Estudo comparativo e estereológico em um modelo de tolerância induzida à isquemia em ratos adultos

A morte neuronal é uma causa importante de disfunção no sistema nervoso central, que se manifesta comportamentalmente como déficits motores, cognitivos ou de memória. Uma causa importante de morte neuronal é a isquemia que é definida como a falta, ou diminuição, do aporte de sangue para os tecidos (GINSBERG, 1995 a; PULSINELLI, 1997). A região CA1 do hipocampo é a mais vulnerável à isquemia (PULSINELLI et al., 1982; SCHIMIDT-KASTNER & FREUND, 1991; NETTO et al., 1993; NELSON et al., 1997), e está relacionada com a memória tanto em humanos como em animais (SQUIRE, 1992). Vários trabalhos mostram que os animais isquêmicos apresentam pior desempenho em tarefas de aprendizado e memória (GINSBERG, 1997; SQUIRE, 1992; NETTO et al., 1993; NELSON et al., 1997). Estratégias visando proteger as células contra um dano letal vêm sendo estudadas há vários anos. A tolerância induzida à isquemia é a neuroproteção induzida por uma isquemia transitória breve a um evento isquêmico transitório de longa duração. Em geral, um evento isquêmico breve, de 2 minutos de duração, protege contra a morte celular induzida por uma isquemia grave, de 10-20 minutos de duração, desde que haja um período de 24 horas entre os dois eventos isquêmicos (CHEN & SIMON, 1997; KITAGAWA et al., 1997; BARONE et al., 1998; ROSA NETO, 1998). O presente trabalho teve como objetivo reproduzir o fenômeno da tolerância induzida à isquemia em ratos adultos e avaliar o efeito da tolerância induzida sobre o aprendizado e a memória da tarefa no labirinto aquático de Morris e sobre o volume da região CA1 hipocampal, pelo método de Cavalieri, em ratos submetidos à isquemia transitória grave. Os animais foram submetidos a um estudo do aprendizado da tarefa de localização da plataforma em um labirinto aquático em três fases. O labirinto aquático foi dividido virtualmente em 4 quadrantes com um ponto de largada entre cada um. Na primeira fase, a plataforma foi colocada em um dos quadrantes, onde permaneceu durante os 6 dias de treino., com 4 largadas em cada dia, e um teste no 7º dia sem a plataforma. Na segunda fase foram 4 dias de treino, seguido pelo teste, com a plataforma no quadrante oposto. Na última fase, a plataforma era colocada em um local diferente a cada dia para testar a memória de trabalho. Não foi observado diferença estatisticamente significativa nas latências para encontrar a plataforma entre os grupos controle e isquêmicos em todas as tarefas. Na análise do volume da região CA1, observamos uma diminuição de 20% nos animais submetidos à isquemia de 10 min., comparado com os dos grupos controle, isquemia de 2 min. e isquemia de 2+10 min. (neuroproteção) (p<0.05). Estes resultados comportamentais estão de acordo com os encontrados por alguns autores (KIYOTA et al., 1991; GREEN et al., 1992), porém outros autores relatam resultados diferentes (NETTO et al., 1993; IQBAL et al., 2001). As diferenças entre as metodologias utilizadas poderiam explicar parcialmente os resultados divergentes, também podemos supor que, 20% de diminuição de volume não é suficiente para provocar comprometimento do aprendizado.

Estudo sobre o papel da HSP27 na tolerância à isquemia cerebral em um modelo in vivo e em culturas organotípicas de hipocampo de ratos

A HSP27 é um membro da família das proteínas de choque térmico que protege as células contra diversos tipo de estresse, sendo expressa principalmente em astrócitos depois da isquemia. Neste trabalho, nós estudamos o papel da HSP27 na tolerância à isquemia cerebral, usando um modelo in vivo e culturas organotípicas. Foram estudados diferentes tempos de reperfusão in vivo (1, 4, 7, 14, 21, 30 dias) usando 2 min, 10 min ou 2+10 min de isquemia global transitória pela oclusão dos 4 vasos (4VO). Foi observado um aumento no imunoconteúdo no DG depois de todos os tratamentos, com uma diminuição na porcentagem de HSP27 fosforilada. Em CA1, região vulnerável, observou-se um aumento no imunoconteúdo depois de 10 ou 2+10 min de isquemia; em 10 min o aumento de fosforilação foi paralelo ao imunoconteúdo, enquanto com 2+10min de isquemia, quando a região CA1 se tornou resistente, houve uma diminuição na porcentagem de HSP27 fosforilada. Os resultados sugerem que a HSP27 pode estar atuando como chaperona, protegendo outras proteínas da desnaturação nos astrócitos, os quais podem auxiliar os neurônios a sobreviverem por manter a homeostase do tecido. Em culturas organotípicas, foram usados 5 ou 10 min de privação de glicose e oxigênio (OGD) ou 1µM de NMDA para induzir tolerância ao tempo letal, 40 min, de privação de glicose e oxigênio (OGD). Nesse caso, foi observado um aumento no imunoconteúdo de HSP27 depois de todos os tratamentos, mas a porcentagem de HSP27 fosforilada se manteve constante ou aumentou quando o pré-condicionamento ocorreu. A HSP27 pode estar modulando os filamentos de actina ou bloqueando o processo apoptótico, facilitando a sobrevivência das células. Em conjunto, os resultados sugerem que o mecanismo que leva à morte de células pode ser diferente nos dois modelos, exigindo atuações distintas da proteína.

Percoll e plasma seminal na preservação do sêmen eqüino a +4º C

O presente estudo visou verificar o efeito sobre alguns parâmetros da seleção por gradiente de Percoll® e da adição de plasma seminal do sêmen eqüino preservado a +4oC. O primeiro experimento avaliou a taxa de recuperação de espermatozóides após seleção por Percoll® em diferentes protocolos de centrifugação. Foram realizadas 5 coletas de sêmen de um garanhão. Imediatamente após a coleta, o sêmen foi avaliado quanto à motilidade, vigor e concentração. Foram retiradas duas amostras de 4 mL, diluídas em leite desnatado UHT com concentrações de 50 e 100 x 106 espermatozóides por mL cada. Cada uma destas amostras foi dividida em 4 alíquotas de 1 mL, que foram então colocadas sobre Percoll® e submetidas a diferentes tempos e velocidades de centrifugação. V1 - 200 g (5 min) + 800 g (10 min); V2 - 800 g (10 min); V3 - 800 g (15 min); V4 - 800 g (20 min). Após esse processo, o sobrenadante foi desprezado e o pellet de cada alíquota ressuspendido com 0,5 mL de leite UHT. As 8 amostras foram novamente avaliadas para concentração, motilidade e vigor. O segundo experimento estudou o efeito da adição de plasma seminal de diferentes qualidades ao sêmen eqüino selecionado por gradiente de Percoll® e resfriado a +4°C por até 72 horas. Foram utilizados 40 ejaculados de 4 garanhões, sendo dois com boa qualidade de sêmen e dois com baixa qualidade de sêmen. Imediatamente após a coleta, o sêmen foi avaliado quanto à motilidade, vigor e concentração e preparadas cinco frações de 100x106 espermatozóides, diluídas 1:1 (v/v) em EDTA-Glicose. Quatro delas, constituídas por 1mL a 2mL, foram depositadas sobre Percoll®. A fração restante foi centrifugada em tubo de vidro de 10 mL, sob as mesmas condições de tempo e velocidade das demais amostras. Foi realizada centrifugação por 5 minutos em 200 g, seguida de 10 minutos em 800 g. O sobrenadante foi descartado e o pellet ressuspendido com leite UHT desnatado compondo os seguintes tratamentos: Sp: 1,5 mL de leite UHT desnatado sem adição de plasma seminal; Hp: 1,425 mL de leite UHT desnatado acrescido de 75 L de plasma seminal homólogo; Ap: 1,425 mL de leite UHT desnatado acrescido de 75 L de plasma seminal do pool de alta qualidade; Bp: 1,425mL de leite UHT desnatado acrescido de 75 L plasma seminal do pool de baixa qualidade; Cc: foi centrifugada sem seleção por Percoll®, teve seu sobrenadante descartado e ressuspendida com 2 mL de leite UHT; C : uma amostra de sêmen diluído em leite UHT foi mantida como controle no processo de armazenamento. As amostras foram resfriadas a +4°C e examinadas a cada 24h até as 72 horas em relação à motilidade, funcionalidade de membrana (teste hiposmótico) e integridade de membrana (CFDA/PI). A seleção por gradiente descontínuo de Percoll® 90/45% mostrou-se efetiva na recuperação de espermatozóides com motilidades progressiva e total. A adição de 5% de plasma seminal ou a ausência de plasma não influenciaram os valores da motilidade das amostras selecionadas por gradiente de Percoll®. A seleção por Percoll não influenciou na percentagem de células com membrana plasmática funcional. Concentrações superiores a 2% de plasma seminal resultaram em decréscimo do número de células com membrana funcional, enquanto que as amostras sem plasma seminal apresentaram os melhores resultados e o grupo controle, que apresentava a maior percentagem de plasma, os piores. A utilização de Percoll® não separou células com alteração de membrana. A percentagem de células com membrana completamente íntegra foi significativamente maior nas amostras que sofreram processo de centrifugação, independentemente da seleção. O processo de seleção por Percoll® foi efetivo na recuperação de espermatozóides de eqüino com motilidade progressiva, mas não selecionou espermatozóides quanto à funcionalidade nem à integridade de membrana. Concentrações inferiores a 2% de plasma seminal melhoraram a funcionalidade de membrana. A ausência de plasma seminal melhorou os resultados de integridade das membranas plasmática e acrossomal; e a adição de plasma de alta qualidade não melhorou a motilidade de espermatozóides selecionados por Percoll®.

Efeitos do estresse neonatal sobre o comportamento alimentar na vida adulta em ratos

O estresse neonatal leva a alterações comportamentais e neuroquímicas na vida adulta, como menor reatividade ao estresse e aumento da expressão de receptores glicocorticóides no hipocampo. Entretanto, o efeito do estresse neonatal no comportamento alimentar foi pouco estudado. O principal objetivo deste trabalho foi avaliar o comportamento alimentar de ratos submetidos à separação materna no período neonatal, e verificar se havia alteração no estado emocional destes animais que pudesse ser correlacionada com a ingestão de alimentos palatáveis. Ninhadas foram divididas em grupos de ratos intactos, separados da mãe (incubadora a 37°C, 10 min/dia) e com estimulação tátil (estímulo pela mão do experimentador, de forma ântero-posterior no dorso, 10 min/dia), durante os dias 1 a 10 pós-natal, tendo seu comportamento analisado na vida adulta. Ratos que sofreram estresse neonatal (separação materna ou estímulo tátil) apresentam maior consumo de alimentos palatáveis como o doce e o salgado na vida adulta, sem alteração na ingestão de ração padrão ou no consumo de soluções doces e salgadas. Este efeito é persistente até idades mais avançadas. Além disso, estes animais não apresentam alterações em testes comportamentais para verificar ansiedade como o labirinto em cruz elevada, claro-escuro e campo aberto. Da mesma forma, o aumento do consumo de doce não é revertido por diazepam antes do teste. Logo, o estresse neonatal modifica o padrão de preferência alimentar de ratos na vida adulta, e este comportamento não parece ser relacionado a um estado de ansiedade alterado nestes animais. É possível que outros mecanismos de saciedade e recompensa estejam envolvidos.

Estudo comportamental sobre os efeitos do tratamento crônico com imipramina em ratos manipulados no período neonatal

Eventos precoces, particularmente diferentes tipos de estresse, como hipóxiaisquemia, infecções, desnutrição/hipernutrição e negligência materna, podem trazer conseqüências para toda a vida. Tais conseqüências variam conforme a qualidade, a intensidade e a janela de tempo em que o agente agressor atuou, além da susceptibilidade do organismo que o recebeu. Os mecanismos pelos quais estes eventos levam a tais alterações ainda não estão totalmente esclarecidos, mas sabe-se que esta fase da vida constitui-se ao mesmo tempo de um período de hiporresponsividade ao estresse, assim como uma fase crítica para desenvolvimento de diversos órgãos e sistemas. Sabe-se que desafiando a homeostasia do organismo nesse momento, ocorre uma programação de diversos sistemas envolvidos na resposta ao estresse a um novo equilíbrio funcional, o que pode alterar a relação saúde-doença na vida adulta. Dentre os modelos para o estudo de intervenções precoces, temos a Manipulação Neonatal, que consiste numa separação breve da mãe, durante o período hiporresponsivo ao estresse. Nesse trabalho usou-se a separação por 10 min, nos primeiros 10 dias de vida. A partir desta intervenção animais tornam-se menos reativos ao estresse, apresentam comportamento menos ansioso frente a estressores e têm comportamento alimentar caracterizado por um aumento no consumo de alimento palatáveis, sem alteração no consumo de ração padrão. O controle da alimentação envolve basicamente dois componentes, um homeostático e outro hedônico. A preferência alimentar alterada dos animais manipulados no período neonatal indica possivelmente uma alteração da percepção hedônica do alimento. As vias dopaminérgicas mesolímbicas estão associadas a recompensas naturais ou biológicas como alimentação, sexo, drogadição. Sabe-se que animais manipulados no período neonatal apresentam redução de receptores D3 no núcleo acumbens. A Imipramina é um antidepressivo tricíclico que age principalmente por inibição da recaptação de serotonina e noradrenalina, e com ações indiretas sobre o sistema dopaminérgico e eixo Hipotálamo – Pituitária - Adrenal. Seu uso crônico reforça a capacidade do organismo de enfrentar o estresse e de sentir recompensas naturais como a da alimentação. O objetivo desse trabalho foi investigar se o tratamento crônico com Imipramina reverteria o comportamento alimentar alterado de animais manipulados no periodo neonatal. Adicionalmente investigou-se o efeito deste tratamento sobre outras alterações comportamentais como a menor inibição exploratória no Labirinto em Cruz Elevado e menor habituação no teste do Campo Aberto. No consumo basal de alimento doce, houve aumento de consumo de alimento doce apenas em machos manipulados, sendo que o tratamento com Imipramina diminui este efeito. Os animais machos manipulados não tiveram aumento de consumo em resposta ao estresse de contenção nem à exposição a um ambiente enriquecido, porém responderam à novidade. Novamente aqui o tratamento com Imipramina reverteu o comportamento, pois os animais tratados apresentaram maior reatividade aos estímulos, igualando seu modo de reagir ao dos animais não manipulados. As fêmeas não apresentaram diferenças no consumo de alimento doce no basal, porém o tratamento com Imipramina reduziu a intensidade da resposta aos diferentes estímulos, levando-as a um menor consumo. Nos testes comportamentais, de um modo geral, animais manipulados, tanto machos (no Labirinto em Cruz Elevado), quanto fêmeas (no Campo Aberto), mostraram sinais de menor ansiedade, sem efeito da Imipramina. Porém entre os não manipulados, a Imipramina teve efeito ansiolítico apenas em fêmeas. Tanto o tratamento medicamentoso, quanto a manipulação neonatal levaram a uma menor habituação ao Campo Aberto. Na Preferência Condicionamada de Lugar houve igual desempenho de todos os animais. O principal achado deste trabalho foi o fato dos animais manipulados não tratados com Imipramina terem apresentado uma reduzida variabilidade nas respostas decorrentes de mudanças ambientais, evidenciado tanto no comportamento alimentar persistentemente mantido no mesmo patamar (independentemente das intervenções), quanto na resistência a habituação ao Campo Aberto. A Imipramina foi eficaz em reverter apenas a alteração do comportamento alimentar de ratos machos manipulados no período neonatal, permitindo-lhes uma maior variabilidade de resposta, o que aproximou o seu comportamento ao dos animais não manipulados.

Avaliação de machos suínos: sensibilidade ao resfriamento e capacidade de ligação espermática a um substrato sintético

O presente trabalho constou de três estudos. No primeiro estudo, cinco ejaculados de 30 machos foram analisados conforme a manutenção da MOT a 17ºC, sendo classificados em três tipos: MOT <60% nas 72h (EI); MOT ≥60% nas 72h e <60% nas 144h (EII) e MOT ≥60% nas 144h (EIII). Doze machos foram selecionados e distribuídos em três grupos: MAIOR, MÉDIA e MENOR sensibilidade espermática ao resfriamento. Em seguida, foram coletados cinco ejaculados de cada macho, sendo a MOT avaliada a cada 24h, e a integridade da membrana espermática (IM) e de acrossomas normais (NAR) nas 24, 72, 120 e 168h. Machos menos sensíveis ao resfriamento apresentaram menor variação na MOT do período pré- para o pós-seleção. Diferenças entre os machos foram observadas desde as 24 até 168h para MOT, nas 120 e 168h para MI e nas 72 e 168h para NAR. A MOT foi mais afetada que MI e NAR durante o armazenamento do sêmen in vitro. No estudo 2 foi avaliada a possibilidade de reverter a sensibilidade espermática ao resfriamento pela troca de plasma seminal (PS) entre machos com diferente manutenção da MOT a 17ºC. Foram utilizados ejaculados de cinco cachaços selecionados e classificados como: menor (MES) e maior sensibilidade ao resfriamento (MAS). Foram utilizados seis tratamentos, com cinco repetições cada. Nos tratamentos T1 e T3, o sêmen dos machos MES e MAS, respectivamente, foram processados de acordo com o protocolo convencional. Foi efetuada centrifugação (800g por 10 min) e adição do PS (10mL) homólogo para os espermatozóides MES e MAS, respectivamente, nos T2 e T4. Após a centrifugação, foi realizada a troca do PS, sendo que espermatozóides dos machos MES foram expostos ao PS dos machos MAS (T5) e o PS dos machos MES foi adicionado aos espermatozóides dos machos MAS (T6). A MOT foi avaliada a cada 24h, durante sete dias de conservação. NAR e de IM foram avaliados nas 24, 72, 120 e 168h. Diferenças na MOT, entre os machos MES (T1) e MAS (T3), foram observadas após armazenamento de 48h. Não foram observadas alterações em MOT e IM, quando foi efetuada a troca de PS entre os machos MES e MAS. Não foi possível reverter a maior sensibilidade ao resfriamento de espermatozóides suínos, após a ejaculação, com a adição de 10% do PS de machos com sêmen de menor sensibilidade. No terceiro estudo, foi avaliada a fertilidade de sêmen suíno pelo teste de ligação de espermatozóides a um substrato sintético. A MOT e o percentual de espermatozóides ligados (PEL) foram avaliados nas 5, 24, 48 e 72 horas de armazenamento a 17ºC. O PEL foi determinado em soluções contendo 6,25 ou 12,5 milhões de espermatozóides/mL, com ou sem albumina sérica bovina (BSA), preparadas a partir de dois a cinco ejaculados de cada um dos quatro machos. Houve correlação positiva (r=0,33) entre a MOT e o PEL. Os machos diferem quanto à capacidade de ligação de seus espermatozóides ao substrato sintético, a partir de 24 horas de armazenamento do sêmen. Maior percentual de espermatozóides ligados ao substrato sintético é verificado com a inclusão de BSA e com o aumento da concentração espermática.

Detecção de alterações neuroendócrinas e comportamentais em bebês de mães com depressão pós-parto

Introdução: Há evidências consideráveis de uma grande influência da mãe e/ou do cuidador primário no desenvolvimento neurobiológico e psicológico da criança. Falhas no cuidado inicial devido a negligência, abuso físico e/ou psicológico estão associadas a alterações no desenvolvimento motor e mental, a depressão e ansiedade. A privação materna pode ocorrer no caso da depressão pós-parto (DPP) mesmo sem a intenção da mãe de prejudicar o bebê. Entre os achados na criança, associados à depressão da mãe, estão patologias do apego, alterações no EEG e no desenvolvimento mental e motor, déficit de aprendizado, sintomas de internalização e transtorno depressivo. Há uma associação entre cortisol salivar elevado na infância e história de depressão materna nos primeiros anos de vida. Objetivo: Examinar a correlação entre a depressão pós-parto e os níveis de cortisol salivar, bem como as alterações comportamentais e motoras, em bebês de seis meses, antes e após um estressor moderado, em comparação com um grupo controle. Método: Trinta e nove bebês de 6 meses (16 de mães deprimidas e 23 de mães controles) provenientes do ambulatório de puericultura e do serviço de neonatologia do Hospital de Clinicas de Porto Alegre (HCPA) participaram do estudo. As mães foram avaliadas através da mini entrevista neuropsiquiátrica internacional para adultos, semi-estruturada (MINI), segundo o DSM-IV. A gravidade da depressão foi avaliada através das escalas Escala de Depressão Pós-Parto de Edimburgo (EPDS) e do Inventário de BECK para depressão (BDI). Os bebês foram submetidos ao estressor denominado “Face-to-face stil-face”. Antes e após 10 min e 20 min deste procedimento foi coletado seu cortisol salivar. A dosagem do cortisol salivar foi feita por radioimunoensaio. A avaliação do desenvolvimento mental e motor através da Bayley Scales of Infant Development-II(BSID-II) As análises estatísticas foram feitas no programa SPSS for Windows, versão 12.0. Foram considerados significativos os resultados com p < 0,05. Resultados: Os níveis de cortisol salivar basal dos bebês de mães deprimidas estavam significativamente aumentados em comparação com o grupo controle. Foi verificada uma diferença estatisticamente significativa entre as médias das variações basal e 10 min nos bebês de mães deprimidas, quando comparada com os bebês de mães não deprimidas, controladas para valores basais. Observou-se uma correlação positiva moderada entre o cortisol basal do bebê e o BDI da mãe. Conclusão: Os achados deste estudo evidenciaram que os níveis de cortisol basal dos bebês de mães deprimidas estavam significativamente elevados em relação aos bebês de mães não deprimidas, assim como seus níveis de cortisol dez minutos após o estressor. O presente estudo sugere que aos 6 meses já pode estar ocorrendo uma alteração no eixo hipotálamo-pituitária-adrenal persistente e cronica. O achado de níveis basais aumentados é crucial devido as repercussões da elevação crônica dos glicocorticóides descrita na literatura. Este dado corrobora a hipótese de que intervenções precoces nas mães deprimidas devam ser realizadas visando também um trabalho preventivo em relação a prole.