs) e se a atividade destas enzimas pode ser influenciada pela ação desses hormônios, uma vez que seus substratos e produtos podem sinalizar processos de relaxamento/contração muscular. Para tanto, as CMLVs foram extraídas da artéria aorta de ratos Wistar adultos e cultivadas em meio de cultura DMEM. Após atingirem a confluência, as células foram tratadas com 50 nM de T3 ou T4 ou 1M de 17-estradiol por 72 horas. As atividades enzimáticas foram medidas pela liberação de fosfato inorgânico enquanto que a expressão das ectonucleotidases foi verificada por imunocitoquímica (proteína) e RT-PCR (RNAm). Os resultados deste trabalho mostram que as CMLVs expressam as NTPDases 1, 2, 3, 5 e 6 e a ecto-5’-NT, responsáveis pelo controle dos níveis de nucleotídeos e nucleosídeos extracelulares. O tratamento com os hormônios T3, T4 e E2 nestas células mostrou que a atividade da ecto-5’-NT foi aumentada pelos três hormônios. A análise do RT-PCR demonstrou que os tratamentos foram capazes de aumentar também a quantidade de RNAm da ecto-5’NT, indicando mecanismos de ação genômica dos hormônios estudados. Por outro lado, O tratamento com os hormônios tireoideos não alterou as atividades ATPásica e ADPásica, somente o estradiol foi capaz de aumentar a atividade ATPásica. Estes resultados também sugerem que, pela hidrólise aumentada do AMP, disponibilizem-se níveis maiores de adenosina, com importante potencial vasodilatador local. Entretanto, o fato de o estradiol ter aumentado a hidrólise de ATP, mas não a de ADP, nos permite pensar que o ADP, agregador plaquetário bem estabelecido, possa estar acumulando extracelularmente, contribuindo para o desenvolvimento de problemas circulatórios.

Atividade da NTPDase1 em linfócitos de humanos imunocompetentes e imunodeprimidos

Os linfócitos humanos apresentam na sua superfície a enzima NTPDase1 (ecto-apirase, ecto-difosfoidrolase; CD39; EC 3.6.1.5), responsável pela hidrólise do ATP e ADP extracelular e/ou outros nucleotídeos di ou tri fosfatados. A determinação da atividade da enzima foi padronizada através de método colorimétrico, o qual quantifica o fosfato livre liberado durante a reação. A NTPDase1 foi caracterizada através da demonstração de condições ótimas de incubação, como dependência de cálcio, pH, tempo de incubação e temperatura ótimos, além da obtenção de parâmetros cinéticos. Os resultados obtidos foram confirmados por uma baixa expressão de CD39 nos linfócitos humanos, verificada por análise citométrica, com utilização de anticorpo monoclonal correspondente. Este fato indica um baixo estado de ativação dos linfócitos, uma vez que o CD39 é considerado um marcador de ativação destas células. Posteriormente, foi determinada a atividade da NTPDase1 em linfócitos de pacientes imunodeprimidos pela infecção causada pelo HIV, os quais são acompanhados pelo monitoramento de sua carga viral no plasma e contagem de células T CD4+. A infecção pelo HIV resulta em alterações nas células imunes e na secreção de citocinas importantes na resposta patógenos. Nesta situação pode haver alterações bioquímicas na resposta imune, como por exemplo, alterações na hidrólise de nucleotídeos, ou seja, na atividade das enzimas que degradam nucleotídeos extracelulares. Os linfócitos encontram-se em estado de ativação crônica, o que faz com que até mesmo células não-infectadas pelo vírus, possam sofrer apoptose por ativação de caspases efetoras. Através da determinação da atividade da NTPDase nos linfócitos imunodeprimidos, verificou-se um aumento de sua atividade, acompanhado por uma maior expressão de CD39 na superfície destas células. Estes resultados sugerem que a NTPDase1 é importante para a manutenção da resposta imune, mantendo concentrações adequadas de ATP extracelular, o qual é essencial para certas funções imunes, mas também pode ser prejudicial no momento que induz apoptose nos linfócitos, o que poderia aumentar o estado de imunodepressão. Devido ao fato de que muitos dos pacientes HIV-positivos recebem terapia anti-retroviral, foi necessário verificar in vitro possíveis efeitos destas drogas sobre a atividade da NTPDase1. Neste caso, observou-se que as concentrações terapêuticas destas drogas não afetaram a atividade da enzima. Sendo assim, a atividade aumentada da NTPDase1 nestes pacientes, não é devida à interferência da terapia anti-retroviral.

Sistema purinérgico em plaquetas de ratos adultos e interações com o sistema renina-angiotensina

As plaquetas sangüíneas são fragmentos citoplasmáticos, oriundos da ruptura dos megacariócitos, cuja principal função está relacionada à manutenção da integridade vascular. Os nucleotídeos extracelulares, ATP e ADP, bem como a adenosina, têm sido implicados em um grande número de funções fisiológicas: o ADP é o principal fator recrutador de plaquetas, enquanto que o ATP é um inibidor competitivo da agregação induzida por ADP. A adenosina é uma molécula capaz de induzir vasodilatação e inibir a agregação plaquetária. Desta maneira, a manutenção da sinalização purinérgica normal tem se mostrado importante para o tratamento de doenças cardiovasculares. Os nucleosídeos di e trifosfatos circulantes podem ser hidrolisados por membros de várias famílias de ectonucleotidases de membrana e solúveis, incluindo as ecto-nucleosídeo trifosfato difosfoidrolases (E-NTPDases) e ecto-nucleotídeo pirofosfatase/fosfodiesterases (E-NPPs), que em conjunto com a ecto-5’-nucleotidase, levam à formação de adenosina. Na superfície das plaquetas, ambas enzimas, E-NTPDase e ecto-5’-nucleotidase, estão descritas. O sistema renina-angiotensina é o principal regulador da função renal e cardiovascular, desenvolvendo um papel fundamental na homeostasia da pressão arterial e do balanço eletrolítico. A angiotensina II (ANGII) induz fisiologicamente a ativação das plaquetas, possivelmente devido às suas propriedades vasoconstritoras. Os objetivos deste trabalho foram, portanto: 1) caracterizar cineticamente a enzima E-NPP em plaquetas de ratos, utilizando o substrato marcador p-Nph-5’TMP e 2) esclarecer, mesmo que em parte, os possíveis efeitos da ANGII sobre a hidrólise extracelular de nucleotídeos por plaquetas de ratos. No primeiro capítulo deste trabalho, descrevemos uma atividade enzimática em plaquetas de ratos que compartilha as principais características bioquímicas já descritas para as E-NPPs: pH ótimo alcalino; valores de KM e Vmax calculados de aproximadamente 106.22 ± 17.83 μM e 3.44 ± 0.18 nmol p-nitrophenol/min/mg, respectivamente; e dependência de cátions divalentes. Além disso, o AMP inibiu somente a hidrólise do p-Nph-5’TMP. Por outro lado, a azida de sódio, em altas concentrações, a angiotensina II e o cloreto de gadolínio alteraram apenas as hidrólises de ATP ou ADP ou de ambos. No segundo capítulo, mostramos que a ANGII foi capaz de aumentar as hidrólises de ATP, ADP e AMP em plaquetas em todas as doses testadas (5, 50, 500 e 5000 picomóis). Entretanto, nenhuma alteração foi observada com relação à hidrólise do p-Nph-5'TMP. Em adição, observamos um aumento na hidrólise de AMP e uma diminuição na hidrólise de p-Nph-5'TMP em plaquetas de ratos espontaneamente hipertensos (SHR) quando comparados a ratos Wistar normotensos. De maneira geral, esta dissertação traz a caracterização bioquímica da enzima E-NPP na superfície de plaquetas intactas de ratos como sendo parte de um complexo sistema para a hidrólise de nucleotídeos nestes fragmentos citoplasmáticos, podendo, assim, contribuir para o desenvolvimento de terapias antiplaquetárias e para o tratamento de doenças vasculares. Adicionalmente, apresentamos alguns resultados demonstrando interações entre os sistemas angiotensinérgico e adenosinérgico de plaquetas de ratos, o que poderá contribuir para o entendimento e o tratamento de doenças cardiovasculares como hipertensão e arteriosclerose.

Quercetina : efeitos sobre parâmetros proliferativos e sobre a ecto-5'-nucleotidase em linhagem de glioma humano U138MG

Gliomas são os mais comuns e devastadores tumores primários do sistema nervoso central. Os nucleotídeos da adenina são moléculas sinalizadoras no meio extracelular, envolvidas em importantes condições fisiológicas e patológicas. O ATP, neurotransmissor excitatório, e a adenosina, neuromoduladora, entre outros efeitos, podem induzir proliferação celular em linhagens de gliomas. Os eventos induzidos pelos nucleotídeos extracelulares são controlados pela ação das E-NTPDases, que hidrolisam o ATP até adenosina extracelularmente. Recentes estudos epidemiológicos têm sugerido que os flavonóides derivados da dieta, em particular a quercetina, apresentam um papel benéfico em prevenir ou inibir a tumorigênese. Assim, primeiramente nós avaliamos o efeito antiproliferativo da quercetina em linhagem de glioma humano U138MG. O estudo demonstrou que este flavonóide induziu em cultura de gliomas: (1) diminuição da proliferação e da viabilidade celular; (2) morte celular via necrose e apoptose; (3) parada no ciclo celular na fase G2 e (4) diminuição do índice mitótico. Além disso, nós demonstramos que a quercetina, enquanto promoveu regressão tumoral, protegeu culturas organotípicas hipocampais do dano isquêmico. Em conjunto, esses dados sugerem que a quercetina exibe efeitos antiproliferativos direcionados para as células tumorais e reduzida citotoxicidade para células normais, características altamente desejáveis na quimioterapia. Dados do nosso laboratório demonstram que o metabolismo extracelular das purinas encontra-se alterado em linhagens de gliomas com relação a culturas de astrócitos, sugerindo que mudanças no sistema purinérgico podem ser uma característica dos gliomas que potencialmente podem contribuir para o seu fenótipo de malignidade. Assim, o passo seguinte desse trabalho foi investigar o perfil de secreção dos derivados da adenina, o metabolismo extracelular do AMP e a ação da quercetina sobre o sistema purinérgico. As culturas de glioma apresentaram secreção de ATP, o qual foi detectado em maiores níveis com relação as outras moléculas avaliadas, ADP, AMP, adenosina e inosina. O AMP extracelular foi eficientemente metabolizado pelos gliomas, demonstrando uma ecto-5’-NT/CD73 muito ativa. Adicionalmente, quercetina interagiu com o sistema purinérgico, inibindo não-competitivamente a atividade da ecto-5’-NT/CD73 e modulando negativamente a sua expressão. Nós sugerimos que a inibição da atividade da ecto-5’-NT/CD73 pode resultar em um decréscimo na disponibilidade de adenosina extracelular, uma promotora tumoral. Tal efeito pode estar correlacionado com a inibição da proliferação promovida pela quercetina nessa linhagem de glioma. Nossos dados sugerem que a quercetina pode ter uma função importante na inibição da proliferação dos gliomas, atuando em diferentes vias de sinalização, incluindo o sistema purinérgico. Assim, esse estudo abre novas perspectivas para as potenciais aplicações dos flavonóides na prevenção e tratamento de tumores cerebrais.

Efeitos de flavonóides e suco de uva sobre a hidrólise de nucleotídeos em soro de ratos adultos

No presente estudo, foi avaliada a hidrólise dos nucleotídeos ATP, ADP e AMP em soro de ratos em presença dos seguintes flavonóides: resveratrol, quercitina e rutina in vitro. Também avaliamos os efeitos do resveratrol, administrado na forma de suco de uva sobre a hidrólise dos nucleotídeos em soro de ratos adultos. Por último foi avaliado o efeito do resveratrol sobre a hidrólise dos nucleotídeos, administrado na forma de suco de uva, antes dos ratos serem submetidos ao tratamento com arginina. A hidrólise dos nucleotídeos em soro de ratos in vitro, em presença do resveratrol, aumentou para o substrato ATP em aproximadamente 40% e para o substrato ADP em aproximadamente 60%, mas não mostrou qualquer efeito sobre a hidrólise do AMP, ou seja, a enzima NTPDase foi ativada, enquanto a 5’-nucleotidase não sofreu qualquer alteração. Para a quercitina e para a rutina, outros flavonóides testados in vitro nas mesmas condições, observamos que a hidrólise dos nucleotídeos ATP, ADP e AMP diminuiu. Foi avaliado também, o efeito do suco de uva sobre a hidrólise dos nucleotideos em soro de ratos submetidos a cinco, dez e quinze dias de tratamento. Após quinze dias de tratamento, observou-se aumento na hidrólises de ATP, ADP e AMP. Com esse resultado então, tentamos avaliar se animais recebendo injeções de arginina (tratamento que já mostrara redução na hidrólise dos nucleotídeos em trabalho anterior), tendo previamente acesso ao suco de uva durante quinze dias, poderiam recuperar as atividades de hidrólise dos nucleotídeos. Concluimos que o resveratrol pode aumentar a hidrólise destes nucleotídeos em soro de ratos e que o suco de uva se administrado no lugar da água, também leva a um aumento na hidrólise de ATP, ADP e AMP. Nos protocolos onde houve diminuição na atividade de hidrólise do nucleotídeos por tratamento com arginina, observamos que o tratamento prévio com suco de uva preveniu o decréscimo na atividade das enzimas NTPDase e 5’-nucleotidase.

Perfil temporal de marcadores bioquímicos e parâmetros purinérgicos no líquor e soro de ratos em modelos eletroconvulsivos crônico e agudo

A Eletroconvulsoterapia é atualmente o método mais efetivo no manejo dos transtornos depressivos, e sua superioridade frente ao tratamento farmacológico apresenta-se bem documentada. Apesar disso, críticos ainda vêem o método como potencialmente danoso e capaz de provocar lesões cerebrais, fatos que carecem de comprovação científica. Hipóteses quanto aos mecanismos bioquímicos desencadeados pela eletroconvulsoterapia, bem como pelos antidepressivos de um modo geral, voltam-se tradicionalmente para o sistema monoaminérgico como principal envolvido na orquestração subjacente à recuperação dos sintomas de humor. Há algum tempo esforços têm sido direcionados para identificação de outros sistemas que possam estar desempenhando um importante papel. Nesta tese utilizamos um tradicional modelo de choque eletroconvulsivo em ratos para investigar seus efeitos sobre marcadores de lesão neuronal, atividade e consumo energético glial, bem como atividade de ectonucleotidases. Ratos wistar machos com 60 a 90 dias de idade foram alocados a dois tratamentos. No primeiro, denominado agudo, os indivíduos receberam um único choque eletroconvulsivo, sendo posteriormente sacrificados em horários predeterminados. No segundo modelo, crônico, os ratos receberam 8 choques eletroconvulsivos, mimetizando um curso de tratamento de eletroconvulsoterapia. O sacrifício dos ratos no modelo crônico ocorreu após o oitavo choque, também em momentos predeterminados. No primeiro trabalho foi extraído o líquor dos animais 0, 3, 6, 12, 24, 48 e 72 horas após terminadas as sessões, sendo medidos os níveis de proteína S100B, enolase específica do neurônio e lactato. Os níveis de S100B apresentavam-se significativamente elevados seis horas após o último choque no modelo crônico (p<0,0001). Enolase específica do neurônio não teve alterações, e os níveis de lactato aumentaram significativamente na primeira medição após o choque, tanto no modelo crônico quanto no agudo (p<0,001, para ambos). No segundo trabalho, o mesmo modelo foi usado, agora com medições nos níveis séricos da hidrólise de nucleotídeos da adenina. Nosso modelo agudo demonstrou uma diminuição significativa da hidrólise de ATP, ADP e AMP, no primeiro momento medido após o choque, 0 horas (p<0,05 para ATP, e p<0,01 para ADP e AMP), enquanto no modelo crônico avaliou-se que a atividade sérica da enzima aumentava significativamente 48 horas após o último choque (p<0,05 para os três nucleotídeos), permanecendo significativamente aumentada 7 dias após (p<0,001 para os três nucleotídeos). Assim, os resultados do primeiro trabalho apóiam a proposta de que o choque eletroconvulsivo não produz dano neural, e que as alterações observadas nos níveis de S100B e lactato, refletem uma reação astrocitária de natureza protetora. No segundo observamos que o modelo crônico de choque eletroconvulsivo é capaz de induzir ativações enzimáticas sustentadas, o que pode apoiar a idéia de que a adenosina esteja associada com os mecanismos bioquímicos envolvidos nas mudanças cerebrais ocasionadas pela eletroconvulsoterapia.

Avaliação dos efeitos do álcool e da cafeína em modelo de carcinogênese pancreática induzida por 7,12 dimetilbenzentraceno (DMBA) em camundongos

Introdução: Modelos experimentais de indução da carcinogênese pancreática são necessários para melhor compreensão da biologia tumoral e para estudar os efeitos de agentes promotores ou protetores. Objetivos: Avaliar os efeitos do álcool e da cafeína na carcinogênese pancreática induzida pelo 7,12- dimetilbenzantraceno (DMBA), aplicando a classificação sistematizada de neoplasias intra-epitelias pancreáticas (PanIN) de Hruban e cols. (2001)(1) em camundongos. Métodos: Cento e vinte camundongos mus musculus, machos, adultos foram divididos em quatro grupos. Em todos os animais foi induzida a carcinogênese pancreática pela implantação de 1mg de DMBA no pâncreas dos animais. Os animais recebiam ou água ou cafeína ou álcool ou álcool+cafeína de acordo com seu grupo. Para a análise histológica do pâncreas, adotou-se a classificação sistematizada das lesões precursoras (PanIN). Resultados: No grupo água + DMBA, 16,6% dos animais desenvolveram adenocarcinoma ductal pancreático (ADP) e 66,6% apresentaram neoplasias intra-epiteliais pancreáticas (PanIN). No grupo álcool + DMBA, 52,9% desenvolveram ADP (p<0,05) e 35,3% PanIN. No grupo cafeína + DMBA, 15% apresentaram ADP e 65% PanIN. No grupo álcool+cafeína + DMBA, 23,8% desenvolveram ADP e 71,4% PanIN. Conclusões: O modelo experimental de carcinogênese pancreática em camundongos utilizando o DMBA, é eficaz na indução de lesões precursoras e de adenocarcinoma pancreático. O álcool está associado ao aumento da freqüência de adenocarcinoma pancreático, enquanto que a cafeína não demonstrou este efeito.

Intervenções no sistema adenosinérgico : avaliação de aspectos neuroquímicos, locomotores e nociceptivos

A adenosina está presente em todos os tipos celulares exercendo um papel homeostático. Em sistema nervoso central e periférico seu papel neuromodulador é observado. A presença de adenosina no meio extracelular permite a ativação de receptores adenosinérgicos específicos, classificados em: A1, A2A, A2B e A3. A ativação dos receptores A1 e A2A, receptores de alta afinidade, está diretamente envolvida com o papel neuromodulador, visto que a sua ativação produz inibição e facilitação da liberação de neurotransmissores, respectivamente. A seleção de qual receptor será ativado, visto que exibem co-expressão em muitas regiões neurais, pode ser feita de acordo com os sítios de liberação ou produção de adenosina extracelular. Desta forma, receptores A1 seriam preferencialmente ativados pela adenosina liberada através dos transportadores bidirecionais de nucleosídeos e os receptores A2A preferencialmente ativados pela adenosina proveniente da degradação do ATP realizada por uma cascata enzimática. A hidrólise de ATP a adenosina é realizada pelas enzimas ectonucleosídeo trifosfato difosfoidrolases e ecto-5’-nucleotidase. Em ratos, a ativação do sistema adenosinérgico exerce seus efeitos neuromoduladores desde fases iniciais de desenvolvimento embrionário, alcançando o padrão adulto mesmo antes do nascimento. A ativação de receptores de adenosina na fase fetal e neonatal foi demonstrada ter como conseqüência o retardo no desenvolvimento global dos animais, bem como, ventriculomegalia e perda de massa cerebral branca. Esta informação levanta a questão da suscetibilidade do cérebro imaturo a certas drogas, tais como a cafeína. A cafeína é uma metilxantina com efeitos estimulantes, a qual exibe como base para seus efeitos o bloqueio inespecífico dos receptores de adenosina. No presente estudo, avaliou-se o efeito da administração de cafeína em diversos parâmetros. A administração aguda de cafeína, mas não a crônica, em ratos adultos foi capaz de alterar significativamente as atividades de hidrólise de ATP no hipocampo e de ADP no estriado. Este resultado poderia estar relacionado com a capacidade plástica do sistema adenosinérgico em restabelecer seu tônus em ratos adultos tratados cronicamente com cafeína. Além disto, verificou-se que a ação direta da cafeína afetou a produção de adenosina. A administração crônica de cafeína na água de beber de ratas mães durante a fase gestacional e lactacional alterou o padrão de hiperlocomoção induzido por MK-801, um antagonista de receptores NMDA glutamatérgicos, nos ratos filhotes aos 21 dias de vida, mesmo quando o acesso a cafeína foi retirado sete dias antes do teste. Além disto, o mesmo tratamento não alterou o limiar de dor de filhotes aos 14 e 50 dias de vida, bem como a analgesia induzida nestes animais aos 50 dias. Entretanto, quando os animais ainda recebiam cafeína no dia do teste, foi observado efeito analgésico somente nos ratos de 14 dias. A análise dos efeitos do tratamento sobre a degradação de acetilcolina e sobre a degradação de nucleotídeos em hipocampo de ratos jovens demonstrou que ambas as atividades foram alteradas. O conjunto de resultados desta tese indica que a intervenção no sistema adenosinérgico durante as fases gestacional e neonatal é capaz de desenvolver adaptações, provavelmente relacionadas ao aumento da expressão de receptores para adenosina, na tentativa de restabelecer o controle modulador adenosinérgico, considerada a importância dos sistemas avaliados para a manutenção do organismo.

Efeitos biológicos dos campos eletromagnéticos de ultra alta freqüência

Vários estudos têm sugerido que seres vivos podem ser suscetíveis aos campos eletromagnéticos (CEMs). Os supostos efeitos dos Campos Eletromagnéticos de Ultra Alta Freqüência (CEMUAFs) em sistemas biológicos são pouco conhecidos. Os relatos de um possível efeito biológico dependente da alteração de estados de oxidação entre pares de radicais sugerem um mecanismo de transdução orgânica para os campos. Outros trabalhos obtiveram alterações na sinalização celular e defesas antioxidantes após a exposição CEMUAFs e, tais alterações, poderiam ser um agente causador de doenças como, por exemplo, a leucemia infantil, esta já correlacionada com a exposição aos CEMs. Desta forma o objetivo deste estudo foi investigar se o CEMUAF (834 MHz) poderia interferir com o balanço oxidativo de planárias e ratos, assim como, estudar a participação de enzimas responsáveis pela hidrólise de nucleotídeos, enzimas estas reconhecidas por serem influenciadas pela ação de radicais livres. As planárias foram expostas por 1, 3 e 6 dias (8 h/dia). Após a exposição foi feito um homogenato de todo o corpo de cada animal. Foi encontrado um aumento na atividade da superóxido desmutase (SOD) e um decréscimo na atividade da catalase (CAT) e na defesa antioxidante não-enzimática (TRAP) após 6 dias de exposição. Adicionalmente, houve um aumento na freqüência de micronúcleos (MN) após 3 e 6 dias de exposição. Não houve alteração nos parâmetros de dano oxidativo a lipídios (TBARS) e proteínas (Carbonil) em nenhum dos tempos de exposição. Estes resultados sugerem um aumento nos níveis de radicais livres e de danos aos ácidos nucléicos. Estudos posteriores deverão determinar se estes efeitos apresentam ou não associações do tipo causa e efeito. Foram utilizados três modelos com ratos. No primeiro modelo, animais com idades de 30, 80 e 210 dias foram expostos por 6 dias (7:30 h/dia). Não foram encontradas mudanças nos parâmetros de TRAP, TBARS e Carbonil em nenhuma das idades expostas ao CEMUAF. Estes resultados sugerem que os tempos de exposição utilizados não foram suficientes para causar alguma mudança perceptível nos parâmetros de estresse oxidativo. No segundo modelo, utilizou-se o sangue e fígado dos neonatos expostos ao CEMUAF ainda no útero de suas mães durante todo o seu desenvolvimento embrionário (8:30 h/dia). Não foram encontradas mudanças em nenhum parâmetro oxidativo. Foi encontrado um aumento na freqüência de MN nas hemácias, sugerindo um efeito genotóxico da irradiação do celular afetando o tecido hematopoiético dos fetos. No terceiro modelo, utilizou-se o sangue de ratos adultos (180 dias) expostos por 12 dias (8:30 h/dia). Os níveis da hidrólise de ATP e ADP estavam aumentados no grupo irradiado. Nenhum efeito foi observado nas atividades da SOD e da CAT, sugerindo nenhuma participação de radicais livres nestes resultados. Ainda são necessários muitíssimos estudos para determinar quais os mecanismos transdutores dos CEMUAFs em sistemas biológicos e de que forma esta interação ocorre, porém estes resultados sugerem: (a) um papel para os radicais livres sobre, pelo menos, alguns dos efeitos atribuídos aos CEMUAFs e (b) que os organismos em fase de formação podem ser mais sensíveis aos campos. Por fim, sugerimos que sistemas biológicos podem sofrer a ação da irradiação com uma quantidade de energia muito menor do que a esperada para promover algum efeito no metabolismo.