Efeito da homocisteína sobre as atividades da butirilcolinesterase e da Na+, K+-ATPase em sangue de ratos

A homocistinúria é uma desordem metabólica causada pela deficiência da enzima cistationina β-sintase, resultando no acúmulo tecidual de homocisteína e de metionina. Os pacientes afetados por essa doença apresentam principalmente retardo mental, isquemia cerebral, convulsões e aterosclerose. Entretanto, os mecanismos fisiopatológicos responsáveis por essas manifestações são pouco conhecidos. O sistema colinérgico apresenta papel importante na função cognitiva do qual as colinesterases, acetilcolinesterase e butirilcolinesterase, são constituintes ubíquos. Similarmente à acetilcolinesterase, a butirilcolinesterase hidrolisa a acetilcolina e está presente no soro, coração, endotélio vascular e no sistema nervoso. Estudos têm mostrado que as colinesterases estão inibidas no córtex cerebral de pacientes com a doença de Alzheimer. Adicionalmente, há evidências na literatura mostrando que as colinesterases são inibidas por radicais livres. A Na+,K+-ATPase é uma enzima fundamental responsável pela manutenção do gradiente iônico necessário para a excitabilidade neuronal e consome de 40 a 60% do ATP formado no cérebro. Recentes estudos têm demonstrado que essa enzima é inibida por radicais livres e também que sua atividade está diminuída na isquemia cerebral, epilepsia e em doenças neurodegenerativas como a doença de Alzheimer. Além disso, nosso grupo demonstrou que a homocisteína inibe a atividade da Na+,K+-ATPase cerebral. Considerando que: a) pouco se sabe sobre os mecanismos responsáveis pelas manifestações neurológicas que ocorrem na homocistinúria, b) a administração de homocisteína prejudica a memória, c) as colinesterases são importantes para as funções cognitivas, d) a atividade da Na+,K+-ATPase está diminuída na isquemia cerebral, e) a homocisteína inibe a atividade dessa enzima in vitro e f) as atividades da butirilcolinesterase e da Na+,K+-ATPase em tecidos periféricos podem ser consideradas marcadores de alterações que ocorram no sistema nervoso central, no presente estudo determinamos o efeito in vitro da homocisteína sobre as atividades da butirilcolinesterase e da Na+,K+-ATPase em soro e plaquetas de ratos, respectivamente. Também determinamos o efeito da administração aguda e crônica de homocisteína sobre a atividade da butirilcolinesterase sérica e a influência das vitaminas E e C sobre os efeitos inibitórios causados pela homocisteína. Os resultados mostraram que a homocisteína diminuiu significativamente a atividade da butirilcolinesterase em soro de ratos de 60 dias in vitro. A homocisteína inibiu essa enzima de forma competitiva com a acetilcolina como substrato. Também foi verificado que a homocisteína reduziu significativamente as atividades da butirilcolinesterase e da Na+,K+-ATPase em soro e plaquetas de ratos de 29 dias, respectivamente. Nossos resultados também mostraram que a administração aguda de homocisteína diminuiu significativamente a atividade da butirilcolinesterase em soro de ratos de 29 dias. Adicionalmente, verificou-se que o pré-tratamento com as vitaminas E e C não alterou per se a atividade da butirilcolinesterase, mas preveniu a redução da atividade dessa enzima causada pela administração aguda de homocisteína. Por fim, determinou-se que a administração crônica desse aminoácido diminuiu significativamente a atividade da butirilcolinesterase. Os resultados obtidos em nosso trabalho sugerem que a redução das atividades da butirilcolinesterase e da Na+,K+-ATPase pode estar associada à disfunção neurológica presente em pacientes homocistinúricos, uma vez que a determinação dessas enzimas em sistemas periféricos represente um marcador para a ação neurotóxica da homocisteína.

Efeito de aminoácidos acumulados na felilcetonúria, hipertriptofanemia e cistinose sobre a atividade da piruvatoquinase em córtex cerebral de ratos

A cistinose é uma desordem sistêmica de estocagem autossômica recessiva hereditária rara, causada pelo transporte deficiente de cistina através da membrana lisossomal.. O acúmulo excessivo de cistina dentro dos lisossomos leva à destruição tecidual por mecanismos ainda não totalmente compreendidos. O acúmulo de cistina no sistema nervoso central pode provocar sintomas neurológicos tais como: convulsões, tremores e retardo mental. A hipertriptofanemia é uma desordem metabólica rara, provavelmente causada por um bloqueio na conversão do triptofano a quinurenina, acumulando triptofano e alguns de seus metabólitos no plasma e tecidos dos pacientes. Os pacientes apresentam retardo mental leve a moderado com respostas afetivas exageradas, mudanças periódicas de humor, comportamento hipersexual, e ataxia, além de erosões cutâneas de hipersensibilidade e retardo no crescimento. A fenilcetonúria é um erro inato do metabolismo causado pela deficiência severa na atividade da enzima fenilalanina hidroxilase hepática que converte fenilalanina em tirosina. Esta doença é bioquimicamente caracterizada pelo acúmulo de fenilalanina e seus metabólitos, fenilpiruvato, fenillactato, fenilacetato, feniletilamina e O-hidroxifenilacetato no sangue e outros tecidos. Pacientes não tratados podem apresentar severo retardo mental e psicomotor e, em alguns pacientes, irritabilidade, movimentos despropositados, reflexos diminuídos dos tendões, convulsões, formação deficiente de mielina e microcefalia. Apesar de haver um consenso sobre o papel da fenilalanina no dano cerebral, os mecanismos pelos quais a fenilalanina é neurotóxica parece serem múltiplos e ainda pouco conhecidos. Estas 3 doenças: fenilcetonúria, hipertriptofanemia e cistinose são caracterizadas como Erros Inatos do Metabolismo. Os pacientes afetados por qualquer uma destas patologias apresentam uma característica clínica comum: o dano cerebral. Considerando que o metabolismo energético parece estar alterado nas três doenças e que a piruvatoquinase é uma enzima crucial para o metabolismo da glicose e liberação/armazenamento de energia para o cérebro, decidimos estudar o efeito dos três aminoácidos acumulados nestas doenças (fenilalanina, triptofano e cistina) sobre a atividade desta enzima em córtex cerebral de ratos, já que a alteração da atividade dessa enzima poderia contribuir para o dano cerebral característico nestes pacientes. Os estudos in vitro e in vivo mostraram que a o fenilalanina e o triptofano inibem a atividade da piruvtoquinase e que esta inibição pode pode ser prevenida por alanina. Quanto à cistina, os estudos in vitro mostraram que este aminoácido inibe a atividade da piruvatoquinase por dois mecanismos distintos, um dos quais parece envolver os grupos tiólicos da enzima e que pode ser prevenido e revertido pela cisteamina. Os estudos cinéticos sugeriram que a piruvatoquinase possui um sítio de ligação para aminoácidos (e talvez para alguns derivados de aminoácidos, como o fenilpiruvato) regulando a atividade da enzima. Se a inibição da atividade da piruvatoquinase também ocorrer nos pacientes afetados pelas doenças estudadas, é possível que medidas tais como a suplementação dietética de alanina e de glicose para os pacientes com fenilcetonúria e hipertriptofanemia e de cisteamina para os pacientes com cistinose, sejam benéficas. Entretanto, mais estudos são necessários antes de considerar o uso de tais medidas para os pacientes.

Hippeastrum vittatum (L'Hér.) Herbert e hippeastrum striatum (Lam.) Moore : análise química e avaliação biológica dos alcalóides isolados

Este trabalho foi realizado com o objetivo de isolar e identificar os alcalóides presentes nas espécies H. vittatum e H. striatum, analisar a atividade antitumoral, inibidora da enzima acetilcolinesterase, antioxidante dos extratos e alcalóides obtidos, realizar ensaio de toxicidade para o alcalóide montanina, bem como observar sua atividade em pesquisa básica do comportamento em roedores e verificar comparativamente a modulação da montanina e da galantamina sobre a via de sinalização das proteínas quinases pRaf/pMEK/pERK/pCREB. Método: Fitoquímico: As partes aéreas e subterrâneas das espécies coletadas foram maceradas em etanol e processadas em extração ácido-base para a obtenção dos extratos diclorometano e n-BuOH. Os alcalóides isolados foram identificados com a utilização de métodos cromatográficos, espectrométricos e espectroscópicos. Testes in vitro: Atividade antitumoral: Os extratos e alcalóides obtidos foram avaliados em método in vitro, onde se aplicaram células tumorais biopsiadas de humanos. Inibição da enzima acetilcolinesterase: Os compostos isolados, montanina (Hv1 e Hv2), vitatina (Hv4), pancracina (Hv5) e Hv6 de H. vittatum e a galantamina foram testados em ensaio de bioautografia por cromatografia em camada delgada (CCD) com 1-naftil acetato. Atividade antioxidante: Os compostos anteriormente citados foram testados pelo método que utiliza o difenilpicrilhidrazol (DPPH) em CCD. Testes in vivo: Toxicidade da montanina (24 horas): A montanina foi administrada com doses de 10 a 100 mg/kg i.p. em camundongos e a toxicidade observada por 24 horas comparando-se aos grupos controle. A dose letal mediana foi calculada com método dos probitos. Avaliação da atividade central da montanina: Foram realizados experimentos com camundongos machos em Campo Aberto (CA), Nado Forçado (NF), Labirinto em Cruz Elevado (LCE), Indução do Sono por Pentobarbital (ISP) e sobre a consolidação da memória em ratos (esquiva inibitória passiva). Análise bioquímica da via das MAPKs: Aplicou-se metodologia in vitro em homogenatos (fatias hipocampais) tratados com os alcalóides montanina ou galantamina. A obtenção dos resultados ocorreu a partir da realização de eletroforese de alta voltagem e “Western Blot”. Resultados e Conclusões: A partir dos extratos de alcalóides totais de H. vittatum foram isoladas cinco substâncias: (a) Hv1 (montanina – 0,007%) isolado do extrato diclorometano de folhas, (b) Hv2 (montanina – 0,09%), (c) Hv3 (licorina 0,003%) e (d) Hv4 (vitatina – 0,0003%), isolados do extrato diclorometano de bulbos. Do extrato n-BuOH dos bulbos foram isolados o alcalóide Hv5 (pancracina – 0,0025%) e o composto Hv6 (0,0034%). Da espécie H. striatum foi isolado o alcalóide licorina (Hs3) e dois compostos não identificados (Hs1 e Hs3). O alcalóide vitatina demonstrou inibir moderadamente o crescimento das células tumorais com os valores de IC50 ≤ 29 g/ml. A montanina apresentou o maior efeito antiproliferativo entre os produtos testados. Os valores de IC50 foram menores que 1,0 g/ml para as linhagens testadas. Os extratos diclorometano e n-BuOH de H. vittatum foram considerados antiproliferativos para as células tumorais humanas empregadas, com valores de absorvância 25% menores que o controle. Para as atividades inibidoras da enzima acetilcolinesterase e antioxidante, somente o composto Hv6 apresentou ação. A dose letal mediana para a montanina em camundongos machos foi calculada em 64 mg/kg i.p. A montanina não alterou a locomoção e a atividade exploratória de camundongos quando administrada pela via intraperitoneal (i.p.) nas doses de 10 e 30 mg/kg (CA). Na avaliação da atividade central da montanina administrada por via i.p., observamos atividade ansiolítica (0,1; 1,0; 3,0 mg/kg – LCE), antidepressiva (3,0 mg/kg - NF) e tendência para atividade hipnótica (ISP). No paradigma de memória de esquiva inibitória passiva, a montanina não alterou significativamente o comportamento dos ratos wistar, na via de administração e nas doses testadas. Na investigação comparativa da modulação da via de sinalização das MAPKs (envolvidas com a memória) em fatias hipocampais tratadas (ratos), concluiu-se que a montanina e a galantamina aumentam a fosforilação (atividade) das proteínas testadas. Os resultados obtidos para a galantamina sugerem um possível mecanismo de ação que explique bioquimicamente uma de suas ações que contribuem para a melhora da memória em ratos na esquiva inibitória.

Efeito do protocolo de exercício sobre variáveis hematológicas e bioquímicas em eqüinos de salto

O presente estudo teve por objetivo avaliar as variações provocadas por diferentes protocolos de atividade física nos parâmetros hemato-bioquímicos de eqüinos de salto. Foram utilizados dezessete eqüinos atletas, de raças de hipismo, com idades variando entre 5 e 12 anos. Todos os animais fizeram parte de três grupos de exercício e um de repouso. Foram realizadas coletas de sangue venoso e verificação da freqüência cardíaca com os animais em repouso (grupo Controle) e imediatamente após a realização de três diferentes protocolos de exercício. Os animais foram submetidos a 20 e 40 minutos de exercício em esteira com inclinação de 0o a velocidade constante de 5 m/s (grupo Esteira), 40 minutos de trabalho montado sendo 10 minutos ao passo, 20 minutos de trote e 10 minutos de galope em pista plana de areia (grupo treinamento) e prova de salto à velocidade média de 350 m/min, altura dos obstáculos de 1,20 metros e extensão do percurso de 430 metros (grupo Prova). Os parâmetros hematológicos (número de eritrócitos, concentração de hemoglobina e contagem leucocitária), a freqüência cardíaca, dosagem das enzimas creatina quinase (CK), aspartato aminotransferase (AST), lactato desidrogenase (LDH) e fosfatase alcalina (FA), dosagem de sódio e potássio, bicarbonato, proteínas plasmáticas totais, uréia e creatinina foram analisados. Os valores obtidos foram comparados com os valores basais e entre os grupos de exercício. O exercício em Esteira provocou aumento significativo no percentual de hematócrito e concentração de creatinina. A concentração de glicose apresentou redução após 20 e 40 minutos de exercício. O grupo Treinamento revelou aumento no número de eritrócitos, aumento de hematócrito, proteínas totais, CK, LDH, FA, creatinina, potássio e redução nas concentrações de glicose. O grupo Prova apresentou contagem de eritrócitos superior aos demais grupos, assim como percentual de hematócrito, concentração de hemoglobina e proteínas plasmáticas totais. Nesse grupo, as dosagens de CK, LDH, FA, lactato, creatinina e potássio apresentaram valores significativamente superiores em relação ao grupo Controle. A freqüência cardíaca revelou aumento significativo após a realização da atividade física quando comparados com o grupo Controle e entre os grupos. As variações encontradas foram de amplitude maior no grupo Prova. O aumento da intensidade do exercício físico provoca alterações em alguns parâmetros hemato-bioquímicas em cavalos de salto. A contagem eritrocitária, o percentual de hematócrito, a concentração de proteínas plasmáticas, lactato, potássio, creatinina, CK e FA elevam-se com o aumento da intensidade do exercício. A contagem leucocitária, dosagem de AST, sódio, bicarbonato e uréia não sofreram influência da intensidade de exercício proposta nos protocolos. A concentração de glicose é reduzida pelo exercício desempenhado nos grupos treinamento e prova.