Caracterização dos neurônios envolvidos na ventilação pulmonar de Megalobulimus abbreviatus (Gastropoda: Pulmonata)

O uso de moluscos gastrópodes para estudos neurobiológicos é vantajoso porque seu sistema nervoso e comportamentos são intermediários em complexidade quando comparados a outros animais. Os padrões de atividade derivados do sistema nervoso central (SNC) são modulados por informações periféricas provenientes de vários quimio e mecanorreceptores, os quais desempenham funções importantes na manutenção da homeostase interna. Assim, juntos, elementos centrais e periféricos permitem ao animal modular seu comportamento respiratório de acordo com suas demandas metabólicas. O objetivo deste trabalho originou-se da necessidade da compreensão da atividade respiratória do caracol pulmonado terrestre Megalobulimus abbreviatus, da identificação dos neurônios do sistema nervoso central envolvidos no seu controle, bem como da organização da inervação de uma estrutura-chave envolvida no comportamento respiratório deste animal, o pneumóstoma. Realizou-se a identificação dos neurônios do SNC que controlam o pneumóstoma através de marcação retrógrada pelo nervo parietal posterior direito com cloreto de cobalto e biocitina; a descrição da morfologia e da histologia da região do pneumóstoma, assim como a análise da presença de monoaminas (método do ácido glioxílico), atividade acetilcolinesterásica (AChE, técnica de Karnovsky & Roots) e de imunorreatividade a FMRF-amida (imunoistoquímica) nesta região. Também foi realizada a investigação sobre uma provável relação entre o sistema dopaminérgico, serotoninérgico e peptidérgico (FMRF-amida) com os neurônios identificados por marcação retrógrada nos gânglios nervosos centrais, através da comparação entre os neurônios retrogradamente marcados com neurônios imunorreativos à tirosina hidroxilase (TH), serotonina (5-HT) e FMRF-amida. Neurônios retrogradamente marcados foram encontrados nos gânglios pedais, pleural direito, parietal direito e visceral. Encontrou-se na superfície do tegumento do pneumóstoma um epitélio constituído de uma única camada de células cilíndricas, com microvilosidades ou cílios como terminação apical, envolvido por uma camada muscular bem desenvolvida. Foi possível verificar que a organização da inervação na região do pneumóstoma está constituída de uma rede neural para suprir a camada muscular e ramos neurais mais finos que estão mais densamente distribuídos em um plexo na camada epitelial e subepitelial adjacente, onde corpos celulares neuronais foram identificados (catecolaminérgicos ou com atividade AChE). A análise do padrão de inervação do pneumóstoma, juntamente com os dados da comparação entre neurônios retrogradamente marcados e imunorreativos no SNC, permitiu concluir-se que o neuropeptídeo FMRF-amida parece ter uma grande importância na regulação motora da região do pneumóstoma, assim como a 5-HT, que provavelmente possui uma função motora ou modulatória nesta região, enquanto que a participação da dopamina no controle respiratório deve ser principalmente sensorial, responsável pelas informações provindas do tegumento do pneumóstoma.

Estudo da densidade dos espinhos dendríticos na região póstero-dorsal da amígdala medial de ratos intactos e orquiectomizados

A amígdala medial (AMe) é um dos núcleos superficiais do complexo amigdalóide que pode ser dividido de acordo com critérios citoarquitetônicos e hodológicos em 4 subnúcleos distintos: ântero-dorsal (AMeAD), ântero-ventral (AMeAV), póstero-ventral (AMePV) e póstero-dorsal (AMePD). Destes, a AMePD, dentre outras funções, está envolvida na regulação do comportamento sexual de roedores. Em ratos, este subnúcleo é uma estrutura sexualmente dimórfica, com ampla quantidade de receptores para hormônios gonadais e que se apresenta subdividida em três colunas celulares: medial (AMePDm), intermediária (AMePDi) e lateral (AMePDl). O presente trabalho teve como objetivos estudar a densidade de espinhos dendríticos na AMePDm e na AMePDl as quais, em ratos, estão relacionadas com os comportamentos de intromissão peniana e ejaculação, respectivamente. Também estudou-se os efeitos da castração com curta (8 dias) e longa (90 dias) duração na densidade dos espinhos dendríticos na AMePD. Todos os animais foram anestesiados e perfundidos, tiveram seus encéfalos seccionados em cortes coronais de 200 µm de espessura e submetidos à técnica de Golgi. Após, os espinhos foram desenhados ao longo dos primeiros 40 µm dendríticos com auxílio de uma câmara clara acoplada a microscópio óptico e tiveram sua densidade calculada. A análise estatística demonstrou que não há diferença significativa na densidade de espinhos dendríticos entre os neurônios da AMePDm e AMePDl quando comparadas entre si. Esses resultados sugerem que, embora funcionalmente diferentes, essas regiões parecem estar realizando contatos sinápticos em número similares. Ainda não está claro se estes espinhos são necessários para possibilitar que cada subregião contribua para um aspecto específico do comportamento sexual masculino. Por outro lado, a análise estatística também revelou que a castração por si só não é capaz de alterar a densidade de espinhos dendríticos nos neurônios da AMePD a curto prazo mas, por outro lado, que a castração de longa duração causou uma redução significativa na densidade de espinhos dendríticos em relação aos animais controle neste subnúcleo, evidenciando a ação da testosterona na manutenção da integridade morfológica a longo prazo nos neurônios da AMePD e sua importância para a plasticidade sináptica nesta região.

Investigação das ectonucleotidases de células musculares lisas vasculares : efeito dos hormonios tireoideanos e estradiol

Nucleotídeos extracelulares (ATP, ADP, AMP) e seu derivado adenosina são conhecidos sinalizadores do sistema cardiovascular podendo mediar vários processos fisiológicos entre eles a proliferação celular, agregação plaquetária, inflamação e o tônus vascular. Os níveis destas substâncias, localmente e na circulação sanguínea, são controlados pelas ecto-NTPDases em conjunto com a ecto-5’nucleotidase (ecto-5’-NT) que realizam a degradação completa do ATP até adenosina. Os hormônios tireoideanos tiroxina (T4) e triiodotironina (T3) e o hormônio esteróide sexual estradiol (E2) atuam ativamente no sistema vascular promovendo vasodilatação. Nosso objetivo foi investigar quais enzimas da família das NTPDases estão presente em células musculares lisas vasculares (CMLVs) e se a atividade destas enzimas pode ser influenciada pela ação desses hormônios, uma vez que seus substratos e produtos podem sinalizar processos de relaxamento/contração muscular. Para tanto, as CMLVs foram extraídas da artéria aorta de ratos Wistar adultos e cultivadas em meio de cultura DMEM. Após atingirem a confluência, as células foram tratadas com 50 nM de T3 ou T4 ou 1M de 17-estradiol por 72 horas. As atividades enzimáticas foram medidas pela liberação de fosfato inorgânico enquanto que a expressão das ectonucleotidases foi verificada por imunocitoquímica (proteína) e RT-PCR (RNAm). Os resultados deste trabalho mostram que as CMLVs expressam as NTPDases 1, 2, 3, 5 e 6 e a ecto-5’-NT, responsáveis pelo controle dos níveis de nucleotídeos e nucleosídeos extracelulares. O tratamento com os hormônios T3, T4 e E2 nestas células mostrou que a atividade da ecto-5’-NT foi aumentada pelos três hormônios. A análise do RT-PCR demonstrou que os tratamentos foram capazes de aumentar também a quantidade de RNAm da ecto-5’NT, indicando mecanismos de ação genômica dos hormônios estudados. Por outro lado, O tratamento com os hormônios tireoideos não alterou as atividades ATPásica e ADPásica, somente o estradiol foi capaz de aumentar a atividade ATPásica. Estes resultados também sugerem que, pela hidrólise aumentada do AMP, disponibilizem-se níveis maiores de adenosina, com importante potencial vasodilatador local. Entretanto, o fato de o estradiol ter aumentado a hidrólise de ATP, mas não a de ADP, nos permite pensar que o ADP, agregador plaquetário bem estabelecido, possa estar acumulando extracelularmente, contribuindo para o desenvolvimento de problemas circulatórios.

Influências ligadas ao sexo e a sazonalidade sobre a gliconeogênese renal em ratos submetidos ao jejum

A via gliconeogênica é uma via central no estudo dos processos biossintéticos celulares que, nos tecidos animais, leva à formação de glicose partindo de precursores não-carboidratos. Muitos estudos têm evidenciado que os rins aumentam a contribuição para a liberação de glicose na circulação durante períodos de jejum. Porém, são poucos os trabalhos que investigam este importante processo fisiológico em outras condições. Por isso, o objetivo deste trabalho foi avaliar as influências sazonais e ligadas ao sexo sobre a via gliconeogênica renal em animais submetidos ao jejum prolongado. Os rins de ratos foram excisados, fatiados e divididos em duas regiões, cortical e medular. Incubou-se estas amostras separadamente em solução fisiológica acrescida com 0,2 µCi de 14C-Ácido Lático ou 14C-Glicerol. A 14C-Glicose foi quantificada por meio de cromatografia em camada delgada e expressa em mmoles/g tecido/hora. Para avaliar a influência sazonal, os experimentos foram realizados em dois períodos do ano, no inverno e no verão e a atividade gliconeogênica demonstrada foi diferente entre as duas estações. No inverno, a gliconeogênese renal de ratos-controle foi significativamente menor do que no verão. Além disso, os animais submetidos a 48 horas e 72 horas de jejum apresentaram um decréscimo na gliconeogênese quando comparados ao grupo controle. Já durante um período maior de jejum, às 120 horas, a atividade gliconeogênica aumentou e foi semelhante entre as duas estações. Vários aspectos poderiam estar influenciando estas diferenças, tais como o metabolismo basal e a variação hormonal e enzimática sobre a via. Neste trabalho, também verificou-se que a gliconeogênese renal apresentou diferenças entre ratos machos e fêmeas. Os resultados demonstraram que a formação de glicose a partir de lactato marcado nas fêmeas foi significativamente maior do que nos machos. Provavelmente, estas diferenças no perfil gliconeogênico entre ratos machos e fêmeas poderiam ser atribuídas em grande parte a variação hormonal e ao conjunto de fatores interligados a esta variação. Assim, este trabalho contribuiu para o esclarecimento de algumas questões ainda não investigadas na literatura, como a importância da variação sazonal e ligada ao sexo sobre a via gliconeogênica nos rins de ratos submetidos ao jejum.

Extração de mercúrio de solos e sedimentos auxiliada por ultra-som

Desenvolveu-se uma metodologia que dispensa a dissolução completa da amostra para determinar Hg em solos, sedimentos fluvial e marinho. O Hg é quantitativamente extraído do sedimento marinho usando-se HNO3 30% (v/v), ultra-som (120 s, 70 W) e granulometria ≤ 120 µm. Condições similares são eficientes para sedimento fluvial e solo, exceto o tempo de sonicação (180 s) e a adição de KCl 0,15% (m/v). As suspensões sonicadas são centrifugadas e o Hg é determinado no sobrenadante por FI-CV AAS. A validação da metodologia foi feita com CRMs: PACS-2, MESS-3 (NRCC); Buffalo River (NIST 8704), Montana Soil (NIST 2710) e RS-3 (não certificada). Os parâmetros de mérito do método são: massa característica de 25 pg; LD (3s) de 0,2 µg l–1; LQ (10s) de 0,012 µg g–1 (800 µl de solução obtida de 1 g de amostra em 20 ml de suspensão). Aplicou-se a metodologia à análise de amostras reais (solo, sedimentos fluvial e marinho), as quais também foram preparadas com digestão ácida (85 °C durante 3 h) em mistura oxidante (K2S2O8 1 a 2% (m/v) e HNO3 30% (v/v)). Concentrações concordantes foram obtidas. Utilizou-se calibração externa e, quando necessário, ajuste de matriz com KCl ou K2S2O8. Para investigar a extração de Hg orgânico utilizando ultra-som, adicionou-se MeHg aos CRMs. Aproximadamente 5% do MeHg adicionado transformam-se em Hg2+ pelo método proposto, enquanto que chega a 100% quando a amostra é digerida. Assim, propõe-se uma especiação química semiquantitativa entre Hg inorgânico e orgânico, pois o Hg orgânico pode ser obtido pela diferença entre Hg total (determinado pela digestão) e Hg inorgânico (determinado pelo método proposto).

Desenvolvimento tecnológico e micropartículas nanorrevestidas : caracterização físico-química e biológica

Micropartículas nanorrevestidas (MP) foram preparadas através da secagem por aspersão (spray-drying), empregando-se suspensões poliméricas nanoestruturadas como material de revestimento (nanoesferas – NS, nanocápsulas – NC ou nanodispersão – ND). Foram realizados estudos utilizando-se o diclofenaco, tanto na sua forma hidrofílica (diclofenaco sódico), hidrofóbica (diclofenaco ácido) e a dexametasona como fármacos-modelo e o Eudragit S100®, como polímero. O trabalho foi delineado buscando-se o desenvolvimento de metodologias de preparação, o estudo dos fatores que influenciam o processo de revestimento, o conhecimento das características físico-químicas das MP e a avaliação das suas vantagens biológicas. As suspensões poliméricas (NC e NS) foram preparadas através da técnica da nanoprecipitação. As MP foram preparadas utilizando-se diferentes metodologias, de acordo com a hidrofobia do fármaco, envolvendo a combinação de técnicas de evaporação do solvente e secagem por aspersão. A influência dos fatores de secagem (fluxo de alimentação e temperatura de entrada) sobre as características das MP foi avaliada através de um delineamento fatorial 32. A caracterização físico-química foi realizada determinando-se o rendimento do processo, taxa de encapsulação, umidade, tamanho de partícula (nano e micropartículas), área superficial e volume de poros, além das análises morfológicas através de microscopia óptica, eletrônica de varredura (MEV) e microscopia de força atômica (MFA) e análises por difração de raios-X. Além disso, foram avaliados os perfis de liberação do fármaco a partir destas MP (pH 1,2; 5,0 e 7,4), bem como a sua interação (transporte do fármaco e citotoxicidade) com células Caco-2. A vantagem biológica dos sistemas foi determinada pela avaliação do efeito protetor sobre a mucosa gastrintestinal frente aos efeitos tóxicos do diclofenaco. Através do delineamento fatorial foi possível estabelecer os parâmetros de secagem para a obtenção de MP com boas características de rendimento, taxa de encapsulação e umidade (fluxo de alimentação: 3,0 e 4,5 ml/min, para MP obtidas a partir de NC e NS, respectivamente; e temperatura de entrada: 170 C, para ambas). As MP apresentaram rendimentos entre 40 e 80% e taxas de encapsulação entre 70 e 115 %, dependendo do tipo de revestimento nanoestruturado (NS, NC ou ND) e do fármaco empregado (diclofenaco ácido, diclofenaco sódico ou dexametasona) Todas as formulações apresentaram um teor de umidade menor que 3 %. As análises através de MEV demonstraram a presença de nanoestruturas adsorvidas à superfície das MP, indepentemente da formulação estudada e com tamanhos de partículas diretamente relacionados ao tamanho das nanopartículas da suspensão original (170-200 nm para NC e 60-70 nm para NS). A observação morfológica através de MFA também permitiu a visualização destas nanoestruturas na superfície das MP. Essa observação foi associada à redução nas áreas superficias das MP (40-50 m2.g-1 e 115-135 m2.g-1 para MP revestidas a partir de suspensões de NC ou NS, respectivamente) em relação ao núcleo não revestido (150-160 m2.g-1). Os resultados de liberação in vitro do fármaco a partir das MP demonstraram uma modificação da sua liberação, de acordo com o tipo de material nanoestruturado empregado, a natureza do fármaco e a presença de um plastificante (triacetina ou poligol 6000). A análise por difração de raios-X mostrou que o fármaco encontra-se na forma cristalina em praticamente todas as formulações. A vantagem biológica foi estudada em ratos e demonstrada pela redução na toxicidade gastrintestinal do diclofenaco apresentada pelas MP revestidas a partir de NC ou ND (índices lesionais totais: 24,20 e 29,89, respectivamente) em relação a uma solução aquosa do fármaco (índice lesional total: 156,11). Os estudos de interação das MP contendo dexametasona com as células Caco-2 demonstraram a sua potencialidade em modificar a absorção do fármaco em relação a uma solução aquosa do fármaco, sem apresentarem citotoxicidade sobre esta linhagem celular. Além disso, o estudo demonstrou a potencialidade do emprego deste modelo in vitro para prever a liberação do fármaco a partir de sistemas microparticulados. Assim, o conjunto destes estudos mostra que as micropartículas nanorrevestidas apresentam-se como uma nova aplicação dos sistemas nanoestruturados e como uma nova estratégia na obtenção de sistemas micro e multiparticulados de administração de fármacos.

Inosina extracelular como intermediária na silnalização do TNF-alfa em células de sertóli em cultura

As purinas extracelulares ATP e adenosina têm sido extensivamente estudadas em diferentes modelos e tipos celulares na modulação de várias respostas fisiológicas e patológicas. No entanto, a inosina extracelular, produto da degradação da adenosina pela Adenosina Deaminase (ADA), foi considerada por muito tempo um simples metabólito inativo. Recentemente, diversos trabalho têm demonstrado que este nucleosídeo possui importante papel na regulação de inúmeros processos. As células de Sertóli são as células somáticas dos túbulos seminíferos, e possuem fundamental importância na espermatogênese. Estas células, expressam diferentes purinoreceptores, estando estes envolvidos na regulação de diversas funções destas células relacionadas ao controle do desenvolvimento das células germinativas. No testículo, o TNF-α é produzido pelas espermátides redondas e pelos macrófagos ativados presentes no espaço intersticial. As células de Sertóli expressam os dois receptores descritos para TNF-α, TNF-RI (p55) e TNF-RII (p75), e diversos trabalhos tem descrito a modulação de diferentes funções destas células por esta citocina, incluindo a modulação da produção de NO e da fosforilação das MAPKs. Recentemente, foi descrita a modulação purinérgica da sinalização por TNF-α, bem como, a atividade ATPásica do receptor TNF-R1. Assim, nesta dissertação, foi estudado o efeito do TNF-α nos níveis das purinas extracelulares, além da possível participação purinérgica na sinalização desta citocina, em células de Sertóli em cultura. O tratamento destas células com TNF-α leva a um rápido aumento (5minutos) da concentração extracelular da inosina, que se prolonga até seis horas de incubação, sem alterar a concentração dos demais nucleotídeos e seus metabólitos. A inosina modula a produção de NO e a fosforilação das MAPKs ERK½ e p38 em células de Sertóli em cultura, aparentemente, através de diferentes mecanismos, sendo o primeiro efeito independente do receptor para adenosina A1 e o segundo efeito dependente da ativação deste receptor. Além disso, a inosina extracelular está envolvida na modulação da produção de NO e da fosforilação da MAPK ERK½ em células de Sertóli em cultura pelo TNF-α. A inibição do acúmulo de inosina estimulado pelo TNF-α através da incubação com um inibidor da adenosina deaminase cancela o aumento da produção de NO estimulada por esta citocina. Além disso, o bloqueio do receptor para adenosina A1 por antagonistas específicos impede o aumento na fosforilação da ERK½ estimulada por esta citocina. Assim, nesta dissertação, é descrito um papel intermediário da inosina extracelular na sinalização do TNF-α em células de Sertóli em cultura.

Estudos sobre a ação de leucócitos no endométrio de éguas.

As endometrites bacterianas são uma das principais causas de infertilidade na égua. Entre os tratamentos utilizados nesta patologia, estão as infusões uterinas de plasma homólogo acrescido de leucócitos e a infusão de leucócitos heterólogos criopreservados. O presente trabalho teve por objetivo realizar testes in vivo e in vitro, que foram descritos em dois artigos. No primeiro artigo, objetivou-se avaliar in vitro a quimiotaxia dos leucócitos eqüinos em relação a diferentes quimioatraentes, bem como sua vitalidade e produção de radicais livres de oxigênio (ROS) pós-descongelamento. No experimento 1, testou-se dextrose em concentrações de 0, 1, 2 e 6%, acrescida ou não de interleucina-8 (IL-8), como quimioatraente para leucócitos eqüinos suspensos em salina fosfatada tamponada (PBS) ou em R3F; no experimento 2, testou-se plasma homólogo ou heterólogo, a 3% (com ou sem IL-8), 10, 30, 60 e 90%, como quimioatraente; no experimento 3, foi testada a quimiotaxia de leucócitos íntegros em relação a diferentes quantidades de leucócitos lisados. O experimento 4 avaliou a vitalidade e a geração de ROS pelos leucócitos após o descongelamento, comparando quatro graus de diluição em NaCl e PBS. Concluiu-se que a dextrose não apresenta bom efeito quimioatraente para leucócitos eqüinos. Dentre as concentrações de plasma utilizadas, concentrações de plasma homólogo entre 10% e 60% apresentam bom efeito quimiotático. Já o plasma heterólogo apresentou boa atração de leucócitos quando em concentrações de 10% e de 30% Na concentração de 10x106/mL, os leucócitos lisados foram capazes de atrair leucócitos em proporção semelhante à da IL-8. Com relação aos testes-pós-descongelamento, células ressuspendidas em PBS ou NaCl apresentam vitalidade e geração de radicais livres de oxigênio semelhantes, quando incubados por até 15 minutos. No segundo artigo, realizaram-se testes in vivo compararando cinco tratamentos em éguas, em estro, experimentalmente infectadas com Streptococcus equi subsp.zooepidemicus. Foram utilizadas 25 éguas, 20 consideradas resistentes, e 5 éguas susceptíveis à endometrite. Após 24 horas, os animais foram submetidos a exame clínico, bacteriológico e citológico. Com a presença de quadro clínico de endometrite, as éguas eram submetidas a um dos seguintes tratamentos: 1-Infusão de 120mL de plasma homológo com de leucócitos frescos; 2-– Infusão de 4 mL contendo 800 x 106 leucócitos íntegros, congelados; 3-Leucócitos lisados - Infusão de 4 mL contendo 800 x 106 leucócitos lisados; 4- IL-8- Infusão de 4 mL contendo 25 ng/mL de IL-8 congelada; 5-Controle – Infusão de 4 mL de meio R3F congelado. Os exames clínico, bacteriológico e citológico foram realizados diariamente até o sétimo dia pós-infecção, ou até a eliminação da bactéria, ou até a ausência de neutrófilos no esfregaço citológico. Após os exames, as éguas receberam o tratamento designado, sendo estes realizados diariamente até a ausência de crescimento bacteriano no exame microbiológico ou por, no máximo, quatro dias. No sétimo dia, todas as éguas foram tratadas com infusão intra-uterina de 5.000.000 UI de penicilina G potássica cristalina. Após o término de um tratamento, aguardava-se cerca de sete dias para a reinfecção, num outro ciclo, quando um outro tratamento era aplicados. Todas as éguas foram submetidas a todos os tratamentos, perfazendo um total de 125 infecções experimentais num delineamento experimental do tipo Quadrado Latino. Não se observaram diferenças significativas no tempo de eliminação bacteriana nas éguas resistentes. Entretanto, nas éguas susceptíveis, observou-se uma cura bacteriana mais rápida quando as éguas foram tratadas com leucócitos frescos, leucócitos congelados e leucócitos lisados, em relação às tratadas com IL-8 e as do grupo controle. Concluiu-se que o efeito bactericida dos leucócitos viáveis ou lisados, associados ou não à presença de fatores de opsonização do plasma, foi o responsável pela cura bacteriológica e que o efeito quimioatraente de neutrófilos, plasma, restos celulares e IL-8 não influiu no tempo de eliminação bacteriana.

Efeito da administração aguda e crônica de desidroepiandrosterona sobre o limiar nociceptivo de rãs Rana catesbeiana adultas

Em pacientes portadores de fibromialgia, a administração de doses farmacológicas de DHEA ocasionou redução da sensação de dor muscular e fadiga, o que permitiu inferir seu envolvimento na modulação da percepção dolorosa. É sabido que a DHEA pode ser convertida, tanto perifericamente como no SNC, em sua forma sulfatada (DHEAS) por ação de enzimas sulfotransferases, tendo esta papel na modulação da nocicepção. Outro hormônio esteróide com ação sobre a nocicepção é a progesterona, cuja administração resultou em efeitos anestésicos e sedativos. A maioria destes resultados foram obtidos em mamíferos e humanos. Todavia, um estudo recente demonstrou que o tecido encefálico de rã foi capaz de sintetizar esteróides a partir de colesterol, sendo este processo de biossíntese similar àquele descrito em mamíferos. Deste modo, o presente estudo utilizou a rã Rana catesbeiana, adulta, macho, para determinar os efeitos da administração aguda (1,0, 2,0 e 10,0 mg/kg) e crônica (2,0 mg/kg) de DHEA, DHEAS e progesterona sobre o limiar nociceptivo das mesmas. Este limiar foi determinado pela utilização do teste químico do ácido acético, o qual foi realizado 2 horas antes da administração das soluções e após 2, 6 e 24 horas nos estudos de tratamento agudo e 48 horas após o término da última injeção nos estudos crônicos, sendo que nestes as rãs receberam 6 injeções subcutâneas, havendo entre cada administração um intervalo de 72 horas. Foram utilizados 3 grupos: controle, veículos e tratados. No tratamento agudo, as doses de 1,0 e 2,0 mg/kg de DHEA, DHEAS e progesterona não ocasionaram modificações estatisticamente significativas no limiar nociceptivo das rãs. Já a dose de 10,0 mg/kg de DHEA e DHEAS induziu um acréscimo significativo no limiar nociceptivo destes animais. Esta alteração não foi observada nas rãs tratadas com progesterona nesta dose. Entretanto, a administração crônica de DHEA, DHEAS e progesterona, provocou aumento estatisticamente significativo no limiar nociceptivo das rãs. A interrupção da administração de DHEA por 05 dias resultou no retorno do limiar nociceptivo a valores semelhantes àqueles obtidos antes das injeções subcutâneas de DHEA. A repetição deste tratamento por mais 07 dias ocasionou um novo aumento no limiar nociceptivo das rãs. Estes resultados sugerem que o efeito antinociceptivo destes esteróides apareceram precocemente na evolução dos vertebrados, estando ainda presente em humanos. Assim, as rãs, constituem modelos experimentais que poderão contribuir para o esclarecimento dos mecanismos celulares de ação da DHEA, da DHEAS e da progesterona sobre a nocicepção, tema ainda muito especulativo na neurociência.

Reciclagem de cobre de sucatas de placas de circuito impresso

O crescimento constante na geração de resíduos sólidos em todo o mundo tem estimulado estudos para os mais variados tipos de resíduos. As sucatas eletrônicas fazem parte deste universo de materiais obsoletos e/ou defeituosos que necessitam ser dispostos de maneira mais adequada ou então reciclados. Neste trabalho foram estudadas as Placas de Circuito Impresso que fazem parte das sucatas eletrônicas e que são encontradas em quase todos os equipamentos eletro-eletrônicos (computadores, televisores, VCR´s, DVD´s, telefones celulares, impressoras, etc.). Para realizar esse estudo foram coletadas placas de circuito impresso (PCI) obsoletas ou defeituosas de computadores pessoais que são atualmente a maior fonte deste tipo de resíduo. As PCI são compostas de uma maneira geral de polímeros, cerâmicos e metais, o que dificulta o seu processamento. Por outro lado a presença de metais base (como cobre) e metais preciosos estimulam estudos quanto a sua reciclagem. Também a presença de metais pesados como Pb e Cd, que tornam as placas resíduos perigosos, demonstram a necessidade de pesquisar soluções para este tipo de resíduo, a fim de que possam ser dispostos adequadamente, sem prejudicar o meio ambiente. Na primeira etapa deste trabalho foi utilizado processamento mecânico, como moagem, separação granulométrica, separação magnética e separação eletrostática para obter uma fração concentrada em metais (principalmente Cu, Pb e Sn) e uma outra fração contendo polímeros e cerâmicos. Ao final deste processo foi possível obter nas frações concentradas em metais uma concentração média de cobre de 50%. Na segunda etapa a fração concentrada em metais foi dissolvida com ácidos e enviada para uma eletro-obtenção a fim de recuperar os metais separadamente, neste primeiro momento o cobre. Por eletro-obtenção foram obtidos cátodos com teores de cobre acima de 96% Os resultados obtidos demonstram a viabilidade técnica de se recuperar o cobre utilizando processamento mecânico seguido de uma técnica eletrometalúrgica.

Modelos de simulação espacial de efeitos de pastejo em vegetação campestre

O principal objetivo da tese foi desenvolver um modelo matemático computacional espacialmente explícito, de autômatos celulares (CA), capaz de simular a dinâmica de vegetação campestre sob pastejo, descrita por tipos funcionais de plantas (PFTs), ao invés de espécies. Com dados obtidos a campo, utilizou-se um método recursivo de identificação politética de PFTs a partir de atributos morfológicos das plantas, de forma a expressar máxima correlação com diversidade de espécies. A alternância entre condições experimentais de exposição e exclusão de pastejo permitiu produzir variação em padrões espaciais e temporais da composição da vegetação descrita por esses PFTs. A seguir buscou-se modelar a dinâmica da vegetação. Assumiu-se que a dinâmica da vegetação, embora complexa, pudesse ser simulada a partir de mecanismos relativamente simples incorporados a um modelo CA formado por uma grade de células (comunidades). Cada célula tem uma dada composição de PFTs a qual se altera a cada passo no tempo conforme a composição da própria célula e da vizinhança e matrizes de transição determinadas empiricamente com os dados experimentais. A dinâmica simulada da composição de comunidades excluídas do pastejo mostrou determinismo no sentido de um PFT único, característico daquelas comunidades. A mesma tendência não foi observada nas simulações de comunidades sempre pastejadas. Os resultados indicam uma razoável concordância entre a dinâmica simulada e real, para as comunidades excluídas; e uma discordância para as comunidades sempre pastejadas. Sugere-se que diferenças no arranjo espacial inicial das comunidades motivam falhas do modelo sob pastejo. O Institut National de la Recherche Agronomique (INRA), na França, vem desenvolvendo um modelo simulador multi-agente espacializado como objetivo de representar realisticamente o manejo da vegetação campestre natural sob diferentes regimes de pastejo. Ele foi concebido como uma ferramenta de pesquisa para explorar o comportamento animal em pastagens heterogêneas Nesse modelo implícito e determinístico, uma definição funcional de três diferentes comunidades vegetais foi introduzida objetivando simular a dinâmica de pastagens multi-espécies. Isto foi feito pela intercambio de parâmetros do modelo com atributos funcionais da comunidade. Do ponto vista conceptual o modelo apresentou boa resposta e parece adequado para simular a dinâmica de uma vegetação campestre por atributos funcionais. O modelo apresentou um bom ajuste aos dados experimentais para alto nível de utilização, mas não tão bom para médio e baixo nível de pastejo, ou seja, comunidades vegetais mais heterogêneas. Reforça-se a idéia de que mais modelos que levem em conta a estrutura horizontal da vegetação são necessários.

Caracterização molecular dos componentes do veneno de lonomia obliqua : genes expressos e princípios ativos envolvidos nos distúrbios da coagulação e da fibrinólise

A hemostasia é um processo multifuncional, complexo e finamente regulado que envolve diversos componentes celulares e moleculares, incluindo plaquetas, parede vascular, cascata da coagulação sangüínea e fibrinólise. O desequilíbrio desses componentes pode desencadear condições patológicas, tais como hemorragias, hipercoagulopatias e a conseqüente trombose vascular. O descobrimento de novos princípios ativos e o desenvolvimento de drogas como instrumentos de intervenção antitrombótica constituem estratégias de eleição para a prevenção e o tratamento do quadro trombo-embólico. Muitos desses princípios ativos são obtidos de fontes naturais, incluindo os conhecidos anti-hemostáticos presentes em venenos de serpentes e na saliva de artrópodos hematófagos. Por afetarem o sistema hemostático humano, essas moléculas são alvo de estudos para o desenvolvimento de anti-venenos, testes laboratoriais e novas drogas terapêuticas. As lagartas do gênero Lonomia são conhecidas por produzirem proteínas tóxicas que estão associadas a uma severa síndrome hemorrágica em humanos, cujo quadro clínico é caracterizado por distúrbios da coagulação, insuficiência renal aguda, hematúria, sangramentos, dentre outros sintomas. O veneno é constituído por diversos princípios ativos, incluindo atividades pró-coagulantes e fibrinolíticas Apesar da importância social e científica desses envenenamentos e do conhecimento sobre a natureza dessas toxinas, as informações sobre as características moleculares do veneno ainda são escassas, o que limita o melhor entendimento das bases moleculares da síndrome hemorrágica e o desenvolvimento de um diagnóstico e de um tratamento mais adequados para os pacientes. O presente trabalho teve por objetivo analisar as proteínas mais abundantes e os genes expressos em maior proporção na taturana L. obliqua durante a fase larval (fase em que ocorrem os acidentes), visando identificar moléculas potencialmente envolvidas no envenenamento. As etapas realizadas foram: análise dos princípios ativos presentes em tecidos utilizados para a construção de bibliotecas de cDNA, seqüenciamento em massa das bibliotecas e análise dos transcritos utilizando ferramentas de bioinformática. Mais de mil seqüências de cDNA foram obtidas e agrupadas gerando um catálogo com informações sobre os transcritos encontrados, incluindo seqüências completas de cDNAs que codificam para proteínas provavelmente envolvidas no envenenamento, além de novas seqüências de função biológica desconhecida O conteúdo protéico do veneno foi analisado por SDS-PAGE seguido por seqüenciamento da região N-terminal das proteínas mais abundantes, possibilitando a correlação entre o cDNA e a proteína por ele codificada. As seqüências completas de cDNA foram enviadas para o GenBank (NCBI/NIH, EUA) e os resultado estão disponíveis em um sítio eletrônico específico no NCBI: http://www.ncbi.nih.gov/projects/omes. O cDNA mais abundante da lagarta, que codifica para uma lipocalina, foi clonado e obteve-se a proteína recombinante. Demonstramos que essa lipocalina liga o grupamento heme e participa da oxidação acoplada desse ligante, levando à formação de biliverdina γ, sugerindo uma nova função para as proteínas ligadoras de bilina em insetos. Os resultados obtidos colaboram para o maior entendimento das bases moleculares do envenenamento por L. obliqua, além de apontarem moléculas candidatas para o desenvolvimento de kits de diagnóstico para o envenenamento com Lonomia e para a melhora na especificidade do soro anti-lonômico, bem como para estudos mais aprofundados dos processos hemostáticos.

Modelagem de motoristas e cenários de escolha de rota em simulações de tráfego veicular urbano

Este trabalho visa apresentar uma metodologia para modelagem de motoristas a serem utilizados em simulações de tráfego veicular discreto. Além da metodologia, será apresentada uma plataforma para implementação de motoristas, chamada DRIVER-DFW, baseada neste conceito. Inicialmente, serão apresentados alguns modelos de movimentação de veículos baseados no modelo de autômato celular Nagel–Schreckenberg. O modelo básico será apresentado juntamente com alguns de seus aperfeiçoamentos, que são os modelos utilizados no simulador ITSUMO, que por sua vez é utilizado como base para o trabalho. Além dos modelos de autômato celular, serão apresentados modelos de planejamento de rota, que se utilizam de várias heurísticas para a tomada de decisão dos motoristas. Destes, selecionou-se um para implementação e demonstração. Mostradas as etapas para composição do modelo completo de motorista, isto é, movimentação e planejamento, será apresentada a plataforma para implementação de motoristas desenvolvida neste trabalho. Esta separação é a base da plataforma DRIVER-DFW que é discutida com mais detalhes para auxiliar a compreensão do seu funcionamento. Além disso, é mostrado como a metodologia é aplicada na plataforma para implementação de motoristas DRIVER-DFW. Por fim, conclui-se que este trabalho apresenta uma alternativa bastante atraente para a implementação de modelos de motoristas, com uma metodologia e uma plataforma de desenvolvimento. Também são apresentadas as diretrizes para dar prosseguimento a este.

Efeito dos antiinflamatórios não-esteróides sobre a proliferação celular e atividade das ecto-nucleotidases em linhagens de gliomas

Gliomas são os mais comuns e devastadores tumores primários do sistema nervoso central. Nucleotídeos extracelulares estão envolvidos em diversos processos patofisiológicos no sistema nervoso central. Os níveis dos nucleotídeos da adenina podem ser controlados por hidrólise através da ação de vários membros da família das ectonucleotidases. O AMP formado pelas NTPDases é hidrolizado até adenosina por ação da ecto-5’-nucleotidase (ecto-5’-NT). A enzima ciclooxigenase (COX) está surgindo como um novo alvo na prevenção e no tratamento do câncer, sendo que substanciais evidências epidemiológicas, experimentais e clínicas sugerem que os antiinflamatórios não-esteróides (AINEs) possuem propriedades anticâncer. Vários estudos têm demonstrado que certos AINEs causam efeitos antiproliferativos independentes da atividade da COX. Assim, o objetivo deste estudo foi avaliar o efeito dos AINEs em linhagens celulares de gliomas e os possíveis mecanismos envolvidos neste efeito e avaliar a influência da indometacina na cascata de enzimas que catalisam a interconversão dos nucleotídeos. Indometacina, acetaminofeno, sulfeto de sulindaco e NS-398 induziram uma inibição da proliferação celular de modo tempo e dose dependente. Indometacina causou uma redução significativa na viabilidade celular. Nenhum dos AINEs testados induziu ativação de caspase 3/7. O tratamento com indometacina diminuiu a percentagem de células na fase S, com um aumento relativo nas fases G0/G1 e/ou G2/M, indicando uma parada na progressão do ciclo celular. A exposição de células de glioma à indometacina causou um aumento nas hidrólises de AMP e ATP. Um aumento significativo nos níveis de mRNA da ecto-5’-NT/CD73 foi observado após tratamento com indometacina Estes resultados suportam a hipótese que o aumento na atividade da ecto-5’-NT está relacionado com a superexpressão do mRNA com possíveis alterações no catabolismo das purinas extracelulares. Os dados sugerem ainda que o receptor A3 e a enzima ecto-5’-NT estão envolvidos no efeito antiproliferativo da indometacina nas linhagens celulares de gliomas. Considerando que a via das ectonucleotidases pode representar um importante mecanismo associado com a transformação maligna dos gliomas, os AINEs podem ser clinicamente importantes na intervenção farmacológica deste tipo de tumor.

Detecção de cinco novas mutações em pacientes brasileiros com gangliosidose GM1

A Gangliosidose GM1 é um Erro Inato do Metabolismo (EIM) causado pela deficiência da enzima B-galactosidase ácida. Essa doença é caracterizada pelo acúmulo de metabólitos não degradados, principalmente gangliosídeo GM1, nos lisossomos de vários tipos celulares. Baseado na idade de início e na atividade residual da enzima, a Gangliosidose GM1 é classificada em três diferentes tipos: infantil, juvenil e adulto. O gene da B-galactosidase ácida (GLB1, GeneBank M27507) está situado no cromossomo 3 e possui mais de 60 kb, contendo 16 exons. Cerca de 50 mutações associadas à doença estão descritas na literatura. No sul do Brasil, há uma alta freqüência dessa doença (1:17.000 nascidos vivos). Neste trabalho, vinte pacientes diagnosticados no Hospital de Clínicas de Porto Alegre (Brasil) tiveram o gene GLB1 investigado por SSCP (Single Strand Conformational Polymorphism) usando DNA extraído de sangue periférico. Através desta triagem foram encontradas 52 alterações de mobilidade do DNA, indicando a presença de mutações. As amostras relativas aos exons 2 e 15 foram submetidas a sequenciamento direto com seqüenciador ABI31O(Applied Biosystens) utilizado kit BigDye 3.1. Cinco novas mutações no gene GLB1 (F63Y, R38G, Y36S, Y64F e R59C) e duas mutações já descritas (R59H e 1622-1627insG) foram encontradas. Este trabalho possibilitou a genotipagem completa de 6 pacientes e parcial de 5, e direcionou a investigação de mutações, contribuindo diretamente no diagnóstico da enfermidade e permitindo a realização de estudos de correlação genótipo/fenótipo destes pacientes.