14 resultados para |Nested-PCR
em Lume - Repositório Digital da Universidade Federal do Rio Grande do Sul
Resumo:
O vrus da anemia das galinhas (CAV) pode causar imunodepresso em galinhas de todas as idades e doena nos frangos jovens, a qual caracterizada por severa anemia, atrofia da medula ssea e hemorragias. A doena clnica rara hoje, porm a forma subclnica freqentemente encontrada em criaes comerciais e resulta num considervel decrscimo do desempenho. O CAV apresenta variabilidade gentica, entretanto, em relao s amostras brasileiras do CAV, pouco ou quase nada desta variabilidade conhecida. O presente trabalho descreve um protocolo de Nested-PCR para a deteco do CAV diretamente de amostras clnicas e analisa filogeneticamente as seqncias nucleotdicas das amostras positivas buscando verificar se a patologia apresentada por estas est relacionada com a variabilidade gentica. Para a extrao de DNA, o mtodo baseado em tiocianato de guanidina mostrou-se mais eficiente e prtico de executar que os demais testados. Foi selecionado um par de primers que amplifica uma regio de 664 pb do gene vp1 e outro par que amplifica uma regio interna de 539 pb para a realizao da Nested-PCR. A especificidade dos primers foi avaliada utilizando amostras de lotes controlados para CAV e 30 diferentes isolados de vrus e bactrias causadoras de doenas em galinhas, as quais no geraram produto de amplificao. A sensibilidade foi determinada a partir de diluies seriadas da vacina comercial para o CAV. A Nested-PCR mostrou ser mais sensvel do que a PCR e foi capaz de detectar 0,16 DICC50% da cepa vacinal. Alm disso, a Nested-PCR detectou DNA viral em tecidos, soro e cama aviria de lotes com e sem sintomas clnicos.O produto de amplificao de 539 pb do gene vp1 de 44 amostras, provenientes de diferentes Estados produtores de frangos do Brasil, foi seqenciado e foram encontradas 10 novas seqncias nucleotdicas do CAV. Estas 10 seqncias nucleotdicas foram analisadas filogeneticamente pelo mtodo de distncia neighbour joining com 1000 replicaes o qual, mostrou que no houve correlao entre a patogenia apresentada nos animais e os grupos genticos. Estas seqncias nucleotdicas tambm foram comparadas com 30 cepas de CAV isoladas em outros pases e no foi observada correlao entre a distribuio geogrfica e a variabilidade gentica. Substituies de amino cidos foram observadas em 9 posies sendo que, 65R substituindo o resduo Q e 98F substituindo o resduo Y ainda no haviam sido observadas. Conclui-se que, como tcnica de deteco do CAV, o protocolo de Nested-PCR aqui descrito mais sensvel e menos trabalhoso do que o isolamento viral. As amostras Brasileiras de CAV possuem caractersticas filogenticas similares s isoladas em outros pases.
Resumo:
OBJETIVO: Investigar a presena do papiloma vrus humano no adenocarcinoma de clon e reto. MTODOS: Setenta e dois pacientes com adenocarcinoma de clon e reto foram analisados. Foram coletadas duas amostras de cada paciente: uma amostra do tumor e outra de mucosa no neoplsica distante 15 cm do tumor. Como grupo de controle, tambm foram estudadas amostras de mucosa de quinze pacientes sem cncer colorretal. Os tecidos foram analisados por auto nested PCR usando o primer consensus GP5+/GP6+. Dois primers especficos para regio E6 dos HPV 16 e HPV 18 tambm foram utilizados. RESULTADOS: O DNA do HPV foi detectado em tecidos de clon e reto de 60 pacientes com cncer ( 83 por cento), enquanto que este no foi encontrado em nenhum dos pacientes controles sem tumor ( p<0,001). Em vinte e trs pacientes, o DNA do HPV estava presente tanto no tecido tumoral como na mucosa no neoplsica adjacente. Em vinte e trs pacientes o DNA do HPV foi encontrado apenas no tumor, enquanto que em quatorze, s foram encontrados nos tecidos normais coletados prximos ao tumor de clon e reto. Em setenta e cinco por cento dos casos positivos foram identificados os HPV tipo 16 ou 18 por PCR com primers E6 especficos. Os achados positivos obtidos por PCR foram confirmados por seqenciamento viral. CONCLUSO: O HPV est presente no clon e reto da maioria dos pacientes com carcinoma de clon e reto estudados, sugerindo que este vrus pode estar relacionado patognese do cncer colorretal. Sero necessrios mais estudos para determinar o papel do HPV na carcinognese colorretal.
Resumo:
O interesse da Medicina Veterinria nas espcies silvestres tem aumentado gradativamente, principalmente no estudo dos contextos ecolgicos de sade. Dentro desse contexto, autores realizaram estudos com o objetivo de conhecer a importncia de Salmonella sp. na sade das aves silvestres e seu potencial de transmisso para humanos e outros animais. Informaes sobre a prevalncia e distribuio dos sorovares de salmonelas na populao de animais silvestres e domsticos so essenciais para relacionar os possveis reservatrios que possam ser responsveis pela transmisso dessa zoonose. Este trabalho teve como objetivo a deteco de Salmonella sp. em psitacdeos clinicamente sadios por Reao em Cadeia da Polimerase (PCR). Foram coletados suabes cloacais de 280 psitacdeos mantidos em cativeiro no Estado do Rio Grande do Sul, pertencentes a treze espcies, provenientes de um zoolgico, um criadouro conservacionista e um criadouro comercial. O DNA das amostras foi extrado pelo mtodo de fenol-clorofrmio e examinados pela PCR com a utilizao de um par de iniciadores que amplifica um fragmento de 284 pb do gene invA pertencente ao gnero Salmonella, resultando em 37 amostras positivas. No houve diferena na prevalncia de salmonela entre os trs plantis nem entre as 13 espcies analizadas. No foi possvel a deteco desse patgeno pela PCR com iniciadores para a identificao de S. Typhimurium, S. Enteritidis, S. Pullorum e S. Gallinarum, nem atravs da Tcnica Microbiolgica Convencional nas amostras detectadas pela PCR genrica, provavelmente devido a maior sensibilidade e especificidade da PCR genrica. De acordo com a reviso bibliogrfica realizada, este foi o primeiro trabalho de deteco direta de Salmonella em psitacdeos utilizando a PCR. Os resultados indicaram que aproximadamente 13,2% dos psitacdeos mantidos em cativeiro eram portadores assintomticos ou eram transientemente infectados pelo gnero Salmonella.
Resumo:
O gnero Brucella formado por coco-bacilos Gram negativos patognicos ao homem e animais, sendo classificado como patgeno de grupo de risco III. A identificao dessas bactrias apresenta vrias limitaes como: exigncia de inoculao em vrios meios, tempo de incubao longo e necessidade de soros imunes e bacterifagos. Devido sua alta patogenicidade e ao longo tempo de exposio dos laboratoristas bactria, a brucelose uma das infeces mais freqentemente adquiridas em laboratrio. Alm da contaminao em laboratrio, a transmisso ao homem pode ocorrer atravs de animais infectados e ingesto de produtos derivados, como o leite cru. A procura de mtodos rpidos de identificao das espcies e biovares pode ser til para diminuir os riscos do manuseio desta bactria e na tomada de medidas de controle epidemiolgico. O principal objetivo deste trabalho foi facilitar a classificao de cepas de referncia de Brucella spp. e isoladas no Brasil utilizando a tcnica de rep-PCR com oligonucleotdeos do elemento BOX, uma seqncia repetida presente no genoma de vrias bactrias. Foram analisados 38 isolados representando diferentes espcies e biovares de Brucella sp. e 13 isolados de gneros relacionados como controle da especificidade da reao. Foi realizada uma confirmao prvia dos isolados de brucela por testes bioqumicos e PCR gnero-especfica. A tcnica de BOX-PCR agrupou todas as espcies e biovares de Brucella em um nico grupo com nvel de similaridade entre 100 e 74%. Diferenas entre os isolados, quanto a presena ou ausncia de bandas, puderam ser observadas. Entretanto, essas divergncias no caracterizam uma espcie ou biovar. Bandas comuns a todos os isolados de Brucella sp. podem caracterizar o gnero.
Resumo:
A Salmonella uma das principais causas de doenas transmitidas por alimentos em todo o mundo, sendo que no Rio Grande do Sul ela tem sido apontada como o principal agente de toxinfeces alimentares nos ltimos anos. Nesse trabalho, foram caracterizadas linhagens de Salmonella isoladas de alimentos envolvidos em Salmoneloses ocorridas no Rio Grande do Sul, no perodo de 2001 a 2002. Entre os 85 isolados investigados, 79 (93%) foram sorotipificados como S. Enteritidis, enquanto os outros seis isolados foram classificados como S. Javiana (n=1), S. Infantis (n=1), S. Agona (n=1), S. Typhimurium (n=1) e S. enterica subsp. enterica (1,4,5) (n=2). A resistncia das amostras de S. Enteritidis a dez agentes antimicrobianos foi investigada. De modo geral, altas porcentagens de sensibilidade foram verificadas. As maiores porcentagens de resistncia foram apresentadas em relao ao cido nalidxico (21,5%), gentamicina (12,7%) e estreptomicina (11,4%). A resistncia a um ou mais antimicrobianos foi verificada em 30 amostras (37,97%), o que permitiu que os isolados fossem agrupados em 32 perfis de susceptibilidade. Apenas duas amostras apresentaram resistncia mltipla a quatro drogas. Quando os isolados de S. Enteritidis foram submetidos PCR-Ribotipificao, somente dois perfis (R1 e R2) foram identificados, sendo que o perfil R1 agrupou 92,4% dos isolados. . Os mesmos isolados tambm foram analisados por RAPD, sendo possvel identificar quatro perfis de bandas (A a D). O perfil A agrupou 81% das amostras, enquanto os perfis B, C e D agruparam 9%, 5% e 5% dos isolados, respectivamente. Os resultados das anlises de PCR-Ribotipificao e de RAPD sugerem que uma mesma linhagem de S. Enteritidis foi isolada a partir de alimentos envolvidos em Salmoneloses ocorridas em diferentes cidades do Estado durante o perodo de 2001 a 2002.
Resumo:
O enrolamento do arroz uma doena viral emergente no Brasil causada pelo Rice stripe necrosis virus (RSNV) que transmitido pelo protozorio Polymyxa graminis. RSNV um membro do gnero Benyvirus com genoma dividido em 4 RNAs de fita simples no sentido positivo (ssRNA +). Em funo da falta de conhecimento sobre a seqncia de nucleotdeos do seu genoma, a deteco de RSNV atravs de mtodos moleculares no utilizada. O objetivo deste trabalho foi identificar seqncias do genoma de RSNV que possibilitassem sua deteco em plantas de arroz atravs da tcnica de transcrio reversa seguida da reao em cadeia da polimerase (RT-PCR). As seqncias do genoma foram identificadas a partir de clones de uma biblioteca de cDNAs obtidos de uma amostra do vrus parcialmente purificado. Os clones que hibridizaram com sondas sintetizadas a partir de RNA de plantas infectadas com RSNV foram seqenciados e comparados s seqncias do GenBank. Um fragmento de 957 nt da extremidade 3 da fita de um dos 4 RNAs genmicos de RSNV foi obtido. A anlise da seqncia nucleotdeos desse fragmento no revelou qualquer similaridade com seqncias conhecidas, tampouco indicou uma possvel funo. Um par de oligonucleotdeos iniciadores foi desenhado a partir de um clone que potencialmente contm uma seqncia de RSNV. A especificidade e a sensibilidade da RT-PCR utilizando esse par de oligonucleotdeos iniciadores, bem como sua eficincia na deteco do vrus em diferentes partes da planta de arroz, foram avaliadas. Os resultados indicam que a RT-PCR especfica para RSNV e pode detectar o vrus em tecido oriundo das razes, do colo e de folhas com distoro. Comparada ao diagnstico da doena atravs da observao de sintomas e de estruturas do vetor, a RT-PCR uma ferramenta confivel para a diagnose do enrolamento do arroz.
Resumo:
A doena de Marek (MD), causada por um alfaherpesvrus, uma enfermidade linfoproliferativa que acomete principalmente galinhas. Como no existe tratamento, a melhor forma de preveno e controle da MD atravs do uso de vacinas atenuadas, que vm sendo usadas desde 1970. Este trabalho descreve a anlise de vacinas vivas congeladas contra o sorotipo 3 do vrus da doena de Marek (herpesvrus de peru HVT) por PCR em tempo real (qPCR) e por cultivo em clulas de embrio de galinha. Foram avaliadas trs vacinas (cepa FC126) provenientes de distintos fabricantes. As anlises da homogeneidade inter e intra-lote apresentaram, respectivamente, mdia desvio padro de 2,6 1,7%, 2,1 1,1% e 1,2 0,1% e mdia desvio padro de 1,5 0,1%, 1,2 0,8% e 1,0 0,3% para A, B e C, respectivamente. A qPCR subestimou os ttulos das vacinas concentradas 4x e superestimou os ttulos das vacinas diludas 8x, enquanto o cultivo celular superestimou os ttulos das vacinas concentradas. As vacinas apresentaram quantidades diferentes de clulas/dose e unidade formadoras de placa/dose. Conseqentemente, a relao PFU/clula tambm foi diferente, o que demonstra a necessidade de construo de curvas diferentes, para cada fabricante, para a titulao por qPCR.
Resumo:
A Doena de Marek uma enfermidade linfoproliferativa das aves, causada por um alfaherpesvrus e caracterizada pela infiltrao de clulas em nervos perifricos, gnadas, ris, vsceras, msculos e pele. Desde 1970, vacinas atenuadas tm sido utilizadas como ferramenta principal no controle da doena. Esse trabalho descreve a implantao da Reao em Cadeia da Polimerase em Tempo Real (qPCR) para a titulao de vacinas contra o vrus da doena de Marek do sorotipo 3, herpesvrus dos perus (HVT). A qPCR foi comparada com a tcnica tradicional de titulao, baseada no cultivo celular de fibroblastos de embrio de galinha. Foram avaliadas trs vacinas vivas (congeladas, cepa FC126) provenientes de distintos fabricantes. A tcnica molecular apresentou alta correlao entre os valores de threshold cycle (CT) e respectivas diluies das vacinas (R2 = 0,99), indicando que, dentro desta faixa linear testada (102 a 104 PFU/dose), a qPCR foi capaz de quantificar as vacinas disponveis no mercado. A reprodutibilidade da titulao em cultivo celular e qPCR foi avaliada pela realizao dos testes em trs dias distintos a partir de ampolas de um mesmo lote da vacina. Os ttulos obtidos por ambos os mtodos demonstraram alta reprodutibilidade e coerncia com o fornecido pelo fabricante. Caracterizou-se tambm a proporo de vrus livres e associados s clulas, onde foi observado que, pelo menos, 90% dos vrus encontravamse na forma associada. Este trabalho indicou que a qPCR reprodutvel, rpida e menos trabalhosa do que a titulao em cultivo celular tradicionalmente utilizada.
Resumo:
Cryptococcus neoformans uma levedura oportunista que pode se alojar no sistema nervoso central causando meningite, meningoencefalite e encefalite principalmente em indivduos com algum comprometimento do sistema imune. responsvel por 4,5% das infeces oportunistas que acometem pacientes portadores do Vrus da Imunodeficincia Humana (HIV-positivos). Cryptococcus gattii um patgeno primrio responsvel por uma alta incidncia de criptococomas no pulmo e no crebro e que apresenta uma alta morbidez neurolgica e uma resposta retardada terapia antifngica. O diagnstico da criptococose , atualmente, baseado na deteco da levedura em amostras clnicas, no cultivo com posterior identificao bioqumica e na pesquisa de antgenos circulantes. A diferenciao entre as espcies C. neoformans e C. gattii, na maioria dos laboratrios, realizada utilizando o meio de cultura gar canavanina-glicina-azul de bromotimol (CGB) e demora em torno de sete dias. Neste trabalho foi padronizada uma metodologia de PCR multiplex que pode vir a substituir as provas bioqumicas utilizadas atualmente para a identificao das espcies de Cryptococcus, reduzindo em 6 dias o tempo necessrio para a identificao das espcies. A metodologia tambm se mostrou mais especfica na identificao das espcies, concordando com os resultados das sorotipagens em todos os 132 isolados de Cryptococcus testados, enquanto o resultado obtido com o cultivo em gar CGB foi discordante em 6 dos 132 isolados, sendo 5 falso-positivos e 1 falso negativo. Foi tambm realizado o primeiro estudo epidemiolgico do perfil de pacientes com meningite criptoccica no estado do Rio Grande de Sul notificados no Laboratrio Central de Sade Pblica IPB-LACEN/RS no perodo de 2000 a 2005. A maioria dos pacientes do sexo masculino (77,12%), branco (83,5%), na faixa etria entre 30 a 39 anos (46,24%) e infectados pelo HIV (95%).
